The effects of overexpression of human APP on cholinergic and dopaminergic neurons of brain of Drosophila melanogaster

Full Text

Влияние гиперэкспрессии гена АРР человека на холинергические и дофаминергические нейроны Drosophila melanogaster Болезнь Альцгеймера (БА) — нейродегенеративное заболевание, которое является основной причиной деменции людей в пожилом и старческом возрасте. Согласно одной из гипотез развития БА, главную роль в проявлении клинических симптомов заболевания играет селективная гибель холинергических нейронов (более 70 %) преимущественно в области базальных ядер Мейнерта (Whitehouse et al., 1982), которые являются одним из основных источников холинергической иннервации коры больших полушарий мозга (Mesulam et al., 1983). Ряд исследователей приводят данные о нарушениях при БА и в других нейротрансмиттерных системах — дофаминовой, серотониновой, глутаматной, адреналиновой (Chen et al., 2011; Schaeffer et al., 2008; Sun et al., 2012). Однако причины нейродегенеративных изменений при БА остаются малопонятными. Согласно гипотезе амилоидного каскада, которая в настоящее время является центральной гипотезой патогенеза БА, накопление в ткани мозга растворимых и нерастворимых форм Аβ запускает цепочку патологических реакций, приводящих к гибели нейронов и, в конечном итоге, к развитию деменции (Hardy, Selkoe, 2002). В свою очередь, Аβ является результатом протеолитического процессинга β- и γ-секретазами большого трансмембранного белка APP (Thinakaran et al., 2008), мутации в гене которого приводят к развитию семейных форм БА. Однако целый ряд исследований свидетельствует о наличии альтернативных путей развития этого заболевания (Saura et al, 2004; Bonda et al., 2009; Mohandas et al., 2009; Pimplikar et al., 2010). Также было показано, что наряду с Аβ в нейродегенерации могут принимать участие как полноразмерный APP, так и другие фрагменты, образующиеся в результате его процессинга (Kim et al., 2003; Stokin et al., 2008; Słomnicki et al., 2008; Sarantseva et al., 2009). В большинстве моделей БА, созданных на млекопитающих, гиперэкспрессия АРР приводит к увеличению уровня Aβ и накоплению олигомеров Aβ, которые могут вызывать нейродегенерацию и дефицит когнитивных функций (Walsh, Selkoe, 2004). Хотя гиперэкспрессия АРР и отложения Aβ у трансгенных животных не полностью воспроизводят все аспекты БА, эти модели создают реальные возможности для изучения нейропатологии, связанной с БА. В частности, они помогают объяснить вклад АРР и Aβ в патогенез семейных форм БА. И в этой связи Drosophila melanogaster имеет ряд преимуществ перед другими модельными объектами, поскольку позволяет дифференцировать эффекты APP и Aβ. Во-первых, ген APPL, ортолог АРР у Drosophila, не содержит региона, кодирующего Aβ. Во-вторых, у Drosophila представлены все компоненты белкового комплекса, ответственного за активность γ-секретазы, но отсутствует или является необычайно низкой активность β-секретазы (BACE). Поэтому для генерации Аβ необходимы двойные трансгены, экспрессирующие бета-секретазу и полноразмерный ген АРР человека. Это обстоятельство дает возможность разделения эффектов АРР и Аβ. Достаточно лишь сравнить линию, несущую только трансген АРР, с линией, несущей два трансгена — АРР и BACE. Следует сказать, что разделение цитотоксических эффектов Аβ и АРР позволяет ответить на вопрос о природе основных патогенетических механизмов БА и имеет первостепенное значение для выработки подходов в терапевтическом лечении БА. Целью данной работы явилось исследование влияния экспрессии APP человека на популяции холинергических и дофаминергических нейронов у трансгенных линий Drosophila melanogaster, а также на способность трансгенных мух к обучению и запоминанию. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе Для анализа дегенерации холинергических и дофаминергических нейронов мы использовали следующие линии: UAS-APP (содержит ген АРР человека, далее в тексте АРP); UAS-APP-Swedish (содержит ген АРР человека с мутацией Swedish, приводящей к наследственной форме БА, далее в тексте АРР-Sw); BACE (содержит ген бета-секретазы человека, далее в тексте ВАСЕ). Экспрессия трансгенов была проведена в системе UAS-GAL4 (Brand, Perrimon, 1993). В качестве активаторов транскрипции был использован драйвер GAL4-Cha (линия GAL4-Cha-UAS-GFP), обеспечивающий экспрессию генов, находящихся под управлением UAS, в холинергических нейронах (далее в тексте Cha), и драйвер ple-GAL4 (экспрессия в дофаминергических нейронах, далее в тексте ple). Для анализа дофаминергических нейронов использовали линию UAS-CD8-GFP, (далее в тексте CD8). Линии были получены из коллекции Drosophila Bloomington Stock Center. Во время проведения экспериментов мухи содержались на стандартной дрожжевой среде при температуре 29 оС при 12 часовом световом дне. Приготовление образцов для конфокальной микроскопии Для приготовления образцов для конфокальной микроскопии мух помещали в фосфатный буфер, головы отделяли от тела, обрабатывали октаном и фиксировали в растворе 4%-го параформальдегида в фосфатном буфере 7 минут при комнатной температуре. После фиксации промывали в фосфатном буфере и выделяли мозг, который помещали на предметные стекла в раствор фосфатного буфера с глицерином в соотношении 1 : 1. Конфокальная микроскопия и анализ изображений Конфокальная микроскопия была проведена с помощью микроскопа Leica TCS SP5 со встроенным 35-мВт аргонным лазером. Сканирование всех образцов проводилось при одинаковых настройках сканирования. Препараты анализировали при длине волны λ = 488 нм. Толщина оптических срезов при сканировании составляла 1 μм. Оценка интенсивности флуоресценции при анализе холинергических нейронов была проведена на микрофотографиях конфокальных срезов в программе ImageJ (version 1.38a for Windows). Подсчет дофаминергических нейронов был проведен на микрофотографиях конфокальных срезов в программе ImageJ (version 1.38a for Windows), согласно методике из статьи Ботелла с соавт. (Botella et al., 2008). Обрабатывали по шесть образцов мозга из трех повторностей каждой возрастной группы каждого скрещивания. Анализ обучаемости и памяти трансгенных мух Тест на обучение и память к распознаванию запахов проводился по методике, предложенной Талли и Квинном (Tully, Quinn, 1985). Тест основан на способности Drosophila к выработке условных рефлексов. Во время обучения 50–70 мух помещали в тестовую трубку, покрытую изнутри металлической сеткой. Через трубку насосом непрерывно прокачивался воздух. Использовали два вещества с сильным запахом — 3’-октанол и 4-метилциклогексанол. В течение 1 минуты вместе с током воздуха подавали одно вещество, и в его присутствии мухи получали слабые удары электрическим током. Далее в течение 1 минуты подавали воздух без вещества и электрошока (время «отдыха»), а затем в течение 1 минуты второе пахнущее вещество, но уже без электрошока. Сразу же после этой процедуры измеряли способность к обучению: мух на 2 минуты помещали в Т-образную трубку («точку выбора») между встречными течениями двух запахов. Через 1 час с помощью такой же процедуры проверяли способность мух к запоминанию. Индексы обучения и памяти вычисляли следующим образом: из числа мух, сделавших правильный выбор, вычитали число мух, сделавших неправильный выбор. Полученную разность делили на общее число мух и умножали на 100. Статистическая обработка результатов Достоверность различий между контролем и вариантами эксперимента определяли с помощью метода однофакторного дисперсионного анализа (one-way ANOVA) и теста множественных сравнений Тьюки-Крамера (Tukye-Kramer test) программы Kyplot. Статистически значимыми считали различия при р < 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ Анализ нейродегенерации холинергических нейронов Анализ холинергических нейронов проводили у потомков от скрещиваний мух линии Cha и мух линий APP, APP-Sw и BACE; APP-Sw на 3–5, 15–17 и 29–30-й дни их жизни методом конфокальной микроскопии. Ацетилхолин является основным медиатором возбуждения в центральных синапсах Drosophila, поэтому в контрольной линии Cha наблюдались многочисленные сигналы флуоресценции большой плотности по всему мозгу, а также в глазных долях. В этом случае оказалось невозможным провести прямой подсчет холинергических нейронов в мозге Drosophila как вручную, так и в автоматическом режиме. Таким образом, для оценки общего количества холинергических нейронов мы использовали анализ уровня общей флуоресценции в мозге. На рисунке 1 представлены фотографии мозга Drosophila melanogaster с экспрессией АРР в холинергических нейронах в зависимости от возраста и генотипа. В образцах мозга мух всех линий свечение наблюдалось в одних и тех же структурах: в антеннальных долях, центральном комплексе, промежуточных нейронах рядом с антеннальными долями, грибовидных телах и клетках Кеньона. Эти отделы мозга отвечают у Drosophila за восприятие внешних сигналов, локомоторные функции, обучение и память. Уровень флуоресценции к 30-му дню жизни мух был понижен во всех структурах. Однако если в контроле у мух Cha/+ наибольшее снижение уровня флуоресценции наблюдалось в центральном комплексе и промежуточных нейронах рядом с антеннальными долями, то в опытных образцах с экспрессией APP и APP-Sw по отдельности или с экспрессией BACE и APP-Sw одновременно, этот показатель в большей степени был снижен в антеннальных долях и грибовидных телах. На рисунке 2 представлены в форме диаграмм средние численные значения относительной интенсивности флуоресценции на 3–5, 15–17 и 27–30 дни в контрольной линии Cha/+, линиях с экспрессией АРР, APP-Sw и одновременной экспрессией BAСE. Как видно из полученных данных, уровень флуоресценции на 3–5-й день одинаков в контрольной и опытных линиях, в то время, как на 15–17-й день он понижен в линиях, экспрессирующих АРР и резко снижается в мозге мух этих линий на 27–30-й день. В контрольной линии относительный уровень флуоресценции во время опыта оставался практически неизменным. Мы не наблюдали статистически достоверной разницы между линиями с экспрессией полноразмерного APP и линией, где образовывался Аβ. Анализ нейродегенерации дофаминергических нейронов Для визуализации дофаминергических нейронов методом конфокальной микроскопии мы использовали трансгенную линию CD8, мембраны нервных клеток которой мечены зеленым флуоресцентным белком. На рисунке 3 представлены фотографии мозга Drosophila melanogaster с экспрессией АРР в зависимости от возраста и генотипа. На фотографиях видно, что дофаминергические нейроны в мозге Drosophila собраны в небольшие билатеральные кластеры, расположенные по всему мозгу (рис. 3). Мы провели автоматический подсчет дофаминергических нейронов на 3–5, 15–17 и 27–30-й дни, используя программу ImageJ. Полученные нами результаты представлены на рисунке 4. Как видно из рисунка, количество дофаминергических нейронов статистически достоверно снижается в линиях, экспрессирующих АРР, начиная с 15–17-го дня. В то же время в контрольной линии количество дофаминергических нейронов остается на одном и том же уровне в течение всего опыта. Мы не наблюдали статистически достоверной разницы между линиями, в которых гибель нейронов вызвана экспрессией полноразмерного APP и линиями с образованием Аβ. Таким образом, полученные нами результаты указывают на то, что как и в случае с холинергическими нейронами, гибель дофаминергических нейронов, вызываемая экспрессией АРР, может происходить в мозге Drosophila в отсутствии образования Аβ. Анализ памяти и способности к обучению Исследования нейродегенеративных изменений при БА показывают, что у пациентов с БА степень утраты холинергических нейронов коррелирует со степенью когнитивной дисфункции (Francis et al, 1999, Kar et al, 2004). Параллельно оценке состояния холинергических и дофаминергических нейронов, мы провели анализ способности мух к обучению и запоминанию на 2–5-й и 15-й дни их жизни. Способность к обучению в используемом нами тесте оценивалась индексом обучения, а индекс запоминания свидетельствавал о памяти животных. В таблицах 1 и 2 представлены результаты тестов на способность мух к обучению и запоминанию. Из таблиц следует, что способность животных к обучению и запоминанию достоверно снижена по сравнению с контролем уже со второго дня жизни мух. Это показано как для линий, экспрессирующих только АРР (АРР-Sw), так и для линий с образованием Аβ. ОБСУЖДЕНИЕ Уже на ранней стадии заболевания у больных БА наблюдается ослабление функций холинергической системы (Whitehouse et al., 1982), уменьшение на 50–90 % уровня ацетилхолинтрансферазы, основного фермента участвующего в синтезе ацетилхолина (ChAT) (Davies, 1979), а также снижение плотности никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (нАцХР) (Guan et al. 2000). Все эти изменения, как полагают, обусловлены гибелью холинергических нейронов в определенных отделах мозга. В то же время показано, что некоторые типы нАцХР задействованы в регуляции дофаминергической системы (Perry et al., 1995; Exley et al., 2012). Снижение их плотности при БА может обуславливать нейродегенерацию дофаминовых нейронов. С потерей дофаминергических нейронов в области черной субстанции связывают проявление симптомов паркинсонизма, которые наблюдаются у более, чем трети больных БА (Kazee et al., 1995; Burns et al., 2005). Предполагается, что важную роль в гибели и дисфункции холинергических и дофаминергических нейронов при БА играет образование Аβ (Perez et al., 2005). В настоящей работе мы исследовали роль гена АРР в развитии нейродегенерации на трансгенных линиях Drosophila melanogaster, позволяющих дискриминировать эффекты экзогенного белка АРР и непосредственно Аβ. Экспрессия АРР или АРР-Sw, а также совместная экспресии APP (АРР-Sw) и ВАСЕ приводила к нейродегенерации холинергических (на 30-й день жизни) и дофаминергических (на 15-й день жизни) нейронов в мозге животных. Гибель нейронов особенно была заметна в линиях с экспрессией полноразмерного АРР. Образование Аβ также приводило к развитию нейродегенерации, но ее уровень статистически достоверно не отличался от такого в линиях с экспрессией АРР (APP-Sw). Уменьшение количества холинергических и дофаминергических нейронов сопровождалось драматическим снижением способности животных к обучению и запоминанию. При этом, если гибель нейронов регистрировалась с 15-го или 30-го дня жизни мух, то наблюдаемое резкое снижение способности к обучению и запоминанию по сравнению с контролем, указывает на более ранние события, связанные, на наш взгляд, с потерей синапсов. В этой связи надо отметить, что проведенные post mortem исследования показали, что изменению уровня ChAT в мозге больных БА предшествует гибель синапсов (Tiraboschi et al., 2000). Хотя в настоящее время клеточные функции АРР остаются не вполне понятными, роль этого белка в образовании и поддержании синапсов не подвергается сомнению (Müller, Zheng, 2012). Мы предполагаем, что в основе наблюдаемых нами нейродегенеративных изменений лежит нарушение синаптической функции АРР. Полученные нами результаты показывают, что нейродегенерация в мозге животных и уменьшение способности к обучению и запоминанию обусловлены экспрессией именно полноразмерного гена АРР или APP-Sw. Хотя многочисленные исследования, проведенные на Drosophila melanogaster (Iijima-Ando, Iijima, 2010), показывают нейротоксичность Аβ, мы не наблюдали значительного вклада его образования в усиление наблюдаемой нейропатологии, что может быть связано с умеренным образованием Аβ в используемой нами модели. Представленные результаты позволяют взглянуть на развитие нейродегенерации при БА с точки зрения возможных аномальных функций мутантного АРР. При экспрессии АРР человека в нервных клетках Drosophila его продукт транспортируется в пресинаптический терминал нейронов и постсинаптические участки нейромышечных контактов (Yagi et al., 2000), конкурируя с Appl, гомологом APP в Drosophila melanogaster. Надо отметить, что Appl экспрессируется в основном в нервной системе и играет ключевую роль в формировании и поддержании синапсов у Drosophila. Выключение гена Appl не приводило к летальному эффекту, но вызывало значительное изменение поведенческих реакций (Luo et al., 1992), а также уменьшение числа и размеров синаптических бутонов нейромышечных контактов личинок Drosophila, в то время как его гиперэкспрессия приводила к увеличению числа и размеров синаптических бутонов (Torroja et al., 1999). Так как APP и Appl, являются интегральной частью цитоскелета клетки [Li et al., 2004], вполне вероятно, что мутантный APP или гиперэкспрессия АРР дикого типа приводят к нарушению целостности цитоскелета, дегенерации синаптического компартмента и, как следствие, уменьшению числа нормальных синапсов. Кроме того, конкуренция Appl и APP может подавлять регуляцию экспрессии синаптических генов через протеинкиназа G-зависимый механизм (Claasen et al., 2009). В то же время фрагменты протеолитического расщепления APP также могут влиять на транскрипционную активность синаптических генов Drosophila (Müller et al., 2007). Так, цитоплазматический фрагмент АРР (APP intracellular domain, AICD), генерируемый при протеолизе АРР γ-секретазой может транслоцироваться в ядро, регулировать генную экспрессию, синаптическую пластичность и память (Cao, Sudhof, 2001). Как регулятор транскрипции AICD влияет на ремоделирование хроматина посредством связывания с ацетилтрансферазой гистонов Tip60 (Cao, Sudhof, 2001, 2004). Примечательно, что трансгенные мыши, с гиперэкспрессией AICD, проявляли нейропатологические черты, характерные для БА, включая гиперфосфорилирование тау, нейродегенерацию, нарушение памяти (Ghosal et al. 2009), что указывает на важность рассмотрения других продуктов АРР в патогенезе БА. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 09-04-00647-а).

About the authors

Olga Igorevna Bolshakova

B. P. Konstantinov Petersburg Nuclear Physics Institute

Email: olya99991@yandex.ru
research associate

Anna Aleksandrovna Zhuk

B.P. Konstantinov Petersburg Nuclear Physics Institute

Email: azhukomi@mail.ru
senior technician

Dmitriy Igorevich Rodin

B.P. Konstantinov Petersburg Nuclear Physics Institute

Email: nomadkml@me.com
Junior Researcher

Svetlana Vladimirovna Sarantseva

B.P. Konstantinov Petersburg Nuclear Physics Institute

Email: svesar1@yandex.ru
Head of Laboratory, Ph.D

Galina Alekseevna Kislik

B.P. Konstantinov Petersburg Nuclear Physics Institute

Email: kislikgalina@hotmail.com
Junior Researcher

References

Supplementary files