Evolution of virulence in population of flax rust pathogen Melampsora lini (Pers.) Lev. in conditions of Russia

Full Text

Введение Экологическая чистота сельскохозяйственной продукции и окружающей среды в значительной мере зависит от устойчивости возделываемых сортов к болезням, исключающей необходимость применения ядохимикатов. Ржавчина льна - болезнь, вызываемая грибом Melampsora lini (Pers.) Lev., в годы широкого распространения наносила огромный вред, снижая урожайность и качество волокна и семян. Гриб относится к семейству Melampsoraceae, к классу Basidiomycetes, порядку Uredinales - ржавчинные грибы. Это облигатный паразит с полным пятистадийным циклом развития, все стадии которого проходят на льне. Патоген зимует в телейтостадии. Телейтоспоры при прорастании весной дают базидии с гаплоидными базидиоспорами. Базидиоспоры заражают листья и стебли льна и образуют спермогонии (пикниды), на которых развиваются спермации. При слиянии спермациев с противоположным половым знаком (половая стадия) на спермогониальных пятнах образуются эцидии в виде оранжево-желтых порошистых пустул с одноклеточными дикариотическими эцидиоспорами. В результате заражения растений эцидиоспорами возникает уредомицелий и развиваются уредопустулы с уредоспорами (повторяющаяся стадия гриба). При благоприятных погодных условиях (температура 18-22 ° и капельно-жидкая влага для прорастания) уредоспоры генерируют новые поколения каждые 8-10 дней, инфицируя весь посев. В результате происходит накопление инфекции, которое может привести к эпифитотии (Попова, 1935, Flor, 1953, Пересыпкин и др., 1986). При наступлении неблагоприятных условий (жаркая засушливая погода, осеннее похолодание) гриб переходит в стадию покоя - телейтостадию (Флор, 1956, Кутузова, 2014). Устойчивость льна к ржавчине наследуется моногенно или малым числом высокоэффективных доминантных генов (вертикальная устойчивость), либо полигенно - многими доминантными генами с частичной эффективностью (горизонтальная устойчивость) (Флор, 1962; Кутузова, 1994). В настоящее время у культурного льна известно 6 локусов - K, L, M, N, P и Q, контролирующих этот признак. Для первых пяти локусов методами формальной генетики доказан множественный аллелизм. Так, в локусе L известно 12 аллелей, в M - 7, в N - 3, в P - 7, в K - 2. В локусе Q выявлен один эффективный аллель устойчивости (Islam, Shepherd, 1991; Кутузова, 2005). Локусы N и P сцеплены, все другие наследуются независимо. Современными методами выявлены уникальные фрагменты ДНК, маркирующие аллели L2, L6, L9, L11 (Hausner et al., 1999a), P, P2 (Dodds et al., 2001a), M3 (Hausner et al., 1999b), M4 (Bo et al., 2008). В настоящее время секвенировано девятнадцать аллелей генов: 11 в локусе L, 3 - в M, 3 - в N и 2 - в Р (Ravensdale et al., 2011). Доказана частичная гомология между секвенированными генами, расположенными в разных локусах (Ravensdale et al., 2011). Продукты этих генов контролируют передачу сигнала о заражении внутри клетки и принадлежат к классу TIR-NBS-LRR белков (TIR - домен Toll/Interleukin-1 Resistance, гомологичный цитоплазматическому домену Toll белка дрозофилы и интерлейкинового рецептора (IL-R) млекопитающих; NBS - нуклеотид связывающий сайт, LRR - лейцин обогащенные повторы) (Hammond-Kosack, Jones, 1997). Методами молекулярной генетики показано, что L ген имеет множество аллелей, N, M и P локусы обладают 4, более чем 15, или 6-8 тандемно повторяющимися паралогами соответственно (Anderson et al., 1997; Dodds et al., 2001 а и 2001b; Ravensdale et al., 2011). В большинстве случаев различия между аллелями одного гена касаются лейцин, обогащенных доменов (Dodds et al., 2001b, Ellis et al., 1999), однако для гена L4 показана однонуклеотидная замена в NBS домене (Ellis et al., 2007). Возбудитель ржавчины M. lini дифференцирован на множество физиологических рас, имеющих определенную комбинацию генов вирулентности. Вирулентность, как правило, наследуется моногенно и контролируется рецессивными генами (Flor, 1942, 1946, 1955). Заражение происходит, если комплементарные гены растения и гриба находятся в гомозиготном рецессивном состоянии (Флор, 1962). Знания особенностей расообразовательного процесса в местных условиях, возможности появления и распространения новых, более широко вирулентных рас в льноводной зоне, являются важными. Без их учета невозможно выбрать правильную стратегию селекции на устойчивость к болезни. Известно, что в условиях нашей страны возбудитель ржавчины может зимовать только в телейтостадии и воспроизводится только через половой процесс, при котором в результате рекомбинации ежегодно меняется расовый состав гриба и увеличивается гетерозиготность популяции, приводящая к сужению ее вирулентности. Широко вирулентные расы, как правило, присутствуют в популяции гриба в малом количестве (Flor, 1962; Misra, Prasada, 1966; Крылова, 1994). Идентификацию рас M. lini проводят с помощью международного набора моногенных линий-дифференциаторов. В связи с недолговечностью рас гриба их идентификация проводится в основном для выявления новых генов устойчивости. С помощью заражения большим числом монопустульных изолятов гриба было установлено, что этот набор неудовлетворительно дифференцирует расы ржавчины в нашей стране (Крылова, 1981; Кутузова, Куликова, 1985). Наиболее важной причиной образования новых по вирулентности рас гриба, как показано выше, является генетическая рекомбинация, связанная с половым процессом, при котором вирулентность сужается. Возникновение агрессивных форм гриба происходит в основном за счет мутаций. Мутации вирулентности, связанные с изменением отдельного гена, благодаря дикариотическому состоянию мицелия могут накапливаться в гетерозиготном состоянии по ряду локусов, оставаясь незаметными. Так как вирулентность рецессивна, мутантные расы могут поражать растения только в гомозиготном состоянии. Гомозиготной раса может стать, если аналогичная мутация происходит в обоих ядрах одной дикариотической споры, или если гаплоиды с идентичной мутацией вступают в половой процесс (Flor, 1955). В конечном итоге мутации обусловливают и фундаментальные изменения патогенности, проявляющиеся позднее в результате гибридизации и других процессов, связанных с генетической рекомбинацией (Тарр, 1975). В истории селекции льна на устойчивость к возбудителю ржавчины известно множество случаев появления новых рас гриба с более широкой вирулентностью (Земит, 1949; Flor, 1953; Hoes, Zimmer, 1976; Wieks, 1978; Крылова, 1994), что часто приводило к возникновению эпифитотий. Широко вирулентные расы могут сохраниться в популяции гриба только на сортах с высокой степенью устойчивости, поскольку, благодаря стабилизирующему отбору, расы с повышенной вирулентностью постепенно элиминируются из популяции как менее жизнеспособные (Flor, 1953; Leonard, Czochor, 1978). Изучение вирулентности популяций гриба из различных регионов СССР (Псковской, Смоленской, Калининской областей, Белоруссии и Литвы) в сравнении с пушкинской показало, что последняя отличается наиболее широкой вирулентностью, поскольку ежегодно на инфекционном фоне высевался большой набор образцов коллекции, в том числе относительно устойчивые сорта (Кутузова, 1985). В настоящее время сорта льна-долгунца, не поражающиеся ржавчиной, или поражающиеся в очень слабой степени благодаря защите доминантными генами устойчивости, занимают в нашей стране 88,5 % посевных площадей (Павлова, 2010; Лошакова, Павлова, 2010). Среди них доминантными генами защищены 56,1 %, а полигенной системой устойчивости - 29,3 % сортов (Кутузова, 2012). Долговечность устойчивости к облигатным патогенам сортов, защищенных R-генами, в первую очередь зависит от расового состава популяции возбудителя и его изменений. В задачу настоящей работы входило изучение изменения вирулентности, происходящих в популяции ржавчины льна в нашей стране за последние 43 года, чтобы определить степень опасности поражения возделываемых сортов. Материал и методы Многолетние наблюдения за развитием популяции M. lini проводились при изучении устойчивости образцов льна-долгунца из мировой коллекции ВИР в условиях инфекционно-провокационного фона, который с 1970 г. ежегодно создавали в Пушкинских лабораториях ВИР. В качестве инокулюма использовали телейтоспоры гриба. Прошлогоднюю солому со скоплениями телейтоспор гриба отбирали во время уборки с различных по устойчивости образцов льна и хранили в течение зимы в естественных условиях. В соответствии с методикой ВИР (Методич. указания, 1988) инфицированную солому раскладывали по всходам универсально восприимчивого (чувствительного ко всем расам M. lini) сорта-стандарта Danish-40 (к-6258), который располагали через 9 делянок тестируемых образцов. Естественное течение расообразовательного процесса в популяции патогена при этом не нарушалось. При оценке, которую проводили по поражению грибом в телейтостадии, определяли процент восприимчивых растений и средневзвешенный балл поражения по четырехбалльной системе. К устойчивым относили образцы без следов поражения (0). Имеющие небольшое число восприимчивых к болезни растений (до 10 %), или поражающиеся в слабой степени (балл 1), считали относительно устойчивыми; пораженные на балл 2 - восприимчивыми в средней степени, на баллы 3-4 - восприимчивыми в сильной степени. Так как при первичной оценке коллекции ежегодно на инфекционном фоне высевали 300-500 образцов льна, охватывающих широкое разнообразие по признаку устойчивости к ржавчине, можно полагать, что расовый состав патогена был достаточно разнообразным. О высокой плотности инфекции свидетельствует тот факт, что из 1600 получивших оценку образцов льна-долгунца 1430 поражались в сильной степени, и только у 170 выявлена некоторая степень устойчивости к патогену. Наиболее устойчивые из них высевали на инфекционном фоне ежегодно. Это позволило проследить их реакцию на заражение популяцией возбудителя ржавчины в течение многих лет, а значит, дает возможность судить о присутствии в ней рас гриба с комплементарными генами вирулентности. Материалом для настоящего исследования послужили 45 выделившихся по устойчивости образцов коллекции. О вирулентности популяции судили по степени поражения этих образцов, не расчленяя популяцию на расы и принимая, что устойчивость образца означает отсутствие рас, способных его поражать, а восприимчивость - наличие в ней вирулентных генов. Приводим результаты оценки образцов за 1978-1982 гг., на протяжении которых в популяции патогена происходили наиболее заметные изменения. Тестирование их в 2011-2012 гг. позволяет судить о том, насколько жизнеспособными и долговечными были расы, возникшие в эти годы. В соответствии с изначальной устойчивостью (1978 год изучения) исследуемые образцы были разделены на четыре группы: (1) относительно устойчивые; (2) со средней степенью устойчивости; (3) районированные сорта; (4) линии с частично эффективными генами устойчивости. Математическую обработку данных проводили с помощью MS Excel 2007 и программы Statistica 7.0 (дисперсионный анализ) (Ивантер, Коросов, 2003; Stat soft, 2013). Долю влияния фактора (η2, %) по Фишеру (года и генотипа) вычисляли по формуле: , где η2, % - доля влияния фактора, SSфактора - факторная сумма квадратов отклонений, SSобщая - общая сумма квадратов отклонений. Для оценки влияния вклада конкретного года или генотипа на результат дисперсионного анализа применяли апостериорное сравнение с использованием критерия достоверной существенной разницы Тьюки (ДЗР, HSD - Honestly significant difference, Tukey) (Наследов, 2005, Stat. Soft, 2013). Результаты исследования Многолетние наблюдения за устойчивостью к M. lini образцов из различных районов России и ряда зарубежных стран (табл. 1) свидетельствует о том, что у относительно устойчивых при первичной оценке образцов постепенно увеличивалось число восприимчивых растений и степень их поражения. К 1981 г. начали в слабой или средней степени поражаться практически все образцы, в том числе невосприимчивый ранее сорт Noralta из Канады (к-6783). Образец из Вятской области (к-1502) и чешский сорт Roland (к-5507) практически потеряли устойчивость. Оценка, проведенная в 2011 г. на жестком инфекционном фоне, показала повышение устойчивости большей части этих образцов, свидетельствующее о сужении вирулентности популяции гриба. При этом устойчивость части образцов вернулась к уровню 1978 г., а 7 - перестали поражаться, что означает отсутствие в популяции рас, к которым они были восприимчивы. Однако образец из Псковской обл. (к-1442) и сорт из Польши Millenium (к-6883) продолжали поражаться на том же уровне или даже сильнее, что указывает на наличие в популяции патогена вирулентных к ним рас. Эти же выводы подтверждают результаты тестирования ряда образцов, поражавшихся в 1978 г. в средней степени, которые к 1981 г. совершенно утратили устойчивость к ржавчине (табл. 2). По оценке в 2011 г. их поражение значительно снизилось, в ряде случаев до полной устойчивости. Так, местный образец из Омской обл. (к-970), Опочецкий кряж из Псковской обл. (к-1444), сорта Forrest (к-6609) из Австралии и Aoyagi (к-6746) из Японии перестали поражаться. Поражение ряда других образцов стало очень слабым, однако у местного льна из Тобольской обл. (к-1441) и венгерского сорта Adominsky (к-5959) процент пораженных растений остался довольно высоким, средний балл поражения также свидетельствовал о наличии вирулентных к ним рас. Значительная часть возделываемых в настоящее время сортов льна-долгунца районирована еще в 1980-е годы, когда ржавчина на посевах льна была распространена очень широко. Эти сорта поражались на инфекционном фоне в сильной степени (табл. 3). К 2012 г. практически все они стали относительно устойчивыми, а слабо поражающийся сорт Новоторжский перестал поражаться. Эти данные еще раз свидетельствуют о сужении к настоящему времени вирулентности популяции возбудителя ржавчины льна в нашей стране. Результаты оценки поражения линий шестого поколения инбридинга, выделенных из различных местных образцов и кряжевых льнов и имеющих по одному оригинальному доминантному гену устойчивости с частичной эффективностью (табл. 4), также свидетельствует, что пик расширения вирулентности популяции гриба наблюдался в 1980 г. Уже к 1981 г. часть линий перестала поражаться. Однако и в последующие годы в популяции гриба периодически появлялись в небольших количествах вирулентные к ним расы. Поскольку линии поддерживались в условиях искусственной изоляции, появление восприимчивой примеси исключено. Этот факт свидетельствует о возникновении новых, различающихся по вирулентности рас гриба. Двухфакторный дисперсионный анализ (год, генотип) для относительно устойчивых образцов (табл. 5 А) показал достоверное влияние года тестирования как на процент пораженных растений (η2 = 58 %), так и на балл поражения ржавчиной (η2 = 43 %). На последний также достоверно, но менее сильно, влияет и генотип сравниваемых линий (η2 = 25 %), то есть во время возделывания доля невосприимчивых растений у образцов осталась прежней, а изменилась только степень поражения восприимчивых. Выявлены достоверные попарные отличия между всеми годами исследования, кроме 1978 и 2011 как для степени, так и для балла поражения, свидетельствующие, что современная инфекционная нагрузка вернулась к уровню 1978 г. Критерий ДЗР Тьюки (табл. 6 А) не выявил достоверных попарных отличий между образцами, однако НСР критерий по Фишеру (наименьшей существенной разницы) подтвердил обособленность сорта Millenium. Дисперсионный анализ для выборки образцов со средней степенью устойчивости (табл. 5 Б) подтвердил достоверное влияние года на процент пораженных растений (η2 = 80 %) и на балл их поражения (η2 = 78 %). Критерий ДЗР Тьюки показал достоверные отличия 1980 и 1981 гг. от 1978 и 2011, однако существенных отличий между 1978 и 2011 гг. по обоим показателям обнаружено не было (табл. 6 Б). В 1980 и 1981 гг. растения этих образцов поражались одинаково. Дисперсионный анализ не выявил достоверного влияния генотипа образцов на исследуемые признаки. Дисперсионный анализ выборки возделываемых сортов (табл. 5 В) показал те же результаты, что и в предыдущей выборке, то есть достоверное влияние только года тестирования как на процент (η2 = 77 %), так и на балл поражения (η2 = 72 %), а критерий ДЗР Тьюки подтвердил достоверные отличия между годами (табл. 6 В). Дисперсионный анализ линий с частично эффективными генами устойчивости (табл. 5 Г) подтвердил прежние выводы о влиянии года возделывания на процент и балл поражения (η2= 38 и 49 %, соответственно). Критерий ДЗР Тьюки выявил достоверные отличия 1980 г. от остальных годов изучения (табл. 6 Г). Данные свидетельствуют о том, что на процент пораженных растений также достоверно влияет генотип сравниваемых линий (η2 = 37 %), которые по-разному отвечают на изменение расового состава патогена. Критерий ДЗР Тьюки выявил достоверные отличия только линии 1-2 из к-867 (Вотский кряж) от всех других по проценту пораженных растений (табл. 4), что обусловлено быстрым усилением восприимчивости до полной потери устойчивости, а к 2011 г. - восстановление устойчивости. Для обобщения влияния генотипа и условий года на поражение льна ржавчиной была использована суммарная выборка образцов (табл. 1, 2, 4). Двухфакторный дисперсионный анализ (год, генотип) показал достоверное, примерно равное влияние этих факторов на процент пораженных растений (η2 = 22 и 46 % соответственно) и балл поражения (η2 = 32 и 36 % соответственно, табл. 5 Д). Критерий ДЗР Тьюки подтвердил достоверные отличия 1980 и 1981 гг. от 1978 и 2011 гг., однако между 1978 и 2011 гг. по обоим признакам достоверных отличий обнаружено не было (табл. 6 Д), то есть эпидемиологическая обстановка в 2011 г. вернулась к состоянию 1978 г. Результаты опыта свидетельствуют о том, что расы с более широкой вирулентностью появляются регулярно, но большая их часть довольно быстро элиминируется из популяции патогена, при этом ее вирулентность остается на низком уровне. Обсуждение результатов Процесс появления и накопления рас с более широкой вирулентностью в популяции возбудителя ржавчины, который отчетливо прослеживался в 1978-1981 гг., не являлся преобладающим. Неоднократно были отмечены случаи, когда появившиеся новые расы нивелировались, или их численность в посевах льна снижалась. В последующие 30 лет спектр вирулентности гриба снизился настолько, что значительная часть образцов перестала поражаться и приобрела, таким образом, селективную ценность. Стабильно узкую вирулентность популяции патогена подтверждают также исследования ВНИИ льна (Крылова, 2002). Изменение вирулентности популяции M. lini в нашей стране с конца 60-х годов прошлого века до наших дней показывает, что она в основном зависит от степени и типа устойчивости возделываемых сортов (Кутузова, 2012). До 1970 г. практически все отечественные сорта льна-долгунца были сильно восприимчивы к ржавчине. Первые четыре относительно устойчивых сорта появились к 1970 г. (Крылова, 1970), в 1980-е годы их количество быстро возрастало и в 1983 г. они составляли уже 33 % (Кутузова, 2012). Как показали наши исследования, устойчивость всех этих сортов определялась полимерными генами, т. е. была горизонтальной, менее зависимой от расового состава патогена (Кутузова, 1979). По мере распространения сортов льна, защищенных устойчивостью этого типа, вирулентность популяции гриба и степень поражения возделываемых сортов снижались. К концу 1980-х годов они занимали 94 % площадей в стране, при этом распространение заболевания сократилось до 1-2 % в слабой степени пораженных посевов. К 1998 г. среднеустойчивые и высокоустойчивые сорта занимали уже 95,2 % площадей, ржавчина на производственных посевах льна в России больше не регистрировалась (Крылова, 2000). Первый сорт льна в России, защищенный доминантным геном устойчивости - Томский 16, появился в 1990 г., к настоящему времени более половины сортов обладают вертикальной устойчивостью. При этом количество восприимчивых сортов и сортов с горизонтальной устойчивостью неуклонно сокращается. Так, к 2009 г. число сортов с полигенной устойчивостью среди созданных во ВНИИ льна, основном селекционном учреждении по льну в России, снизилось с 35 до 15 % (Лошакова, Павлова, 2010). В 2010 г. большая часть отечественных сортов (около 60 %) была защищена R-генами с высокой эффективностью, и число таких сортов с каждым годом растет (рис. 1). Как показала мировая практика, защита посевов льна от ржавчинного гриба только R-генами может быть весьма опасной. Среди известных в мире 32 аллелей генов устойчивости, идентифицированных у культурного льна (Islam, Shepherd, 1991), в условиях России в настоящее время эффективны 17 - L4, L6, L8, L10, M, M2, M3, M4, M6, N, N1, P, P1, P3, P4, P6, K (Кутузова, 2014), тогда как в Северной Америке уже к 1978 г. их оставалось только 6 - L6, L11, M3, M6, P3 и P4, а в Южной Америке, где гриб зимует в уредостадии, поэтому расы способны закрепиться и размножиться, всего 2 - P4 и M6 (Wicks, 1978). Наибольшие опасения вызывает ситуация, когда при селекции сортов льна используются идентичные гены, или малое число генов, без учета территориального размещения генотипов. Такие гены способны обеспечить полную устойчивость сортов только на некоторое время, так как могут спровоцировать появление в популяции гриба супервирулентных рас и со временем вызвать новые эпифитотии. Заключение Многолетние наблюдения за изменением популяции гриба, вызывающего ржавчину льна выявили, что ее вирулентность в условиях нашей страны существенно изменялась: к 1980-81 годам появились расы с более широкой вирулентностью, что значительно усилило восприимчивость коллекционных образцов, в том числе селекционных сортов. В последующие годы эти расы в популяции патогена обнаружены не были. Основная роль в снижении распространения патогена и сужении вирулентности его популяции принадлежит широкому внедрению в льноводной зоне страны сортов, имеющих горизонтальную устойчивость, благодаря которой еще до появления первого сорта с вертикальной устойчивостью обеспечивалась спокойная эпидемиологическая обстановка в течение нескольких десятилетий. В настоящее время гриб под влиянием устойчивых сортов, защищенных разными типами устойчивости, перешел в депрессивное состояние (Кутузова, 2012). Определенную роль в этом процессе могли сыграть также сокращение занятых льном посевных площадей и неблагоприятные погодные условия для развития патогена - жаркая засушливая погода во время репродуцирования уредоспор, наблюдавшаяся в последние годы. Современные тенденции распространения защищенных R-генами сортов без учета оригинальности их генов могут нарушить сложившееся равновесие и привести к новому витку развития болезни. Как известно из мирового опыта, наиболее уязвимыми в такой ситуации будут моногенные сорта.

About the authors

Sofya Nikolaevna Kutuzova

N. I. Vavilov All-Russia Institute of Plant Industry (VIR)

Email: s.kutuzova@vir.nv.ru
Main researcher, Department of Oil and Fiber Crops Genetic Resources

Elizaveta Alexandrovna Porokhovinova

N. I. Vavilov All-Russia Institute of Plant Industry (VIR)

Email: e.porohovinova@vir.nw.ru
Senior researcher, Department of Oil and Fiber Crops Genetic Resources

Nina Borisovna Brutch

N. I. Vavilov All-Russia Institute of Plant Industry (VIR)

Email: n.brutch@vir.nw.ru
Leading researcher, Department of Oil and Fiber Crops Genetic Resources

References

Supplementary files