Cytogenetic analysis of the residents of North Ossetia living in ecologically different regions

Full Text

Данные о потенциальном воздействии средовых загрязнителей на наследственность человека, их способности повреждать наследственные структуры, функцию репродуктивной системы, внутриутробное развитие, а также вызывать онкологические заболевания справедливо вызывают глобальную озабоченность (Бочков, 2003; Бочков, Дурнев, 2011; Минина с соавт., 2009; Boffetta, Nyberg, 2003; Hagmar, 2004; Merlo et al., 2007; Norppa et al., 2006; Vodicka et al., 2010). В условиях высокой антропогенной нагрузки в Республике Северная Осетия-Алания (РСО-А), и, в частности, индустриальном центре республики - г. Владикавказ (где сосредоточены предприятия цветной металлургии, металлообработки, машиностроения, развиты автотранспорт и др.) эта проблема особенно актуальна (Ревич, 2007). По данным ученых (Менчинская, 2004), (Скупневский, 2006), (Зенгелиди, 2009) и Северо-Осетинской агрохимлаборатории и Севосгеологоразведки в километровом радиусе от предприятия цветной металлургии показатели загрязнения почвы по 8 видам тяжелых металлов соответствуют категории чрезвычайно опасного загрязнения. Загрязненность почв остальной части городской территории относится к категории высокой опасности. Даже в дальних пригородных зонах по некоторым направлениям содержание тяжелых металлов в почвах остается опасным. Большое число экспериментальных исследований свидетельствует о генотоксических свойствах соединений тяжелых металлов (Бочков, Чеботарев, 1989; Дурнев, Середенин, 1998; Чопикашвили с соавт., 1989; Chervona et al., 2012; Coelhoa et al., 2013; Salnikow, Zhitkovich, 2008). Нестабильная экологическая обстановка и ухудшение общего состояния биосферы делают необходимым широкое использование генетического мониторинга. При этом генетические тесты имеют уникальное значение для оценки изменений, наступающих, как правило, до появления морфологических, физиологических, популяционных и других отклонений от нормы (Биологический контроль …, 2010; Battershill et al., 2008; Sram et al., 2007). Целью данной работы было определение частоты клеток с хромосомными аберрациями в культуре лейкоцитов крови жителей РСО-А из разных экологических мест проживания после аварии на металлургическом предприятии. Материал и методы Исследование проведено в клетках крови 55 жителей РСО-А: 47 взрослых и 8 детей (2 мальчика и 6 девочек). Половозрастная характеристика обследованных групп представлена в таблице 1. В группе взрослых было 13 мужчин (из них 5 курящих) и 34 некурящих женщин. Возраст варьировал у взрослых от 18 до 75 лет, средний возраст был равен 34 ± 3,2 года. Возраст детей варьировал от 8 до 17 лет и составил в среднем 14,6 ± 1,0 лет. Кроме того, один мальчик (15 лет) и 6 взрослых (средний возраст 31 ± 3,7) были обследованы дважды - до и после приема препарата «афобазол». Исследованные выборки различались по экологическим показателям условий мест проживания. Основными стационарными источниками загрязнения в г. Владикавказ являются два крупных металлургических предприятия: второй по величине металлургический завод в России ООО «Электроцинк» и завод «Победит». С 1905 по 1990 гг. завод «Электроцинк» перерабатывал концентраты полиметаллических руд Садонского свинцово-цинкового комбината (расположенного в горной части Осетии) и производил цинк, свинец, кадмий, серную кислоту, медь и ряд засекреченных редкоземельных металлов. За время работы завода на его территории скопились миллионы тонн высокотоксичных отходов производства. В октябре 2009 года на заводе произошла авария, в результате которой длительное время осуществлялись аварийные выбросы. Данное исследование проводилось после этой аварии. Известно, что в атмосфере Владикавказа содержится более 100 различных химических ингредиентов. К наиболее опасным и распространенным относятся диоксид серы, диоксид азота, оксид углерода, хлористый водород, аммиак, ряд тяжелых металлов и прочие. На территории Владикавказа выделен техногенный ореол рассеяния тяжелых металлов, в формировании которого основную роль играют аномальные и высокие концентрации свинца, кадмия, цинка, меди, серебра, ртути, мышьяка, вольфрама, марганца, индия, висмута, сурьмы и др. (Менчинская О. В., 2004). Особое географическое положение г. Владикавказ, который со всех сторон окружен горами, наличие безветрия или слабых ветров, снижает рассеивание вредных примесей в атмосфере, способствуя их накоплению в приземном атмосферном слое, вызывая загрязнение других природных сред, в том числе водоемов, донных отложений и почв. Обследованные жители были разделены на группы: I группу - 24 взрослых, проживающих на расстоянии более 5 км от предприятий цветной металлургии (эта группа была принята за контрольную для взрослых), II группу - 12 взрослых, проживающих на расстоянии 3-5 км от промышленных предприятий, III группу - 11 взрослых, проживающих на расстоянии до 3 км от предприятий, IV группу - 4 ребенка, проживающих на расстоянии 10-15 км от промышленных предприятий и V группу - 4 ребенка, проживающих на расстоянии до 5 км от предприятий. Кроме того, еще из 14 человек, проживающих на расстоянии до 5 километров от предприятий, были сформированы 2 равные группы для проверки влияния препарата «афобазол» на уровень аберрантных метафаз - VI и VII группы. Ввиду напряженной экологической ситуации в регионе часть жителей принимала антимутагенный препарат «афобазол» - селективный анксиолитик (2-[2-(морфолино)этилтио]-5-этоксибензимидазола гидрохлорид). Выбор лекарственного средства - «афобазол» и его суточная доза основывались на результатах исследований, свидетельствующих в пользу наличия у него антимутагенной и антитератогенной активности (Дурнев с соавт., 2010; Шредер с соавт., 2008). В работе использован афобазол производства ООО «Фармстандарт» в суточной дозе 30 мг в три приема перорально на протяжении 14 дней. В VI и VII группы вошли 7 жителей до и после приема афобазола соответственно (забор крови проводили через 24 часа после окончания курса). Цитогенетическое исследование проводили на препаратах метафазных хромосом лимфоцитов периферической крови, культивируемых в условиях in vitro, в соответствии со стандартной процедурой (Бочков, 1974). Цельную кровь (1 мл) культивировали макрометодом в культуральной смеси, состоящей из 7,5 мл среды RPMI 1640 («Sigma») и 1,5 мл эмбриональной сыворотки («BioClot») в пробирках объемом 15 мл. Для стимуляции деления клеток в пробирки добавляли по 0,01 мг фитогемагглютинина («ПанЭко»). Фиксацию клеточного материала осуществляли на 48-м часу культивирования. За 2 часа до фиксации в культуры добавляли колхицин (50 мкл), по окончании культивирования клетки обрабатывали гипотоническим раствором 0,55 % KCl при 37 ºС в течение 15 мин. Фиксацию клеточного материала проводили в трех сменах охлажденного этанол-уксусного фиксатора (3 : 1, общее время - 50 минут). Клеточную суспензию раскапывали на охлажденные предметные стекла, высушивали, шифровали и окрашивали 2%-м раствором красителя Гимза. На каждого донора анализировали от 100 до 300 метафазных пластин, на которых учитывали процент клеток с аберрациями хромосом; число одиночных фрагментов, хроматидных обменов, парных фрагментов и хромосомных обменов. Ахроматические пробелы в число аберраций не включали и учитывали отдельно (Бочков, 1974). Всего проанализировано 15 270 метафазных пластинок. Статистическую обработку фактического материала проводили с помощью программ «Microsoft Office Excel 2007» и «StatPlus 2009». Сравнение групп осуществлялось с помощью непараметрического рангового U-теста Манна-Уитни. Результаты Средняя частота клеток с аберрациями и средняя частота отдельных типов аберраций в культуре лимфоцитов жителей РСО-А, проживающих в разных районах республики представлена в таблице 2. Анализ результатов цитогенетического обследования взрослых и детей, проживающих в Северной Осетии, показал статистически значимые отличия уровней клеток с хромосомными аберрациями у лиц, проживающих вблизи от металлургического предприятия. Средняя частота аберрантных клеток в III группе статистически значимо отличалась от данного показателя обследованных из I группы (р ≤ 0,003). Во всех обследованных группах преобладающим типом аберраций были одиночные фрагменты, однако их доля была меньше предполагаемой для интактных популяций (Бочков, 2001; Дружинин, 2003; Sram et al., 2004). Увеличение частоты клеток с хромосомными аберрациями преимущественно достигалось за счет двухударных типов перестроек: парных фрагментов и хромосомных обменов. Как видно из таблицы 2 и рисунка 1 доля парных фрагментов возрастала с уменьшением расстояния места проживания от промышленного предприятия и в группе III была в 1,6 раз больше, чем в группе I (р ≤ 0,009). Во всех проанализированных группах взрослых (рис. 1) выявлено увеличение доли хромосомных обменов, что, видимо, можно объяснить тем, что зона негативного влияния от стационарных источников загрязнения распространяется по розе ветров на расстояние более 5 км (Менчинская, 2004). Кроме того, в непосредственной близости от металлургических заводов, в центре города, находятся места частого посещения жителями: высшие и средние учебные заведения, больницы и др. Как видно из таблицы 2 средняя частота клеток с хромосомными аберрациями зарегистрированных среди проанализированных групп детей значительно различалась (р ≤ 0,04). Так, в группе V по сравнению с группой IV средняя частота аберрантных метафаз выросла в 3 раза, при этом наблюдалось увеличение доли парных фрагментов и хромосомных обменов (рис. 2). Кроме того, в группе детей, проживающих вблизи от металлургического предприятия, зарегистрированы клетки, содержащие более 1 аберрации, тогда как в группе детей, проживающих на расстоянии 10-15 км от промышленного предприятия, таких клеток не выявлено. В результате сравнения средних частот клеток с хромосомными аберрациями у жителей Северной Осетии до и после приема «афобазола» обнаружены статистически значимые различия (4,0 ± 0,5 и 2,6 ± 0,4 соответственно, р ≤ 0,05). Анализ спектров хромосомных аберраций среди этих жителей показал снижение доли парных фрагментов (на 11,24 %) и хромосомных обменов (на 8,12 %) после антимутагенной профилактики (табл. 2, рис. 3). После приема «афобазола» у обследованных жителей снизилось количество клеток, имеющих более 1 аберрации - с 0,5 до 0,1 на 100 метафазных пластинок. Полученные результаты согласуются со сведениями о том, что производные 2-меркаптобензимидазола могут рассматриваться как наиболее эффективные среди известных антимутагенных соединений и проявляют защитные свойства по отношению к широкому кругу мутагенов (Дурнев, 2008). Таким образом, данные, полученные в ходе цитогенетического обследования взрослых и детей, проживающих в Северной Осетии, позволяют предположить существование региональной специфики фонового уровня хромосомных мутаций, что может быть вызвано общим фоном техногенного загрязнения окружающей среды, затрагивающим, так или иначе, всю территорию региона. Анализ количественного и качественного состава хромосомных аберраций позволяет предположить воздействие комплекса мутагенных факторов: химической и физической природы. Возможными причинами увеличения доли двухударных типов хромосомных аберраций, являющихся маркерами радиационного воздействия, у обследованных жителей являются факторы естественной и антропогенной природы. Это и факт многолетнего складирования радиоактивных отходов производства на заводских площадях в центре Владикавказа. Ранее радиационные отходы отправлялись на специализированный полигон в Грозненский «могильник». С 1992 г. из-за начала военных действий на территории Чеченской республики радиоактивные отходы оставались на заводской территории, на необорудованных промплощадках с нарушением правил хранения (Менчинская, 2004). Кроме того, мутагенность ионов кадмия частично связана с наличием в его природной смеси радиоактивного изотопа, который дает β-излучение (Рупошев, 1976; Рупошев, Гарина, 1976). Возможно, влияние и других причин, таких как повышенный в горной местности естественный радиационный фон и прочих. Таким образом, в результате проведенного цитогенетического обследования было выявлено статистически значимое превышение частоты клеток с хромосомными аберрациями в группе жителей, проживающих вблизи от промышленного предприятия осуществляющего аварийные выбросы токсичных веществ в окружающую среду, по сравнению с лицами, проживающими на расстоянии более 5 км (4,3 ± 0,5 % против 2,8 ± 0,3 % соответственно, р ≤ 0,003). У обследованных детей различия средних частот клеток с хромосомными аберрациями были (4,1 ± 0,7 % против 1,3 ± 0,5 % соответственно, р ≤ 0,04). Проведенный цитогенетический анализ среди лиц, принимавших антимутагенный лекарственный препарат «афобазол», показал, что после его приема статистически значимо снижается частота клеток с хромосомными аберрациями в крови жителей РСО-А, подверженных техногенной нагрузке.

About the authors

Fatima Taymurazovna Chshiyeva

NOSMA

Email: Fa-2009@yandex.ru
Researcher, Central scientific laboratory

References

Supplementary files