ASSESSMENT OF CORRECTING ARGININE AND CARNITINE EFFECTS ON ACTIVITY AND DISTRIBUTION OF SKELETAL AND SMOOTH MUSCLE L, H CATHEPSINS IN MARKED HYPERHOMOCYSTEINEMIA

Full Text

Введение В современных источниках гипергомоцистеинемию в основном рассматривают как риск развития тромбоза артерий мелкого и среднего калибра, гломерулярной дисфункции и склероза, акушерской, неврологической патологии [2, 8]; при этом практически не описывается токсическое действие гомоцистеина на клетки других органов. Общеизвестным фактом является то, что избыточные количества метаболита метионинового обмена гомоцистеина при переходе из клеток во внеклеточное пространство и далее в кровь способны воздействовать на эндотелий сосудов. Это воздействие обусловлено образованием супероксида кислорода и перекиси водорода [8], инициирующих перекисное окисление липидов, что приводит к образованию окисленных липопротеидов плазмы крови и повреждению эндотелия [10]. Помимо этого, гомоцистеин принимает участие в формировании дисульфидов, приводящих к дополнительному образованию свободных радикалов и развитию оксидативного стресса. Катепсины L, H имеют широкую тканевую локализацию и участвуют в деградации соединительной ткани, обменных процессах, клеточной дифференцировке, опухолевой прогрессии. Имеются данные о повышении активности катепсина L при аневризме аорты в пристеночном тромбе [15] и его взаимодействия с белками эндотелия, что изменяет эластичность и механическую прочность артерий. Описана способность катепсинов к секреции во внеклеточное пространство и стимуляции клеточного апоптоза [13, 14]. В современных источниках описано влияние аргинина на концентрацию маркеров свободнорадикального повреждения, снижение содержания в сыворотке крови гомоцистеина [16], снижение секреции катепсина B в скелетной и гладкомышечной мускулатуре [1]. Помимо этого, аргинин оказывает иммуномодулирующее воздействие благодаря стимулированию активности лимфоцитов, продукции интерлейкина-2 [7]. Карнитин, за счет стимулирования деятельности митохондрий, улучшает энергетический обмен клетки, а также, обладая способностью угнетать активность каспаз [3], снижает риск развития клеточного апоптоза, в осуществлении которого катепсинам отводится не последняя роль. Исходя из вышеизложенного нами была поставлена задача оценить активность и распределение катепсинов L, H скелетной и гладкой мышц при тяжелой форме гомоцистеинемии и при коррекции ее L-аргинином и карнитином. Материалы и методы исследования Материалом для исследования послужили 96 гомогенизированных образцов мышечных тканей (48 образцов большеберцовой мышцы и 48 образцов стенки грудной аорты) белых конвекциональных крыс-самцов линии Wistar массой 280-320 г, содержавшихся в типовых условиях вивария и разделенных на шесть групп - 3 контрольных (по 8 животных в каждой) и 3 экспериментальных (по 8 животных в каждой) в соответствии с исследуемыми образцами скелетной мышцы и стенки аорты соответственно. Моделирование тяжелой формы гипергомоцистеинемии осуществляли путем ежедневного внутрижелудочного введения 2 раза в сутки суспензии метионина в дозе 1,5 г на 1 килограмм массы тела животного в течение 21 дня. В своем составе суспензия содержала (по массе) 25 % метионина, 65 % 1%-ного водного раствора крахмала, 10 % твина 80. Вместо воды животные получали 1%-ный раствор метионина [4]. В качестве контроля использовали группу животных (n = 8), получавших в течение 21 дня суспензию, не содержащую метионин (состав по массе: 10 % твина-80, 1 % крахмала, 89 % воды), - группа контроля 1. Для изучения эффектов аргинина на фоне выраженной гипергомоцистеинемии вводили аргинин per os 1 раз в сутки в дозе 500 мг/кг в 0,9%-ном растворе NaCl в течение 10 суток [6] параллельно с введением метионина по схеме, описанной выше (с 12-е по 21-е сутки введения метионина). Животным контрольной группы (n = 8) осуществляли введение аргинина per os 1 раз в сутки в дозе 500 мг/кг в 0,9%-ном растворе NaCl в течение 10 суток параллельно с введением суспензии, не содержащей метионин, по схеме, описанной выше, - группа контроля 2. Влияние карнитина изучали в экспериментальной группе животных, получавших карнитина хлорид (производство ФГУ «РКНПК» Минздрава России - ЭПМБП) в дозе 300 мг/кг внутрибрюшинно в течение 21 дня [12] параллельно с введением метионина по схеме, описанной выше. Контрольную группу составили 8 животных, получавших карнитина хлорид в дозе 300 мг/кг внутрибрюшинно в течение 21 дня параллельно с введением суспензии, не содержащей метионин, по схеме, описанной выше, - группа контроля 3. Введение аргинина и карнитина в экспериментальных и контрольных группах осуществлялось с интервалом 6 часов от введения соответствующей суспензии. Содержание и выведение животных из эксперимента выполняли согласно правилам, изложенными в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологи-ческих исследований с использованием животных» (1985) и приказу МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной диагностики». Немедленно после выведения животного из эксперимента извлекали грудную аорту и участок большеберцовой мышцы. После извлечения очищенные ткани взвешивали на электронных весах AJH-220 CE (Япония), измельчали ножницами, помещали в емкость гомогенизатора «Potter S» (Sartorius, Германия) в холодный 0,25 М раствор сахарозы в соотношении 1/100 и гомогенизировали в течение 60 секунд при 1500 об/мин. Полученные гомогенаты центрифугировали 10 мин при 1000 g, используя центрифугу CM-6M ELMI (Латвия), для осаждения неполностью разрушенных клеток и ядер. Для удаления митохондрий надосадочную жидкость повторно центрифугировали в течение 15 минут при 14000 g, используя рефрижераторную центрифугу К 24 Д (Германия). Полученный таким образом супернатант центрифугировали дополнительно при 20000 g в течение 30 минут для получения чистой цитоплазматической (неседиментируемой) фракции. Седиментируемую фракцию (осадок грубой фракции лизосом) ресуспендировали в 0,25 М растворе сахарозы с добавлением раствора тритона Х-100 в конечной концентрации 0,1 %. Активность катепсинов L, Н определяли спектрофлуориметрическим методом по A.J. Barret и H. Kirshke [9] раздельно в седиментируемой и неседиментируемой фракциях и обозначали как седиментируемую и неседиментируемую активность (СА и НСА) соответственно. Для оценки проницаемости лизосомальной мембраны использовали коэффициент лабильности (Клаб%), рассчитывающийся как процентное соотношение активности лизосомального фермента во внелизосомальной (неседиментируемой) фракции к общей активности (ОА), представляющей собой сумму НСА и СА для данного фермента [5]. Показателем лабилизации лизосомальных мембран служила активность кислой фосфатазы (КФ) [14], измеряемая в седиментируемой и неседиментируемой фракциях гомогената унифицированным методом по «конечной точке» с помощью коммерческого набор «Витал Диагностикс», Санкт-Петербург. Содержание гомоцистеина в сыворотке крови вычисляли методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческого набора компании Axis Shield, США. Статистический анализ данных проводили с использованием программного обеспечения Microsoft Excel и программы Statistika 10. Для каждой выборки рассчитывали медиану (Ме), верхний и нижний квартили [Q1; Q3]. Статистическую значимость отличий показателей экспериментальной группы от группы сравнения оценивали по U-критерию Манна-Уитни. Результаты и их обсуждение При сопоставлении содержания гомоцистеина в сыворотке крови обнаружено выраженное статистически значимое нарастание показателя у животных с тяжелой формой гомоцистеинемии относительно соответствующей контрольной группы (293,10 [273, 10; 318, 20] и 5,90 [5, 50; 6, 70] мкмоль/л). В экспериментальных группах с введением аргинина и карнитина наблюдалось повышение уровня гомоцистеина относительно соответствующих контрольных групп, но результаты измерений (92,80 [58, 75; 112, 07] мкмоль/л для аргинина и 72,70 [55, 27; 91, 85] мкмоль/л для карнитина) были статистически значимо ниже, чем в группе, получавшей изолированно метионин (рисунок). В скелетной мышце при моделировании тяжелой формы гомоцистеинемии установлено статистически значимое увеличение активности катепсина L во всех изучаемых фракциях. Для катепсина Н увеличение общей активности статистически значимо выросло за счет цитоплазматической доли, активность лизосомальной фракции также увеличилась, хотя оказалась статистически незначимой. 10.tif Рис. Содержание гомоцистеина в сыворотке крови экспериментальных и контрольных животных, мкмоль/л: 1 - группа контроля 1; 2 - группа контроля 2; 3 - группа контроля 3; 4 - метионин; 5 - метионин + аргинин; 6 - метионин + карнитин Статистически значимое нарастание активности катепсина L обнаружено при совместном введении метионина и аргинина относительно соответствующих групп контроля во всех трех фракциях, а также статистически значимое снижение общей, лизосомальной и внелизосомальной активности катепсина Н относительно группы животных, изолированно получавшей метионин. При совместном введении карнитина и метионина в исследуемой скелетной мышце обнаружено статистически значимое нарастание неседиментируемой активности катепсинов L, H, а также седиментируемой и общей активности катепсина L относительно соответствующих групп контроля. Сравнивая активность протеаз скелетной мышцы в выборках с гипергомоцистеинемией и введением карнитина на фоне метионина, обнаружили статистически значимое снижение только для неседиментируемой фракции катепсина L. Анализируя проницаемость лизосомальной мембраны, опираясь на активность кислой фосфатазы, получили следующие результаты: активность фермента при гипергомоцистеинемии статистически значимо нарастала во всех фракциях, что указывает на развитие пермеабилизации мембран лизосом. Статистически значимых изменений для коэффициента лабильности мы не получили. Экспериментальная выборка с введением аргинина на фоне метионина демонстрировала снижение активности и уменьшение коэффициента лабильности кислой фосфатазы, однако статистически значимыми результаты оказались лишь для активности фермента цитоплазматической фракции, что говорит о стабилизирующем воздействии аргинина на лизосомальную мембрану. Благоприятное влияние на стабильность лизосомальных мембран оказывает и карнитин, что подтверждается статистически значимым снижением активности кислой фосфатазы в неседиментируемой фракции и коэффициента лабильности (табл. 1). Анализируя изменение активности протеиназ в грудной аорте (табл. 2), мы получили следующие результаты: для катепсина L получено статистически значимое увеличение лизосомальной и общей активности. Для катепсина Н статистически значимое увеличение общей активности происходило за счет увеличения активности фермента во внелизосомальной фракции. Активность кислой фосфатазы статистически значимо увеличивалась за счет цитоплазматической фракции, а также возрастали коэффициенты лабильности данного фермента и катепсина Н, что подтверждает дестабилизацию мембраны лизосом. При совместном введении метионина с аргинином в гомогенате мышечной ткани грудной аорты обнаружено статистически значимое снижение седиментируемой и общей активности катепсина L, но неседиментируемая активность выросла по отношению к выборке, изолированно получавшей метионин. Вероятно, это связано с повышенным выходом фермента в цитозоль, что подтверждается нарастанием активности цитоплазматической фракции и коэффициента лабильности кислой Таблица 1 Активность катепсинов L, Н, кислой фосфатазы в скелетной мышце (Ме [Q1; Q3]) Группа Показатель Катепсин L, нмоль/с·г белка Катепсин Н, нмоль/с·г белка Кислая фосфатаза, нмоль/с·г белка Контроль 1 НСА 0,04 [0, 01; 0, 06] 0,09 [0, 07; 0, 12] 6,54 [6, 5; 6, 48] СА 0,19 [0, 07; 0, 41] 2,19 [1, 83; 2, 37] 135,19 [122, 3; 178, 18] ОА 0,23 [0, 09; 0, 42] 2,28 [1, 91; 2, 45] 142,28 [129, 17; 185, 39] Клаб% 9,48 [4, 47; 40, 04] 4,48 [3, 41; 5, 13] 4,61 [3, 99; 5, 42] Метионин НСА 0,13 [0, 07; 0, 14]* 0,19 [0, 14; 0, 22]* 22,38 [20, 19; 26, 17]* CА 1,09 [0, 83; 2, 18]* 2,56 [2, 15; 2, 91] 344,72 [234, 05; 423, 78] ОА 1,26 [0, 91; 2, 28]* 2,77 [2, 35; 3, 11]* 366,74 [260, 70; 445, 20] Клаб% 8,99 [4, 37; 17, 68] 7,15 [6, 15; 7, 41]* 6,03 [4, 87; 7, 88] Контроль 2 НСА 0,03 [0, 02; 0, 04] 0,08 [0, 07; 0, 09] 7,36 [6, 96; 7, 94] CА 0,23 [0, 11; 0, 46] 2,02 [1, 76; 2, 16] 139,41 [121, 96; 161, 44] ОА 0,25 [0, 15; 0, 49] 2,09 [1, 85; 2, 24] 146,92 [129, 24; 169, 76] Клаб% 10,12 [5, 28; 21, 69] 3,92 [3, 26; 4, 58] 5,37 [4, 33; 5, 84] Метионин + + аргинин НСА 0,08 [0, 07; 0, 09]* 0,08 [0, 06; 0, 096]# 12,75 [11, 39; 14, 69]#* CА 1,58 [1, 53; 1, 96]* 1,87 [1, 28; 2, 19]# 284,96 [212, 49; 337, 18]* ОА 1,66 [1, 61; 2, 07]* 1,91 [1, 38; 2, 27]# 297,14 [228, 37; 350, 93]* Клаб% 4,78 [4, 18; 5, 56]# 4,28 [2, 86; 6, 49] 4,83 [3, 66; 6, 54] Контроль 3 НСА 0,03 [0, 02; 0, 04] 0,08 [0, 07; 0, 09] 9,40 [8, 27; 9, 70] CА 0,23 [0, 11; 0, 46] 2,02 [1, 76; 2, 16] 139,56 [129, 96; 153, 20] ОА 0,25 [0, 15; 0, 49] 2,09 [1, 85; 2, 24] 148,60 [137, 26; 162, 28] Клаб% 10,12 [5, 28; 21, 69] 3,92 [3, 26; 4, 58] 5,94 [4, 68; 6, 65] Метионин + + карнитин НСА 0,06 [0, 04; 0, 06]#* 0,16 [0, 16; 0, 19]* 16,61 [14, 67; 18, 7]*# CА 1,46 [1, 07; 2, 21]* 2,04 [1, 58; 2, 52] 439,59 [357, 56; 645, 02]* ОА 1,51 [1, 1; 2, 26]* 2,21 [1, 72; 2, 76] 456,6 [375, 15; 662, 83]* Клаб% 2,94 [2, 40; 4, 15]* 8,58 [6, 62; 10, 35]* 3,09 [2, 69; 4, 27]*# Примечание: здесь и в табл. 2: * - статистически значимые отличия от контрольной группы (р < 0,05); # - статистически значимые отличия от группы, получавшей метионин (р < 0,05). Таблица 2 Активность катепсинов L, Н, кислой фосфатазы в стенке сосуда (Ме[Q1;Q3]) Группа Показатель Катепсин L, нмоль/с·г белка Катепсин, нмоль/с·г белка Кислая фосфатаза, нмоль/с·г белка Контроль (n = 8) НСА 0,14 [0, 06; 0, 45] 0,07 [0, 06; 0, 13] 36,41 [28, 10; 42, 63] СА 0,54 [0, 24; 1, 66] 0,61 [0, 43; 1, 02] 170,05 [142, 77; 203, 33] ОА 0,68 [0, 30; 2, 10] 0,76 [0, 51; 1, 10] 210,53 [181, 43; 234, 04] Клаб% 21,63 [18, 71; 22, 56] 12,93 [10, 26; 16, 69] 16,99 [15, 35; 19, 88] Гипергомоцистеинемия (n = 8) НСА 0,37 [0, 27; 0, 62] 0,46 [0, 34; 0, 60]* 72,03 [56, 48; 78, 93]* CА 2,52 [1, 16; 3, 66]* 1,07 [0, 32; 1, 71] 170,05 [133, 20; 261, 43] ОА 3,18 [1, 43; 4, 22]* 1,48 [0, 74; 2, 26]* 244,78 [177, 40; 341, 43] Клаб% 12,38 [9, 72; 23, 55] 34,03 [20, 35; 51, 05]* 24,76 [18, 22; 30, 04]* Контроль 2 НСА 0,25 [0, 19; 0, 35] 0,57 [0, 1; 0, 16] 49,92 [47, 13; 56, 95] CА 0,76 [0, 57; 1, 08] 1,73 [1, 66; 2, 29] 145,03 [132, 46; 171, 45] ОА 1,03 [0, 71; 1, 40] 2,23 [2, 19; 3, 07] 201,84 [178, 15; 222, 09] Клаб% 23,56 [21, 32; 30, 64] 22,93 [20, 83; 27, 13] 23,78 [21, 65; 25, 69] Метионин + + аргинин НСА 0,5 [0, 41; 0, 54]#* 0,73 [0, 56; 0, 93] 43,88 [38, 65; 50, 02]# CА 1,08 [0, 82; 1, 25]# 3,60 [2, 62; 3, 85]#* 152,38 [132, 10; 215, 81] ОА 1,49 [1, 35; 1, 76]# 4,49 [3, 18; 4, 89]#* 208,29 [162, 46; 259, 82] Клаб% 14,15 [13, 08; 27, 65] 14,15 [11, 23; 15, 31]* 20,70 [15, 51; 24, 50]# Окончание табл. 2 Группа Показатель Катепсин L, нмоль/с·г белка Катепсин, нмоль/с·г белка Кислая фосфатаза, нмоль/с·г белка Контроль 3 НСА 0,14 [0, 10; 0, 21] 0,33 [0, 28; 0, 40] 30,15 [26, 65; 32, 09] CА 0,53 [0, 33; 0, 66] 1,22 [0, 83; 1, 38] 92,96 [76, 55; 114, 52] ОА 0,70 [0, 43; 0, 84] 1,55 [1, 15; 1, 76] 122,38 [106, 61; 145, 68] Клаб% 22,12 [19, 10; 25, 70] 23,93 [18, 07; 24, 50] 22,22 [19, 01, 55; 23, 95] Метионин + + карнитин НСА 0,05 [0, 02; 0, 11]#* 0,07 [0, 06; 0, 09]* 6,81 [5, 15; 7, 19]# CА 2,98 [2, 65; 3, 18]* 7,44 [5, 91; 8, 11]#* 277,17 [250, 27; 317, 26]# ОА 3,05 [2, 71; 3, 28]* 7,52 [5, 95; 8, 20]#* 283,15 [257, 68; 324, 58] Клаб% 4,01 [1, 4; 8, 78]* 1,85 [1, 67; 2, 72]* 2,13 [1, 92; 2, 30]# фосфатазы. Для катепсина Н получен статистически значимый рост седиментируемой и общей активности в экспериментальной группе, что, к сожалению, демонстрирует слабовыраженное корректирующее действие аргинина на эффекты гомоцистеина в гладкомышечной ткани стенки сосуда. При введении карнитина нами было получено статистически значимое снижение активности цитоплазматической фракции катепсина L, активность катепсина Н увеличилась за счет лизосомальной фракции, что, вероятно, обусловлено феноменом увеличения количества лизосом [11]. Это подтверждается статистически значимым увеличением лизосомальной фракции кислой фосфатазы. Однако корректирующий эффект карнитина отражался на цитоплазматической активности данного фермента и коэффициента лабильности, которые статистически значимо снижались относительно выборки животных с тяжелой формой гомоцистеинемии, что подтверждает его стабилизирующее действие на лизосомальную мембрану, защиту от повреждающего воздействия других ферментов [17], инициирующих клеточный апоптоз. Выводы 1. Выраженная гипергомоцистеинемия сопровождается нарастанием активности катепсинов L, H скелетной и гладкой мышц. Повышение активности кислой фосфатазы в большеберцовой мышце и нарастание коэффициентов лабильности катепсина Н и кислой фосфатазы в грудной аорте демонстрируют феномен пермеабилизации лизосомальных мембран. 2. Корректирующее действие аргинина выражается в снижении активности катепсина Н, снижении активности и коэффициента лабильности кислой фосфатазы в скелетной мышце, что говорит о благоприятном воздействии на стабильность лизосомальной мембраны. Для гладкой мускулатуры введение аргинина приводит к снижению активности катепсина L при отсутствии стабилизирующего эффекта на мембраны лизосом. 3. Введение карнитина сопровождается снижением активности катепсина L за счет цитоплазматической фракции фермента скелетной и гладкой мышц. Стабилизирующее действие карнитина на лизосомальную мембрану выражается в снижении активности кислой фосфатазы за счет цитоплазматической фракции и уменьшении коэффициента лабильности.

About the authors

A S Ilyicheva

Email: sergan52006@rambler.ru

M A Fomina

S A Isakov

References

Supplementary files