Population genetic structure and influence of MSTN gene polymorphism on economic and biological characteristics of rabbits

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Многолетняя практика мирового кролиководства позволила разработать различные методы и подходы создания новых, а также усовершенствование существующих пород: селекция на основании фенотипических проявлений признаков, построение оценочных и селекционных индексов, определение племенной ценности с использованием селекционно-генетической модели наилучшего линейного несмещенного прогноза (Garcia et al., 2011; Laborda et al., 2012; Drouilhet, 2013; Zomeno, 2013). С развитием молекулярной генетики стала возможной идентификация генов кроликов, асоциированных с качественными и количественными показателями продуктивности (Fontanezi et al., 2008; Peiro et al., 2008; Jiang M., 2008; Blasco, 2009). При этом дополнительно к традиционным методам отбора можно с успехом проводить селекцию в стадах, используя информацию о генотипах животных по аллелям SNP в этих генах (Fontanezi et al., 2008; Peiro et al., 2008). На сегодня становится очевидным то, что традиционное проведение отбора и подбора кроликов, а также применение молекулярно-генетических и селекционно-генетических методов, формируют комплексный подход к усовершенствованию различных пород сельскохозяйственных животных (Dekkers, 2004). Известно, что ген миостатина кроликов связан с формированием признаков мясной продуктивности. Он локализирован на седьмой хромосоме, входит в семейство трансформирующего фактора роста (TGF-β) и принимает участие в подавлении развития и дифференцировки скелетных мышц (Arvind et al., 2011). Мутации в гене миостатина, а также их фенотипические эффекты описаны у мясных пород крупного рогатого скота, а также у мышей, собак, человека (McPherron et al., 1997; Grobet et al., 1997). Однонуклеотидный полиморфизм гена миостатина кроликов впервые был описан группой итальянских ученых (Fontanezi et al., 2008). В связи с вышеизложенным, целью нашей работы было проведение анализа связи генотипа животных по аллелям SNP в гене миостатина с фенотипическим проявлением хозяйственно-ценных признаков. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ В работе использованы образцы крови кроликов новозеландской белой породы (174 головы) из кролефермы «Марчук Н. В.» (п. Ташлык, Смелянский район, Черкасская область, Украина). Геномную ДНК выделяли из периферической крови животных с использованием стандартного коммерческого набора «ДНК-сорб В» производства «Амплисенс» (Россия), согласно рекомендаций производителя. Генотипирование кроликов по аллелям SNP С34 Т в гене миостатина проводили методом ПЦР-ПДРФ (Alexander et al., 1988). Для проведения полимеразной цепной реакции в работе использовали реакционную смесь объемом 10 мкл: 1X ПЦР-буфер («Fermentas», Литва); 1 мM dNTP («Fermentas», Литва), 0,5 мкМ праймера («АмплиСенс», Россия), 0,6 единиц Taq-полимеразы («АмплиСенс», Россия) и 100 нг геномной ДНК. Амплификацию ДНК исследуемого гена проводили на программируемом четырехканальном термоциклере «Терцик» («ДНК- технология», Россия) с использованием следующих праймеров: 5'-TAACTGAAAAGAACCCTCTAGTAGC-3' и 5'-TCGGTAGTTGTTTCCCACTTT-3'. Условия и температурные режимы амплификации: 5 минут при 95 ºС («горячий старт»); 34 цикла: 30 с при 95 ºС, 30 с при 66 ºС, 60 с при 72 ºС, 5 минут при 72 ºС. Рестрикцию амплифицированных фрагментов проводили с использованием эндонуклеазы AluI («Fermentas», Литва), согласно рекомендаций производителя. ДНК фрагменты разделяли методом электрофореза в 2 % агарозном геле с последующим их окрашиванием в растворе бромистого этидия. Визуализацию осуществляли на трансиллюминаторе в ультрафиолетовом свете с последующим фотографированием электрофореграмм цифровой камерой. Для анализа связи полиморфизма С34 Т гена миостатина кроликов новозеландской белой породы с мясной продуктивностью применяли смешанную линейную модель (Henderson et al., 1985; Kyznecov, 2003): Yijk = gi + aij + bij + сij + ek где, Yijk - фенотипический показатель j-го животного; gi - фиксированный эффект генотипа (СС, СТ, ТТ); aij - эффект года рождения j-го животного (2 уровня); bij - эффект сезона года рождения j-го животного (4 уровня); сij - пол j-го животного (2 уровня); ek - остаточный эффект Популяционно-генетический и биометрический анализ полученных результатов проводили с использованием критерия χ2 Пирсона, Стьюдента и Фишера (Shebanina et al., 2008). Расчеты выполнены с использованием компьютерных программ: Popgene (Yeh et al., 1999), Statistica (Borovikov, 2001), GenStat (GenStat…, 13.11.2013) РЕЗУЛЬТАТЫ В данной работе проведено генотипирование кроликов новозеландской белой породы по аллелям SNP С34 Т в гене миостатина, результаты которого представлены на рисунке 1. Получены следуюшие данные: частота аллеля С составила 0,530, а Т - 0,470. На основании частот аллелей определено теоретически ожидаемое число генотипов для панмиксной популяции кроликов новозеландской белой породы (табл. 1). Анализ фактического и теоретического распределения генотипов кроликов по SNP С34 Т в гене миостатина позволил установить, что в популяции животных наблюдается равновесие в соответствии с законом Харди-Вайнберга (р > 0,05). Согласно данным полиморфизма С34 Т гена мостатина кроликов новозеландской белой породы была рассчитана ожидаемая гетерозиготность Но, фактическая гетерозиготность Не. Для исследуемой популяции животных Но равнялась 0,498, а значение Не было несколько ниже (0,460). Для анализа связи полиморфизма С34 Т гена миостатина кроликов новозеландской белой породы с мясной продуктивностью использовали два фенотипических признака: среднесуточные приросты и масса парной тушки (после убоя). Анализ влияния SNP С34 Т в гене миостатина на среднесуточный прирост кроликов позволил выявить следующие закономерности. Гетерозиготные особи с генотипом СТ имели показатели среднесуточных приростов выше, чем гомозиготы по аллелю С на 2,3 % (39,0 ± 0,3 г против 38,2 ± 0,2 г, tf = 2,3, tst = 2,09, p < 0,05). Значение среднесуточных приростов у гомозигот по аллею Т было ниже, чем у гетерозигот СТ на 2,6 % (38,2 ± 0,2 г против 39,0 ± 0,3 г, tf = 2,33, tst = 2,13, p < 0,05). Анализ распределения генотипов кроликов новозеландской белой породы по второму фенотипическому признаку позволил установить, что животные с генотипом СТ имели на 35,3 г выше массу парной тушки, чем среднее значение по стаду (p < 0,05) (табл. 2). Установлено что cтатистически значимым было влияние фактора генотипа, пола животных и сезона рождения на среднесуточные приросты (25 % - p < 0,05, 6 % - p < 0,05 и 7 % - p < 0,05 соответственно) (табл. 3). Влияние перечисленных выше факторов на реализацию второго фенотипического признака - масса парной тушки оказалось недостоверным. ОБСУЖДЕНИЕ В ряде научных работ показано, что возникновение однонуклеотидных замен в гене миостатина млекопитающих обуславливает ускоренное развитие мышечной ткани и появление так называемой «двойной мускулатуры животных» (Wiener et al., 2002; Grisolia et al., 2009). В нашей работе мы исследовали ассоциацию С34 Т полиморфизма гена миостатина кроликов с их хозяйственными и биологическими особенностями. Согласно соотношению количества генотипов СС, СТ и ТТ кроликов по аллелям SNP С34 Т в гене миостатина рассчитанная частота аллеля С составила 0,530, а аллеля Т - была в 1,13 раз меньше (0,470). Польские исследователи установили, что для кроликов новозеландской белой породы частота аллеля С составила 0,618, а частота аллеля Т - 0,382 (Rafayova et al., 2009). В результате генотипирования кроликов породы Польский гермелин они получили следующие данные: для аллеля С частота была равна 0,558, а для аллеля Т - 0,442. Другой группой китайских исследователей было установлено, что для популяции кроликов породы Шампань соотношение частот аллелей С: Т равнялась 0,580:0,420 (Peng et al., 2013). Кролики породы Тианфу имели следующие частоты аллелей относительно полиморфных вариантов гена миостатина: С - 0,760, а Т - 0,240. Cледует отметить то, что ученые, проанализировав генерализированную модель, в которую входили также генотип и пол ученые пришли к выводу, что полиморфные варианты гена миостатина кроликов имеют наибольшее влияние на проявление фенотипического признака живой массы в 84 дневном возрасте - 50 %. Степень влияния генотипа кроликов новозеланской белой породы на проявление признака среднесуточных приростов в нашей работе была в 2 раза меньшей (25 %). Тестирование случайной выборки кроликов новозеландской белой породы (n = 63), проведенной после заболевания животных эймериозом (кокцидиозом) показало, что распределение и соотношение генотипов имело статистически значимое отклонение от теоретически ожидаемого (df = 2, χst = 13,82, χf = 79,05, p < 0,001). Почти в три раза уменьшилась частота аллеля Т, который обусловливает функциональную активность миостатина (СMSTN - 0,797; ТMSTN - 0,203). Известно, что заболевание кроликов эймериозом сопровождается развитием воспалительных процессов в печени, а также параличом мышц конечностей (Hascourt-Brown F., 2002). С нашей точки зрения, животные-носители аллеля Т, у которых подавлено развитие и дифференцировка поперечно-полосатой мышечной ткани, имеют меньшую устойчивость к инфекционным заболеваниям с похожими симптомами. Возможно, гомозиготы по аллелю С имеют селективное преимущество перед гомозиготами по аллелю Т. С использованием REML линейной смешанной модели мы определили статистически значимое влияние генотипа на хозяйственно-биологические признаки кроликов (среднесуточные приросты, адаптивность к заболеваниям). Похожие результаты были получены итальянскими учеными (Fontanessi et al., 2011) при анализе фенотипического признака - среднесуточные приросты. С другой стороны, группа исследователей под руководством Bindu K. продемонстрировала, что однонуклеотидный полиморфизм С34 Т в гене миостатина кроликов ассоциирован с живой массой животных до убоя (разница между выборками статистически не значима) (Bindu K. et al., 2012). Полученные данные могут быть использованы для отбора желательных генотипов по аллелям гена миостатина.

About the authors

Kirill Vyacheslavovich Kopylov

Institute of Animal Breeding and Genetics NAAS of Ukraine

Email: kopylkir@ukr.net
Senior Researcher, Doctor of Agricultural Sciences. Department of Genetics

Yekaterina Vyacheslavovna Kopylova

Institute of Animal Breeding and Genetics NAAS of Ukraine

Email: kopylkir@ukr.net
Senior Researcher, Doctor of Agricultural Sciences. Department of Genetics

Andrey Vladimirovich Shelov

Institute of Animal Breeding and Genetics NAAS of Ukraine

Email: shelyov@mail.ru
Researcher, Candidate of Agricultural Sciences. Department of Genetics

Yevgeniy Anatolyevich Shevchenko

Institute of Animal Breeding and Genetics NAAS of Ukraine

Email: shevchenko.e.a.ser@gmail.com
Researcher. Department of Genetics

Aleksey Vasilyevich Berezovskiy

Institute of Animal Breeding and Genetics NAAS of Ukraine

Email: ol11111bz@gmail.com
Researcher. Department of Genetics

References

Supplementary files