CARNITINE CHLORIDE EFFECT ON FUNCTIONAL STATE OF MITOCHONDRIA IN CONDITIONS OF NITRIC OXIDE SYNTHESIS DEFICIT

Full Text

Введение В настоящее время в связи с накоплением информации о митохондриях и их роли в клеточном метаболизме широко обсуждается значение митохондриальной патологии в развитии сердечно-сосудистых заболеваний, таких как атеросклероз, легочная гипертензия, гипертоническая болезнь и хроническая сердечная недостаточность [11, 17]. Существует значительное число точек приложения, воздействие на которые способно изменить метаболические процессы в митохондриях и во всей клетке в целом: регуляция активности дыхательной цепи и карнитиновый гомеостаз, антиоксидантная система митохондрий, изменение активности NO-синтаз, влияние на концентрацию внутриклеточного кальция [2, 10, 12, 17]. Поэтому в настоящее время весьма актуальной проблемой является изучение и разработка фармакотерапевтических подходов для нормализации работы митохондрий клеток различных тканей в условиях снижения синтеза NO и моделей сосудистых заболеваний, - митохондриально-ориентированная терапия [11]. Одним из перспективных веществ данной группы является карнитина хлорид, относящийся к группе препаратов, обладающих метаболическим типом действия. Карнитин (γ-триметил-β-гидроксибутеробетаин) участвует в митохондриальном метаболизме и играет ключевую роль в окислении жирных кислот и энергетическом обмене. В дополнение к транспорту свободных жирных кислот через внутреннюю мембрану митохондрий карнитин модулирует их скорость окисления и участвует в регуляции жизненно важных клеточных функций, таких как апоптоз [3]. Карнитиновый пул взрослого человека в среднем составляет от 15 до 20 гр. и поддерживается как эндогенным синтезом, так и поступлением с пищей, преимущественно из мяса и молочных продуктов. Общий пул карнитина в организме представлен свободным карнитином и его эфирами, образующимися в реакциях, катализируемых карнитинацилтрансферазами [15]. Концентрация карнитина и ацилкарнитина может изменяться в зависимости от диеты либо в условиях патологических состояний, таких как, например, сахарный диабет [18], сердечно-сосудистые заболевания [11, 14]. Таким образом, использование карнитина хлорида может быть перспективным в лечении и профилактике хронических состояний и заболеваний, связанных с митохондриальной дисфункцией, но необходимы дальнейшие исследования для наиболее полной оценки возможностей данного препарата. Цель исследования - изучить воздействие карнитина хлорида на функциональное состояние митохондрий и карнитиновый гомеостаз в условиях L-NAME-индуцированного снижения синтеза оксида азота (II). Материалы и методы исследования Исследование проводилось на 24 крысах-самцах линии Вистар массой 230-270 г. Крысы были разделены на 3 группы, каждая из которых включала 8 животных. Крысам первой группы ежедневно в течение 7 дней 1 раз в сутки внутрибрюшинно вводился L-NG-нитроаргинина метиловый эфир (L-NAME) (производство «Sigma») - неселективный ингибитор NO-синтазы в дозе 25 мг/кг, второй - ежедневно на фоне введения карнитина хлорида (производство ФГУ «РКНПК» Минздрава России - ЭПМБП) в дозе 300 мг/кг внутрибрюшинно в течение 21 дня 1 раз в сутки вводился L-NAME в дозе 25 мг/кг в течение 7 дней, начиная с 14-го дня введения карнитина хлорида, третья группа являлась контрольной, животным этой группы назначался 0,9%-ный раствор NaCl 1 раз в день внутрибрюшинно в течение 21 дня. Выбор доз осуществлялся на основе литературных данных [9, 13]. Работа с животными проводилась в соответствии с «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986), приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» и приказом Минздрава СССР от 12.08.1977 г. № 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных». Из ткани сердца с помощью гомогенизатора Potter S получали гомогенат и выделяли из него митохондрии методом дифференциального центрифугирования [6]. Осадок, содержащий митохондрии, ресуспендировали в растворе, содержащем 0,25 М сахарозы, 0,001 М ЭДТА, 0,05 М трис-буфер, и далее использовали для определения активности митохондриальных ферментов: лактатдегидрогеназы (ЛДГ), сукцинатдегидрогеназы (СДГ), СОД 2, а также для измерения концентрации метаболитов NO, лактата, карнитина и жирных кислот. Общее содержание белка по методу Лоури, лактата и ЛДГ в пробах измеряли с помощью стандартизированных диагностикумов DiaSyS Diagnostic Systems. Активность СДГ определяли с помощью метода, основанного на определении восстановленного гексацианоферрата [6]. Активность митохондриальной Mn-зависимой СОД исследовали при помощи метода, основанного на торможении реакции аутоокисления кверцитина [4]. Определение метаболитов NO проводили с помощью метода в модификации В. А. Метельской на ИФ-анализаторе StatFax 3200 [5]. Концентрацию карнитина в митохондриях определяли по методу L. Wan и R. W. Hubbard, основанному на образовании свободного KoASH, неэнзиматически реагирующего с 5,5-дитиобис-2-нитробензоатом с образованием окрашенного 5-тио-2-нитробензоата, интенсивность светопоглощения которого измеряли спектрофотометрически при λ = 410 нм [16]. Карнитиновый гомеостаз исследовали, измеряя количество общего, свободного карнитина, количество связанного карнитина (оценивалось по разнице между ними), а также определяя соотношение «связанный карнитин/общий карнитин», %. Для выявления различий между независимыми группами использовали U-критерий Манна-Уитни, который рассчитывали с помощью программы StatPlus 2009. Уровень отличий рассматривался как статистически значимый при вероятности ошибки p < 0,05. Результаты и их обсуждение Из результатов, приведенных в таблице, следует, что L-NAME в дозе 25 мг/кг достоверно приводил к снижению концентрации метаболитов NO и лактата, вместе с тем достоверно повышалось содержание неэтерифицированных жирных кислот, общего карнитина и активность всех трех измеряемых оксидоредуктаз в митохондриях тканей сердца по сравнению с показателями животных контрольной группы. Сопутствовавший увеличению концентрации жирных кислот (в 3,9 раза) прирост концентрации общего карнитина (в 2,43 раза) при снижении доли связанного карнитина (с 55 до 13 %) указывает на низкую активность процессов, связанных с β-окислением жирных кислот, в первую очередь, переноса ацильных групп с ацил-SKoA на карнитин. Интенсивность процессов окисления жирных кислот регулируется соотношением HSKoA/ацетил-SKoA. При смещении этого соотношения в сторону ацетил-SKoA происходит образование малонил-SKoA, ингибирующего карнитинпальмитоилтрансферазу-I (КПТ-I) и, как следствие, торможение процессов β-окисления с целью сохранения оптимальной активности ЦТК (ацетил-SKoA - аллостерический регулятор активности цитратсинтазы). КПТ-I - это фермент, ответственный за перенос жирных кислот из цитоплазмы клетки на карнитин с образованием ацил-карнитина, который, в свою очередь, переносится с помощью карнитинацилкарнитинтранслоказы в митохондриальный матрикс [3]. Митохондриальная ЛДГ - составная часть митохондриального лактат-окисляющего комплекса, обеспечивающего дегидрирование лактата и одновременно транспорт образующегося пирувата в митохондрию. Повышение активности этого фермента (в 2,6 раза) при замедлении β-окисления жирных кислот и снижении концентрации лактата (в 2,28 раза) указывает на интенсификацию потребления лактата митохондриями в качестве источника энергии, что, возможно, являлось следствием компенсаторной реакции, направленной на поддержание уровня окислительно-восстановительных процессов [7]. Повышение активности СДГ (в 2,1 раза) в группе животных, получающих 25 мг/кг L-NAME, указывает на интенсификацию процессов цикла трикарбоновых кислот и окислительного фосфорилирования по сравнению с показателями контрольных животных. Это косвенно подтверждается приростом активности СОД (в 2,33 раза), главной задачей которого является нейтрализация избыточно образующихся АФК при усилении клеточного дыхания [12, 17]. Ингибирование митохондриальной NO-синтазы, что подтверждается снижением концентрации метаболитов NO, также способствует усилению процессов клеточного дыхания [1, 8]. Изменение показателей митохондрий ткани сердца в условиях моделирования L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции и коррекции ее карнитина хлоридом (медиана [квартиль 1; квартиль3]) Показатель Группа животных, получавших 0,9%-ный NaCL внутрибрюшинно 25 мг/кг L-NAME внутрибрюшинно 25 мг/кг L-NAME внутрибрюшинно + 300 мг/кг карнитина хлорида Концентрация метаболитов NO, мкмоль/мг белка 65 [64; 79] 51 [36; 59]* 274 [189; 300]** Лактат, мкмоль/мг белка 276 [244; 420] 121 [92; 124]* 196 [181; 228]** Жирные кислоты, мкмоль/мг белка 11 [10; 13] 43 [41; 46]* 27 [25; 29]** ЛДГ, Ед/г белка 10 [7; 13] 26 [25; 27]* 13 [11; 14]** СДГ, нмоль сукцината/мин на мг белка 54 [33; 73] 113 [105; 149]* 297 [250; 396]** СОД, оптическая плотность, у.е./мг белка 0,18 [0, 13; 0, 26] 0,42 [0, 37; 0, 87]* 2 [1, 06; 2, 65]** Карнитин общий, мкмоль/мг белка 51 [49; 54] 134 [132; 215]* 87 [70; 110]** Карнитин свободный, мкмоль/мг белка 23 [22; 26] 116 [110; 220]* 50 [34; 68]** Карнитин связанный, мкмоль/мг белка 28 [25; 30] 18 [14; 23]* 37 [25; 53]** Соотношение карнитин связанный/карнитин общий 0,55 [0, 46; 0, 56] 0,13 [0, 10; 0, 15]* 0,43 [0, 35; 0, 49]** Примечание: * - достоверные результаты (p < 0,05) группы животных, получавших L-NAME 25 мг/кг, относительно контрольной группы; ** - достоверные результаты между группой животных, получающих 300 мг/кг карнитина хлорид + 25 мг/кг L-NAME, и группой крыс, получающих 25 мг/кг L-NAME. Таким образом, митохондрии сердца крыс способны компенсировать метаболические сдвиги, развивающиеся в условиях семидневной модели дефицита синтеза NO, индуцированного L-NAME в дозе 25 мг/кг, за счет оптимального использования кислорода и лактата вместо жирных кислот в качестве источника энергии. Однако при этом имеет место значительный рост концентрации свободных жирных кислот в матриксе митохондрий - разобщителей клеточного дыхания и окислительного фосфорилирования, и снижение доли связанного карнитина, что косвенно указывает на снижение концентрации HSKoA и определенный предел в увеличении активности ферментов ЦТК и ДЦ для повышения интенсивности синтеза АТФ. Введение L-NAME на фоне предварительного введения карнитина хлорида в дозе 300 мг/кг не вызывало снижения концентрации метаболитов оксида азота в митохондриях миокардиоцитов, а способствовало значительному их приросту (в 5,31 раза) относительно контрольной группы, что указывает, с одной стороны, на компенсаторный сдвиг, направленный на сдерживание активности ДЦ, с другой - на нивелирование эффекта неселективного ингибирования синтаз NO. Не происходило резкого снижения доли связанного карнитина (43 %, она оставалась на контроле - 55 %), концентрация лактата снижалась в значительно меньшей степени (в 1,4 раза), концентрация же жирных кислот была на 37 % ниже, чем у группы животных с L-NAME, но не достигала значений контрольной группы. Уровень общего карнитина был ниже на 35 % относительно группы с L-NAME, но на 70 % выше, чем у животных группы контроля, аналогичная тенденция наблюдалась в изменении уровня свободного карнитина (снижалась на 57 %, но выше контроля на 54 %). Значительно на фоне экзогенного введения карнитина хлорида возрастала активность СДГ (в 2,63 раза) и митохондриальной СОД (в 4,76 раза), которая, с одной стороны, обеспечивает защиту NO от АФК, а с другой - ее активность находится также в тесной зависимости от карнитинового гомеостаза, и экспрессия гена СОД повышается под влиянием карнитина [15, 17], механизм этого явления в настоящее время не изучен полностью, но считается одним из возможных механизмов антиоксидантного действия карнитина. Таким образом, в ходе исследования были получены результаты, демонстрирующие предотвращение митохондриальной дисфункции при предварительном введении карнитина хлорида в условиях модели L-NAME, 25 мг/кг в течение 7 дней. Мы считаем целесообразным дальнейшее изучение возможности использования карнитина хлорида при заболеваниях, связанных с дефицитом синтеза оксида азота (II) и избыточным образованием АФК. Выводы 1. L-NAME в дозе 25 мг/кг в течение 7 дней снижает концентрацию митохондриального лактата и увеличивает концентрацию жирных кислот в митохондриях кардиомиоцитов крыс, что приводит к нарушению карнитинового гомеостаза. 2. Предварительное назначение карнитина хлорида в дозе 300 мг/кг перед введением 25 мг/кг L-NAME нормализует карнитиновый гомеостаз, предотвращает падение концентрации метаболитов NO и снижает концентрацию неэтерифицированных жирных кислот, а также достоверно повышает активность СОД и СДГ в митохондриях кардиомиоцитов крыс.

About the authors

V I Zvyagina

O M Uryasiev

E S Belskikh

Email: ed.bels@yandex.ru

D V Medvedev

References

Supplementary files