Manifestations of resistance to acaricides in inbred lines of two-spotted spider mite in the process of disruptive selection

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Паутинные клещи рода Tetranychus являются наиболее вредоносными фитофагами сельскохозяйственных культур. Около полутора десятков видов этого рода обитают более чем на 1100 видах растений 140 различных семейств. Вследствие очень короткого срока развития каждой генерации они обладают большим биотическим потенциалом и чрезвычайно быстро формируют резистентные популяции к применяемым против них акарицидам. Попытки создания научно обоснованной системы чередования используемых акарицидов, основываясь на различиях в механизмах их токсического действия для преодоления сформировавшейся резистентности, дают, как правило, разовый эффект и данная проблематика в течение многих десятилетий в научных публикациях не утрачивает своей актуальности. В отличие от проводившихся уже экспериментов на популяционных выборках паутинных клещей настоящее исследование выполнено на генотипах, полученных дизруптивным отбором инбредно культивируемых линий клеща. Основным выясняемым вопросом при этом являлось сходство и отличительные особенности биохимических механизмов, детерминирующих признаки резистентности к использованным в опытах инсектоакарицидам, относящихся к различным химическим классам. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Эксперименты проведены на обыкновенном паутинном клеще (Tetranychus urticae Koch). При дизруптивном отборе клещей с наличием или отсутствием признака резистентности к инсектоакарициду потомство селектируемых семей обрабатывали весовой (в %) диагностической концентрацией токсиканта - СК95 × 2 для чувствительных к нему клещей. Тестирование проводилось методом окунания в раствор токсиканта на кусочке кормового растения появившихся на этот момент в каждой семье самок, если их было не менее 7. В семьях, селектируемых по признаку проявления резистентности к токсиканту, обрабатывали всех самок, а в семьях, отбираемых по факту чувствительности к применяемому инсектоакарициду - по 5-10 особей из каждой семьи. В случае их 100%-й смертности, от самок таких семей получали новое потомство. Семьи клещей в дифференцируемых линиях содержали на листовых плотиках фасоли, раскладывавшихся на залитую водой вату. Для воспроизводства каждого нового поколения брали по 10 самок из трех семей со 100%-й смертностью и из трех-четырех семей с 0%-й смертностью после обработки селектирующим токсикантом. В опытах использованы препаративные формы инсектоакарицидов - диметоата (40 % к. э.[1] Би-58), бифентрина (10 % к. э. талстара), бромпропилата (50 % к. э. неорона) и абамектина (1,8 % к. э. вертимека). Для выявления механизмов, ответственных за выражение признаков резистентности к токсикантам были взяты также пиридабен (20 % с. п.[2] санмайта) и ингибитор системы цитохром Р450 монооксигеназ - пиперонил бутоксид (ППБ). Учет смертности клещей проводился через одни и трое суток после их окунания в раствор токсиканта. Вычисление концентраций СК95 выполнено методом пробит-анализа по Литчфильду и Уилкоксону (Беленький, 1959). Ошибка выборочной доли средних арифметических процента смертности клещей в поколениях дизруптивного отбора клещей рассчитывали по формуле: Sp (%) = p (100 - p) n , а коэффициент относительного рассеивания вариант - по формуле: v = Sp (%) x × 100 (Урбах, 1964). Разделение эстераз подопытных клещей проводили методом диск-электрофореза в гель-системе с 7,5 % разделяющим полиакриламидным гелем pH 7,5 и трис-вероналовым электродным буфером pH 7,0 (Маурер, 1971). Эстеразные фракции выявляли в инкубационной среде с 0,56 % 1-нафтилацетата и 0,2 % прочного синего RR в 0,2 М фосфатном буфере pH 6,9. Холинэстеразную фракцию и фракцию множественной молекулярной формы карбоксилэстеразы, активность которой увеличивалась у резистентных к акарицидам клещей, выявляли в инкубационной среде с бутирилтиохолин иодидом в 0,1 М фосфатном буфере pH 7,5 (Karnovky, Roots, 1964). Разделяемые образцы гомогената паутинных клещей для инкубационной среды с 1-нафтилацетатом готовили из 1-й и, в качестве дубля, 3 самок той же семьи в 40 мкл 40%-й сахарозы, а для тиохолиновой инкубационной среды - из 20 самок в 50 мкл 40%-й сахарозы, содержащей 1 % детергента - тритона Х-100. РЕЗУЛЬТАТЫ Селекция паутинных клещей на устойчивость и чувствительность к диметоату и бифентрину выявила сходный характер изменчивости проявления признака резистентности в поколениях дизруптивного отбора (табл. 1 и 2). Самки из семей полностью устойчивых к этим инсектоакарицидам производили новые семьи с различным количеством выживавших особей при тестировании их диагностическими концентрациями этих токсикантов. Суммарный среднестатистический показатель доли устойчивых к инсектоакарицидам клещей в 10 первых поколениях отбора, включая и семьи, где все особи были резистентными, составлял при селекции диметоатом около 65 %, а при селекции бифентрином - 75 %. В следующих 10 поколениях отбора диметоатом и бифентрином данные показатели в резистентных линиях существенно не менялись. При отборе потомства клещей, проявляющих чувствительность к действию этих токсикантов, в дочерних поколениях оказывались и устойчивые к этим инсектоакарицидам особи. Количество их в 10 поколениях отбора диметоатом было около 1 %, а при селекции бифентрином достигало в среднем 10 %. В следующих 10 дочерних поколениях количество клещей с признаком резистентности к диметоату увеличилось до 2,5 %, а при обработке бифентрином уменьшилось до такого же уровня. Совсем иное соотношение устойчивых и чувствительных генотипов в дочерних поколениях самок, по сравнению с селекцией клещей на устойчивость к токсическому действию диметоата и бифентрина, выявлено при их дизруптивном отборе абамектином. Самки из семей с полной выживаемостью клещей при обработке диагностической концентрацией абамектина в 10 первых поколениях отбора давали потомство, в котором только около половины общего количества особей были резистентными к этому инсектоакарициду. В следующих 10 генерациях среднестатистическое количество устойчивого к абамектину потомства клещей увеличивалось до 70 % (табл. 3). При селекции чувствительной к абамектину линии клеща в каждом поколении отбора с самого начала стабильно воспроизводились только особи, погибавшие при обработке диагностической концентрацией токсиканта. Появление единичных самок, выживавших в некоторых поколениях - в среднем менее 0,5 % во всех 20 генерациях (табл. 3), могло быть следствием возможных технических погрешностей эксперимента при окунании кусочков листа кормового растения с клещами в раствор токсиканта. Третий вариант количественного соотношения генотипов с признаком резистентности и с его отсутствием в поколениях дизруптивного отбора получен при селекции клещей бромпропилатом (табл. 4). От самок из полностью резистентных к бромпропилату семей в 10 первых поколениях отбора получали потомство, в котором по суммарному количеству особей было только около 30 % резистентных клещей. В следующих 10 поколениях селекции устойчивые к бромпропилату самки производили уже в среднем около 75 % резистентных к этому токсиканту особей. Селекция чувствительной к бромпропилату линии клеща давала в 10 первых генерациях в среднем около 80 % погибавших после обработки дискриминирующей концентрацией токсиканта особей, а после 20 поколения - около 90 % (табл. 4). Одной из основных причин таких различий фенотипического проявления признака резистентности в инбредных поколениях клеща при дизруптивном отборе инсектоакарицидами мог быть партеногенетический способ его размножения по типу арренотокии. Диплоидная гетерозиготная самка, копируя диплоидных дочерних самок, производит гаплоидных самцов двух типов - с гаметами резистентных и чувствительных к токсиканту аллелей. Эти самцы при инбредном размножении имеют равные шансы участвовать в воспроизводстве следующего поколения при случайном соотношении количественной реализации такой возможности. Как было выяснено гибридологическим анализом, из двух главных генов, детерминирующих признак резистентности к бромпропилату, один является доминантным, а дигенное наследование признака резистентности к абамектину было полностью доминантным (Сундуков и др., 2014). Доминантное состояние признака в инбредных поколениях дизруптивного отбора не позволяет освободиться от альтернативных чувствительных аллелей. Вследствие этого и после 20 поколений дифференциации генотипов паутинного клеща по признаку устойчивости к четырем использованным инсектоакарицидам в общем количестве самок каждого нового поколения сохранялось в среднем около 30 % чувствительных к селектирующим инсектоакарицидам генотипов. При дизруптивном отборе клещей на наличие альтернативного признака - чувствительности к токсикантам, выявлялись существенные различия его фенотипического выражения в дочерних генерациях при действии инсектоакарицидов различных химических классов. Наблюдаемое в чувствительной к диметоату линии некоторое увеличение количества появляющихся в новых поколениях резистентных особей в 10 первых генерациях отбора (табл. 1) не связано со спонтанной амплификацией генного локуса, кодирующего синтез множественной молекулярной формы карбоксилэстеразы, которая определяет проявление признака резистентности к фосфорорганическим соединениям (Вass, Field, 2011). Спонтанное умножение участков ДНК у членистоногих может происходить в одном поколении с частотой не более чем в 10-4 - 10-3 случаев (Сингер, Берг, 1998). Значительно большее количество выявляемых резистентных самок в 20 поколениях дизруптивного отбора, вероятно, было обусловлено тем, что в отсутствие главного гена, гены-модификаторы оказывали собственное действие на проявление признака резистентности. Селекция линии клеща на проявление чувствительности к бифентрину, напротив, происходила с уменьшением фенотипической изменчивости признака в 11-20 поколениях дизруптивного отбора (табл. 2), что можно объяснить процессом концентрации аллелей, детерминирующих чувствительность к токсиканту. Отсутствие резистентных особей в поколениях чувствительной к абамектину линии клеща (табл. 3) являлось следствием того, что оба главных гена, определяющие чувствительность клещей к этому инсектоакарициду, были рецессивными, а модифицирующих факторов, способных влиять на выражение признака резистентности к абамектину, в геноме самок чувствительной к абамектину линии не оказалось. Присутствие значительного количества резистентных генотипов во всех 20 генерациях дизруптивного отбора в чувствительной к бромпропилату линии клеща (табл. 4) можно объяснить тем, что один из двух главных генов, детерминирующих восприимчивость к токсическому действию инсектоакарицида, является доминантным. Предположение, что признак резистентности у клещей к абамектину и к бромпропилату может индуцироваться такими же мутациями, как и резистентность к инсектоакарицидам других химических классов, биохимические механизмы токсического действия и, соответственно, резистентности к которым считаются выясненными, проверяли тестированием клещей сопоставляемых линий диагностическими концентрациями этих токсикантов. Результат действия на резистентных и чувствительных к абамектину и бромпропилату клещей диагностической концентрацией бифентрина, свидетельствовал о том, что мутация, нивелирующая дефекты в потенциал-зависимых натриевых каналах, с которыми связывают проявление устойчивости членистоногих к пиретроидным соединениям, в геноме резистентных к абамектину и к бромпропилату клещей отсутствует. Высокий уровень смертности клещей чувствительных и резистентных к абамектину и к бромпропилату линий при действии бифентрина был одинаковым (табл. 5, 6). Проведенное тестирование сопоставляемых линий клеща диагностической концентрацией пиридабена показало, что способ противодействия нарушению процессов митохондриального электронного транспорта, рассматриваемый как основной механизм, определяющий устойчивость членистоногих к токсическому действию этого соединения, не входит в состав факторов, детерминирующих выражение признаков резистентности к абамектину и к бромпропилату (табл. 5, 6). Пиридабен одинаково действовал на выживаемость резистентных и чувствительных к этим токсикантам клещей. Перекрестное тестирование диагностической концентрацией бромпропилата клещей, отселектированных по наличию признака резистентности к абамектину и наоборот, показало, что резистентные и чувствительные к бромпропилату клещи проявляли такие же уровни устойчивости и к абамектину. Клещи резистентной и чувствительной к абамектину линий, напротив, были почти одинаково неустойчивы к токсическому действию диагностической концентрации бромпропилата (табл. 5, 6). Следовательно, признак резистентности к бромпропилату детерминируется комплексом факторов, включающих и те, которые обеспечивают защиту от отравления абамектином. Обработка клещей сопоставляемых линий диагностическими концентрациями селектирующих токсикантов с добавкой ППБ, который, как считается, ингибирует преимущественно цитохром Р450 монооксигеназную активность, синергистически усиливая действие токсикантов, достоверно снимая защиту, создаваемую генами резистентности при интоксикации и абамектином, и бромпропилатом. Это позволяет заключить, что индукция монооксигеназной активности включается в комбинацию факторов адаптивных модификаций, противодействующих отравлению этими инсектоакарицидами (табл. 5, 6). Результат тестирования клещей сопоставляемых линий диметоатом показал, что выражение признака резистентности и к абамектину, и к бромпропилату связано с индукцией карбоксилэстеразной активности. Уровень смертности клещей резистентных к абамектину и бромпропилату линий при действии диметоата был таким же, как и процент смертности самок клеща при действии диагностических концентраций селектирующих токсикантов (табл. 5, 6). Данный вывод подтверждается выявленными различиями в активности электрофоретически разделяемых эстеразных фракций у клещей сопоставляемых линий. У самок резистентных к абамектину и бромпропилату генотипов выявлялся более высокий уровень общей эстеразной активности с отличительно высокоактивной фракцией одной из множественных молекулярных форм карбоксилэстеразы (рис. 1). Наиболее предпочтительными субстратами для этого аллозима, как было выяснено ранее, являются карбоксиэфиры масляной кислоты (Leeuwen, Tirri 2007; Сундуков, 2012), что позволяет выявлять только эту множественную молекулярную форму карбоксилэстеразы вместе с фракцией ацетилхолинэстеразы, которая также гидролизует бутирилтиохолин иодид (рис. 1 в). По результатам проводившихся спектрофотометрических экспериментов суммарная удельная активность карбоксилэстеразы (в мк моль/мин/мг белка) у самок клещей из резистентных к диметоату семей была в 1,5 раза выше, чем у чувствительных к этому токсиканту особей, при одинаковой удельной активности ацетилхолинэстеразы (Сундуков, 2012). Уровень индуцируемой карбоксилэстеразной активности у резистентных к инсектоакарицидам генотипов, как известно из литературных источников, зависит, прежде всего, от запрограммированной кратности умножения локусов ДНК, кодирующих синтез этой множественной молекулярной формы фермента. Дополнительные копии какого-либо гена, образующиеся в результате его амплификации и обеспечивающие активацию регулируемой им ферментной системы, как известно, определяют доминантное состояние детерминируемого этим геном признака. Биохимические механизмы, определяющие выражение признаков резистентности у клещей к абамектину и к бромпропилату, как свидетельствуют полученные данные, должны различаться, следовательно, только по одному из двух главных генов - регулирующему изменение чувствительности периферических рецепторов к воздействию каждого из токсикантов. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Проявление устойчивости членистоногих к токсическому действию инсектоакарицидов реализуется двумя основными физиологическими механизмами. Уменьшением чувствительности периферических рецепторов, на которые изначально действует токсикант, и увеличением активности адаптивных ферментов, усиливающих компенсаторные реакции противодействия нарушениям физиологических функций, вызываемых действием токсиканта на нервную систему членистоногих. Индуцируемые системы адаптации ферментных систем, при вызывающем стресс химическом воздействии, усиливают энергетическое обеспечение и интенсификацию обменных процессов, что способствует повышению жизнеспособности членистоногих, а также экстренному выведению из организма токсичных ксенобиотиков, в случаях их возможного попадания во внеклеточные жидкости. Наиболее детально изучены к настоящему времени механизмы воздействия на периферические сенсорные окончания нервов пиретроидных инсектоакарицидов и авермектинов. Изменение чувствительности рецепторов к пиретроидам связывают с генетически детерминируемыми структурными перестройками аминокислотных последовательностей в натриевых каналах (Nyoni et al., 2011; Ya-ning et al., 2011). У резистентных к авермектинам членистоногих выявляются изменения в аминокислотных структурах воротного механизма рецепторов гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), регулирующих частоту открываний ионных каналов для трансмембранного перемещения анионов хлора (Dermauw et al., 2012; Kwon et al., 2010; Zhao, Salgado, 2010). На какие сенсорные окончания действуют галоидоорганические инсектоакарициды, к которым относится бромпропилат, литературные сведения не найдены. Фосфорорганические инсектоакарициды изначально блокируют периферические ацетилхолиновые рецепторы. В течение всего предшествующего периода изучения механизма токсического действия и резистентности членистоногих к этим соединениям интенсивно исследовали их антихолинэстеразное действие, ориентируясь на выясненную этиологию отравления фосфорорганическими ядами теплокровных животных. При этом игнорировались основополагающие обстоятельства, исключающие возможность такой аналогии. У членистоногих нервно-мышечная медиация биоэлектрических импульсов, в отличие от теплокровных, не является холинергической и погибают членистоногие при отравлении инсектоакарицидами этого класса не от асфиксии (Сундуков, 2012). В организме членистоногих при интоксикации фосфорорганическими инсектоакарицидами можно зафиксировать различную динамику ацетилхолинэстеразной активности в процессе развития патогенеза отравления, наряду с модификацией активности других ферментных систем. Однако прямая корреляция степени резистентности членистоногих к фосфорорганическим соединениям проявляется только с уровнем карбоксилэстеразной активности в их организме. Как подтверждено полученными экспериментальными данными, индукция карбоксилэстеразной активности является биохимическим фактором, определяющим выражение признаков резистентности к диметоату и к бифентрину (Сундуков и др., 2014), а также к абамектину и к бромпропилату (табл. 5, 6 и рис. 1). Увеличение активности этой ферментной системы при отравлении паутинных клещей фосфорорганическими инсектоакарицидами продемонстрировано многочисленными исследованиями. Индукция карбоксилэстеразной и монооксигеназной активности выявлялась также у паутинных клещей, резистентных к токсикантам других химических классов (Leeuwen et al., 2005, 2006). Повышенная активность карбоксилэстеразной и монооксигеназной ферментных систем у резистентных к инсектоакарицидам членистоногих, как можно заключить, является проявлением универсальной адаптивной реакции организма на воздействие токсиканта. Выявляемая электрофоретически множественная молекулярная форма карбоксилэстеразы может служить молекулярным маркером наличия у анализируемых генотипов паутинных клещей признака резистентности к применяемым инсектоакарицидам. Проведенный дизруптивный отбор паутинных клещей более чем на 100 поколениях инбредных линий не выявил никаких признаков инбредной депрессии или каких-либо отрицательных эффектов, связанных с гомозиготизацией рецессивных аллелей. Это свидетельствует о том, что инбредное скрещивание у клещей с гапло-диплоидным способом размножения является нормальным биологическим процессом. Поэтому, выявленные закономерности распределения аллелей, детерминирующих признаки резистентности к акарицидам различных химических классов в поколениях инбредных линий обыкновенного паутинного клеща, будут справедливы и для естественных популяций этого вида, а также для других видов тетраниховых клещей. Как показал статистический анализ, даже при жестком дизруптивном отборе паутинных клещей с мутацией резистентности к инсектоакарицидам, в семьях всех дочерних поколений сохраняется более четверти, от общего количества особей, чувствительных генотипов. Это позволяет считать, что в естественной среде при прекращении воздействия химического пресса в новых генерациях клещей должно происходить быстрое восстановление (реверсия) среднего уровня чувствительности к любым инсектоакарицидам.

About the authors

Oleg Veniaminovich Sundukov

All-Russian Institute of Plant Protection

Email: Sunduckov.oleg@yandex.ru
PhD, Senior scientist, Laboratory ecotoxicology

Irina Anatolievna Tulaeva

All-Russian Institute of Plant Protection

Email: zubanov63@rambler.ru
PhD, scientist, Laboratory ecotoxicology

Evgeniy Aleksandrovich Zubanov

All-Russian Institute of Plant Protection

Email: zubanov63@rambler.ru
PhD, scientist, Laboratory ecotoxicology

References

Supplementary files