Genetically modified microorganisms as producers of biologically active compounds

Abstract

In the review the data on use of genetically modified microorganisms as producers of proteins of different organisms are presented. The relative advantages and disadvantages of bacterial and yeast systems for heterologous genes expression are considered.

Full Text

Введение Достижения молекулярной биологии, генетики микроорганизмов привели к возникновению новой экспериментальной технологии - генетической инженерии. Появилась реальная возможность создания штаммов микроорганизмов с заданными свойствами, что оказало влияние на развитие современной биотехнологии, особенно, направления, связанного с микробиологическим синтезом белков высших эукариотических организмов, получение которых из традиционных источников затруднено. Для того чтобы производство биологически активных соединений микроорганизмами было рентабельным, необходимо использовать высокоэффективные штаммы-продуценты. Создание подобных продуцентов невозможно без знания особенностей организации генома и регуляции метаболизма микробной клетки. Поэтому неслучайно, первым объектом биотехнологии оказались бактерии Escherichia coli, у которых детально изучены процессы репликации, транскрипции, трансляции и механизмы регуляции активности генов. Возможность экспрессии гетерологичных генов в клетках E. coli была продемонстрирована более 40 лет назад (Cohen et al.,1973). Вскоре были получены первые штаммы - продуценты соматостатина и инсулина человека (Itakura et al.,1977; Goeddel et al., 1979). Началом эры биофармацевтических препаратов можно считать 1982 год, когда компания«Eli Lilly» (США) начала производство препарата Humulin® (рекомбинантного инсулина человека) (The, 1989). Сегодня на рынке биофармацевтических препаратов представлены гормоны, интерфероны, интерлейкины, факторы роста, факторы некроза опухоли, факторы свертывания крови, тромболитические препараты, ферменты, моноклональные антитела и вакцины. Рекомбинантные белки используются для лечения, профилактики и диагностики различных заболеваний, в том числе: диабета, рассеянного склероза, гепатитов В и С, анемии, тромбоцитопении, ревматоидного артрита, болезни Крона, злокачественных новообразований и др. (Глумсков, 2007; Ferrer-Miralles et al., 2009; Walsh, 2014). По данным компании «BCC Research» (США) мировой рынок биофармацевтических препаратов в 2013 г. составил 151,9 миллиарда долларов, в 2014 г. увеличился приблизительно до 157 миллиардов долларов (Global Markets…, 2014). Бактериальные системы экспрессии гетерологичных генов Достоинствами бактериальных систем экспрессии являются широкий выбор штаммов и промоторов для клонирования гетерологичных генов, относительная легкость генно-инженерных манипуляций, высокая скорость роста штаммов-продуцентов на недорогих средах, возможность соблюдения требований GMP (Good Manufacturing Practice) и высокий уровень продукции гетерологичных белков, достигающий 30 % от суммарного белка (Terpe, 2006; Demain, Vaishnav, 2009). Продукция интересующего белка в гетерологичном организме является сложным многоступенчатым процессом и включает в себя несколько этапов: клонирование структурного гена в векторе, содержащем промотор и терминатор транскрипции, трансформацию и стабильное поддержание гетерологичной ДНК в организме-продуценте; транскрипцию гена и синтез рекомбинантного белка и, наконец, очистку и анализ полученного продукта. Основными факторами, влияющими на уровень продукции гетерологичного белка, являются генотип штамма-продуцента, количество копий клонированного гена, эффективность транскрипции и трансляции, корректность процессинга и фолдинга синтезированного белка, устойчивость его к протеолизу. Выбор промоторов для экспрессии гетерологичных генов, в первую очередь, обусловлен силой промотора, т. е. его способностью обеспечивать высокий уровень транскрипции. В биотехнологии чаще используют сильные и регулируемые промоторы, что позволяет регулировать экспрессию гетерологичного гена и уменьшать негативные последствия воздействия гетерологичного белка на метаболизм продуцента. Такими промоторами у E. coli являются промотор лактозного оперона - lac, промотор триптофанового оперона - trp, гибридный промотор - tac, активность которых регулируется компонентами питательной среды; а также левый и правый промоторы фага λ - PLи PR, активность которых зависит от температуры (Makrides, 1996; Terpe, 2006). Использование экспрессионных векторов, полученных на основе мультикопийных плазмид и содержащих регулируемые промоторы, как правило, обеспечивает высокий уровень продукции гетерологичного белка без снижения жизнеспособности продуцента (Makrides, 1996). Эффективность трансляции гетерологичной мРНК зависит от количества редких для E. coli кодонов. Недостаток или отсутствие тех или иных тРНК может приводить к замедлению или преждевременной терминации трансляции, сдвигу рамки считывания и включению в полипептидную цепь неправильных аминокислот. Для продукции белков, содержащих редкие кодоны, модифицируют последовательность гена или используют штаммы E. coli, несущие дополнительные копии необходимых тРНК, или клонируют в других видах бактерий, например, Bacillus sp. (Yadava, Ockenhouse, 2003; Terpe, 2006). Повышению эффективности трансляции мРНК может способствовать энхансер трансляции (30 нуклеотидная последовательность гена atp E E. coli), помещенный перед сайтом связывания рибосом (Makrides, 1996).Увеличение стабильности гетерологичной мРНК, например, за счет включения последовательности 3’UTR гена cry Bacillus thuringiensis, повысило выход интерлейкина-2 человека в 4,6-7 раз (Wong, Chang, 1986). Существенным недостатком системы экспрессии E. coli является накопление гетерологичных белков в неактивном состоянии в виде «телец включения» (Thomas et al., 1997). Для перевода агрегированных белков в нативную конформацию требуются дополнительные процедуры, что уменьшает выход целевого белка. Долю агрегированных молекул гетерологичного белка удается снизить, варьируя компоненты питательной среды, условия культивирования штаммов-продуцентов, обеспечивая сверхпродукцию шаперонов и тиоредоксина (Makrides, 1996). Использование гибридных генов, состоящих из структурного гена гетерологичного белка и структурного гена тиоредоксина E. coli, позволило получить интерлейкины ИЛ-2, 4, 5 мыши и ИЛ-3, 6, 11 человека в растворимом состоянии и увеличить выход рекомбинантных белков до 5-20 % от суммарного белка клетки (Demain, Vaishnav, 2009). Для предотвращения протеолиза гетерологичных белков применяют различные подходы: используют в качестве продуцентов штаммы, лишенные активности протеаз; модифицируют аминокислотную последовательность для удаления потенциальных сайтов расщепления протеазами; оптимизируют условия культивирования (Murby etal., 1996). Бактерии E. coli не способны осуществлять один из основных типов посттрансляционной модификации белковой молекулы у эукариот - гликозилирование. Тем не менее бактериальные клетки используют для продукции гликопротеинов, у которых отсутствие углеводного компонента не влияет на их функцию. Так, биологическая активность рекомбинантного ИЛ-2 человека, полученного из E. coli («Пролейкин®»), не отличается от таковой гликозилированного ИЛ-2, выделенного из культуры клеток млекопитающих. Но наличие углеводного компонента повышает растворимость рекомбинантного белка, что имеет большое значение при использовании его в качестве лекарственного средства (Kamionka, 2011).В случае другого гликопротеина человека - β-интерферона (ИФН) -гликан существенно влияет на его стабильность и активность (Dissing-Olesen et al., 2008). Поэтому препараты, содержащие гликозилированный рекомбинантный ИФН-β из клеток ооцитов китайского хомячка («Ребиф», «Авонекс») обладают значительно большей биологической активностью по сравнению с препаратами, действующим началом которых является ИФН-β, полученный из клеток E. coli («Бетаферон») (Kamionka, 2011). При накоплении гетерологичного белка в цитоплазме E. coli не происходит образования дисульфидных связей. Секреция гетерологичного белка в периплазматическое пространство, где работают протеиндисульфидизомеразы семейства Dsb, позволяет частично решить эту проблему. В качестве сигнальных пептидов в основном используют N-концевые последовательности секреторных белков E. coli (щелочной фосфатазы, белков внешней мембраны, β-лактамазы, энтеротоксинов), а также других бактерий (белка А Staphylococcus aureus, эндоглюканазы Bacillus subtilis). В периплазме E. coli гетерологичные белки, кроме того, меньше подвергаются протеолитической деградации (Berlec, Strukelj, 2013). Например, секреция проинсулина человека в периплазму повышала время его полужизни в 10 раз (Mergulhao et al., 2005). Выход гетерологичных эукариотических белков с правильной конформацией, тем не менее относительно низок, что можно объяснить более высокой скоростью синтеза и фолдинга белка у прокариот по сравнению с эукариотами (Widmann, Christen, 2000). Еще одним обстоятельством, ограничивающим использование Е. coli для продукции белков эукариот, является пирогенность липополисахаридов их наружной мембраны, известных как эндотоксины, что значительно усложняет процедуру очистки рекомбинантных белков (Terpe, 2006). Несмотря на отмеченные недостатки, Е. coli по-прежнему используют для получения гетерологичных белков (табл. 1), основную часть которых составляют белки человека, используемые в качестве лекарственных и профилактических препаратов - гормоны (инсулин, инсулиноподобный фактор роста - IGF1, гормон роста, эритропоэтин); факторы роста (колониестимулирующий фактор - CSF, фактор роста кератиноцитов - KGF), цитокины (ИФН-α, ИФН-β, ИФН-γ; ИЛ-1, ИЛ-6; фактор некроза опухоли - TNF), ферменты и их ингибиторы и др. (Kamionka 2011; Kyriakopoulos, Kontoravdi, 2013). На фармацевтическом рынке России преобладают импортные биофармацевтические препараты. Тем не менее в последние годы в России организовано производство препаратов на основе рекомбинантных белков человека, полученных из клеток E. coli. Среди отечественных препаратов преобладает ИФН-α, который применяют для лечения вирусных заболеваний. Кроме того, производятся ИФН-β, составляющий основу терапии больных рассеянным склерозом; и гормоны - инсулин, соматотропин, эритропоэтин (Обзор рынка биотехнологий…, 2014). Бактерии E. coli не являются единственными представителями прокариотических микроорганизмов, используемых для продукции гетерологичных белков. В качестве альтернативы можно рассматривать грамм-положительные бактерии рода Bacillus, включая B. subtilis, B. brevis, B. megaterium, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. pumilus, преимуществом которых являются отсутствие пирогенных липополисахаридов во внешней мембране, что позволило присвоить им статус GRAS (generally recognized as safe) (Westers et al., 2004; Liu et al., 2013). Ранее Bacillus sp. успешно применяли для промышленного производства бактериальных ферментов, используемых в промышленности: щелочных протеаз, входящих в состав моющих средств, и амилаз для получения крахмала (Westers et al., 2004). За счет увеличения дозы генов определенных метаболических путей получены штаммы-продуценты биологически активных веществ небелковой природы: поли-γ-глутаминовой кислоты, используемой в пищевой и косметической промышленности; биодеградируемых поверхностно-активных соединений; рибофлавина и пр. (Liu et al., 2013). В настоящее время Bacillus sp. начинают все более активно использовать для продукции гетерологичных белков различного происхождения. Этому способствовало секвенирование генома B. subtilis, разработка эффективных методов трансформации, а также конструирование векторов экспрессии с сильными регулируемыми промоторами (Liu etal., 2013). Наиболее перспективными промоторами для экспрессии гетерологичных генов являются промотор гена cry, который активируется в стационарной фазе роста культуры; промоторы ксилозного и мальтозного оперонов - xyl и mal, активность которых регулируется при помощи катаболитной репрессии (Westers et al., 2004; Terpe, 2006; Liu et al., 2013). Как уже упоминалось, скорость и качество трансляции гетерологичной мРНК зависят от количества редких для организма-продуцента кодонов. По сравнению с E. coli, частота использования определенных изоакцепторных кодонов Bacillus sp. более оптимальна для продукции белков эукариотических организмов (Terpe, 2006). На эффективность трансляции также может влиять функциональное состояние рибосомы. Мутация в гене rpsL, кодирующем белок S12 30S субъединицы, повышала стабильность 70S рибосомы и увеличивала выход α-амилазы (Kurosawa et al., 2006). Немаловажным достоинством Bacillus sp. является высокий уровень секреции белков в культуральную среду, который для собственных белков может достигать 20-25 г/л (Liu et al., 2013). Продукция гетерологичных белков значительно ниже. Учитывая, что секреция белка упрощает его последующую очистку, проводится изучение механизмов секреции, регуляции этого процесса, определяются наиболее эффективные сигнальные последовательности. Результаты исследований позволили повысить секрецию гетерологичных белков, например, ИФН-α человека, в 2 раза (Westers et al., 2004; Liu et al., 2013). В зависимости от механизма секреции белки попадают в культуральную среду в свернутом состоянии (TAT-путь) или приобретают нативную конформацию после выхода на поверхность клетки (SEC-путь). Здесь же происходит образование дисульфидных связей (Westers et al., 2004). При высоком уровне секреции часть молекул гетерологичного белка может иметь неправильную конформацию. Коэкспрессия шаперонов, особенно шаперона PrsA, связанного с внешней стороной клеточной мембраны, примерно в 2,5 раза увеличивала продукцию антифибрина и антидигоксина с правильной конформацией (Westers et al., 2004). Выход секретируемых гетерологичных белков зависит от активности экстраклеточных протеаз Bacillus sp. Первоначально в качестве продуцентов чаще использовали клетки B. brevis, которые характеризуются низкой активностью протеаз (Terpe, 2006). В дальнейшем были изучены свойства экстраклеточных протеаз, определены их структурные гены, исследовано влияние отсутствия тех или иных ферментов на жизнеспособность бактерий, что позволило получить мутантные штаммы, лишенные активности 8 экстраклеточных протеаз. На основе этих мутантов были получены штаммы-продуценты, секретирующие от 1 до 3 г/л рекомбинантных белков - проинсулина и протеиндисульфидизомеразы человека; холерного токсина; бактериальной α-амилазы (Westers et al., 2004; Terpe, 2006). Список гетерологичных белков, синтезируемых Bacillus sp., постоянно растет и включает белки разных организмов (табл. 1), в том числе, ИФН-α, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-6, проинсулин, EGF человека, мышиный EGF, бактериальные и растительные фибринолитические протеазы, а также бактериальные α-амилазы, ксиланазы, липазы, карбоксиметилцеллюлазы (Westers et al., 2004; Terpe, 2006; Liu et al., 2013). Тем не менее ни один штамм-продуцент на основе Bacillus sp. пока не используется для промышленного производства рекомбинантных белков. Одной из причин этого, возможно, является необходимость значительных финансовых вложений для создания новых технологических регламентов и линий. Таким образом, прокариотические организмы могут быть использованы и используются для продукции гетерологичных белков. Около 30 % биофармацевтических препаратов, выпускаемых международными фармацевтическими компаниями, содержат в качестве действующего начала рекомбинантные белки бактериального происхождения (Ferrer-Miralles et al., 2009). В то же время, следует заметить, что бактериальные продуценты не способны синтезировать аутентичные эукариотические белки, требующие посттрансляционных модификаций. Проблему синтеза гетерологичных гликопротеинов может решить использование клеток млекопитающих. Существенным недостатком этих систем экспрессии является сложность работы с культурами клеток, дорогостоящие среды и относительно низкий выход продукта (Demain, Vaishnav, 2009; Bandaranayake, Almo, 2013; Berlec, Strukelj, 2013). Компромиссным решением является использование системы экспрессии дрожжей. Дрожжи являются эукариотическими микроорганизмами, поэтому способны обеспечивать корректную посттрансляционную модификацию белков человека и животных (Eckart, Bussineau, 1996). У дрожжей подробно изучены механизмы регуляции матричных процессов и метаболизма, при работе с ними используются стандартные методы генной инженерии, дрожжи легко культивировать на относительно дешевых субстратах. Длительный опыт использования дрожжей, свидетельствующий об их непатогенности, позволил присвоить им статус GRAS (Berlec, Strukelj, 2013). Применение системы экспрессии дрожжей позволяет сочетать простоту бактериальных систем экспрессии и качество белка, получаемое в культуре клеток млекопитающих. Система экспрессии гетерологичных генов на основе дрожжей Saccharomyces cerevisiae Начиная с начала 1980-х годов, дрожжи Saccharomyces cerevisiae успешно используют для продукции белков человека, животных, растений, особенно таких, которые трудно выделить в значительных количествах из традиционных источников (Romanos et al., 1992). Выбор именно этого вида дрожжей обусловлен тем, что они являются модельным объектом молекулярной генетики и вследствие этого прекрасно изучены. Для клонирования гетерологичных генов в дрожжах используют мультикопийные или интегративные плазмиды. В состав мультикопийных плазмид входит фрагмент нативной плазмиды дрожжей, 2 мкм ДНК, который и обеспечивает репликацию плазмиды. При помощи генетической инженерии сконструированы плазмиды, количество копий которых в клетке может достигать 200-400 (Erhart, Hollenberg, 1983). Интегративные плазмиды, содержащие последовательности гена рибосомной РНК или Ty-транспозона, которые присутствуют в геноме дрожжей в количестве 140 и 30-40 копий, соответственно, позволяет получать множественные встройки гетерологичного гена. Уровень продукции гетерологичного белка в этом случае может быть выше, чем у трансформантов с мультикопийными плазмидами (Lopes et al., 1989; Lee, Silva, 1996). Первые опыты по экспрессии гетерологичных генов в дрожжах показали, что эффективная экспрессия возможна только при наличии в составе вектора регуляторных последовательностей генов дрожжей, которые будут узнаваться ферментными системами клетки хозяина. Попытки использовать собственные промоторы для экспрессии чужеродных генов в дрожжах были неудачными. Промоторы генов дрожжей S. cerevisiae, используемые в биотехнологии У дрожжей S. cerevisiae наиболее сильными являются промоторы генов, кодирующих структуру ферментов гликолиза. Это связано с тем, что основным путем катаболизма сахаров у дрожжей является гликолиз, в результате которого глюкозо-6-фосфат или фруктозо-6-фосфат превращаются в пируват. Дальнейшее превращение пирувата зависит от условий культивирования и вида дрожжей. У дрожжей S. cerevisiae, которые являются факультативными анаэробами, независимо от условий выращивания утилизация сахаров происходит в результате брожения (Johnston, Carlson, 1992). Для гетерологичной экспрессии в клетках дрожжей чаще всего используют промоторы структурных генов алкогольдегидрогеназы - ADH1; основного изозима глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы - GPD3 (TDH3); 3-фосфоглицераткиназы - PGK1, триозофосфатизомеразы - TPI1. Первым примером удачного использования в биотехнологии промоторов генов, кодирующих ферменты гликолиза, было клонирование гена ИФН-α человека под контролем ADH1 промотора. Рекомбинантные дрожжи синтезировали биологически активный ИФН-α, содержание которого составляло 1-2 % от суммарного белка (Hitzeman et al., 1981). Аналогичные результаты были получены при использовании GPD3 промотора (Bitter, Egan, 1984). Экспрессия гена S, кодирующего поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg), продемонстрировала принципиальную возможность получения рекомбинантных субъединичных вакцин в дрожжах. Количество рекомбинантного белка варьировало от 1-2 % (при использовании ADH1 и PGK1 промоторов) до 2-4 % (при использовании GPD3 промотора) (Valenzuela et al., 1982; Hitzeman et al., 1983; Bitter, Egan, 1984). При этом HBsAg присутствовал в виде липопротеидных агрегатов, похожих на комплексы, которые образуются в клетках млекопитающих, и давал положительную реакцию со специфическими антителами (Hitzeman et al., 1983). В 1986 г. был получен штамм-продуцент предшественника инсулина человека, в котором экспрессию гетерологичного гена контролировал TPI1 промотор. Клетки дрожжей синтезировали и секретировали одну полипептидную цепь, содержащую А, В субъединицы инсулина и про-пептид С, который удаляли in vitro при помощи трипсина и карбоксипептидазы В (Thim et al.,1986). Вскоре компания «NovoNordisk» начинает промышленное производство инсулина человека (Bill, 2014). Несмотря на примеры удачного использования промоторов гликолитических генов для экспрессии гетерологичных генов, их применение в биотехнологии ограничено. Существенным недостатком этих промоторов является постоянно высокий уровень транскрипции генов, находящихся под их контролем (Moore et al., 1991). Это сопровождается повышением концентрации гетерологичного белка в клетке и может оказывать отрицательное влияние на метаболизм, скорость роста и жизнеспособность клеток дрожжей. Селективное преимущество будут получать клетки, содержащие меньшее количество копий рекомбинантной плазмиды, что приведет к снижению продуктивности штаммов (Nonaka et al., 2000). Поэтому более перспективным является использование регулируемой экспрессии гетерологичных генов. При таком подходе удается разделить стадии роста штамма-продуцента и синтеза чужеродного белка и, таким образом, снизить метаболическую нагрузку на клетки дрожжей. Для экспрессии гетерологичных генов чаще всего используют промоторы генов, контролирующих метаболизм галактозы или фосфата. В утилизации галактозы принимают участие продукты многих генов, экспрессия которых в разной степени репрессируется глюкозой и индуцируется галактозой. Уровень транскрипции генов GAL1, GAL7, GAL10 в присутствии галактозы повышается в 1000 раз. В регуляции экспрессии GAL-генов принимают участие белок активатор Gal4p и белок репрессор Gal80p. Количество Gal4p в клетке дрожжей крайне мало (около 160 молекул на клетку) (Johnston, Carlson, 1992).Сайты связывания белка активатора в промоторах генов GAL1, GAL7, GAL10 расположены на участках, свободных от нуклеосом, что облегчает связывание Gal4p и способствует быстрой индукции экспрессии регулируемых генов (Lohr, 1997). Выяснение механизмов регуляции экспрессии GAL- генов позволяет использовать различные подходы для создания эффективных штаммов-продуцентов гетерологичных белков. Фактором, лимитирующим уровень экспрессии гетерологичного гена, клонированного под контролем промотора GAL-генов, может оказаться низкое содержание Gal4p в клетке дрожжей. Одним из способов повышения концентрации белка активатора является увеличение дозы гена GAL4. Одновременное клонирование в мультикопийной плазмиде гена GAL4 и гена lacZ E. coli под контролем промотора гена GAL1 увеличивало продукцию β-галактозидазы в 10 раз, но при этом нарушалась регуляция, и рекомбинантный белок синтезировался на среде с глюкозой (Porro et al., 1992). В то же время клонирование гена GAL4 и гена gp350 вируса Эпштейна-Барра под контролем GAL10 промотора позволило сохранить регуляцию транскрипции и повысить синтез соответствующего белка в 10 раз (Schultz et al., 1987). Тем не менее штаммы с суперпродукцией Gal4p редко используют в качестве продуцентов гетерологичных белков. Это связано с многочисленными побочными эффектами: снижением скорости роста, нарушением целостности цитоплазматической мембраны (Martegani et al., 1993). Строгая регуляция транскрипции GAL-генов, а также быстрая и эффективная индукция их экспрессии делают промоторы этих генов одними из наиболее часто используемых регулируемых промоторов для экспрессии гетерологичных генов в дрожжах. Не менее популярным является промотор гена РНО5 - структурного гена кислой фосфатазы 2 дрожжей. Кислая фосфатаза 2 - основной изозим репрессибельной кислой фосфатазы дрожжей. Экспрессия гена РНО5 происходит только в отсутствие неорганического фосфата и регулируется на уровне транскрипции факторами позитивного и негативного контроля (Toh-e et al., 1975; Кожин и др., 1986). К позитивным регуляторам относятся белки, кодируемые генами PHO2, PHO4, PHO81 (Oshima, 1982; Самбук и др., 1988), негативными регуляторами являются белки, структуру которых определяют гены PHO80 и PHO85 (Ueda et. al., 1975).Один из сайтов связывания основного белка активатора Pho4p в промоторе гена РНО5 находится в межнуклеосомном участке (Lohr, 1997). В условиях дерепрессии Pho4p связывается с этим сайтом, обеспечивает сдвиг нуклеосом и открывает дополнительный сайт связывания для Pho4p, а также для Pho2p (Svaren, Horz, 1997). Присоединение белков активаторов инициирует транскрипцию гена РНО5. Одним из первых примеров применения промотора РНО5 в биотехнологии было клонирование гена S, кодирующего структуру HBsAg. Уровень продукции рекомбинантного белка и HBsAg частиц практически не отличался от того, что наблюдали при клонировании гена S под контролем сильных промоторов гликолитических генов, и составлял 4 % и 0,02 % суммарного клеточного белка, соответственно (Miyanohara et al., 1983). Определенным недостатком данной системы экспрессии является необходимость использования сред с низким содержанием неорганического фосфата для индукции транскрипции гена РНО5, а также всех генов, находящихся под контролем этого промотора. Известно, что снижение концентрации неорганического фосфата в среде сопровождается активизацией процесса брожения, приводит к быстрому накоплению этилового спирта, уменьшению клеточной биомассы и, соответственно, выхода рекомбинантного белка (Zurbriggen et al., 1989). Сложная многоступенчатая система регуляции экспрессии гена РНО5, казалось бы, открывает возможность целенаправленного изменения штаммов-продуцентов гетерологичных белков, но, как и в случае GAL-системы экспрессии, возможности усовершенствования штаммов-продуцентов за счет изменения регуляции транскрипции гена РНО5 весьма ограничены. Использование мутантов pho80 и pho85 в качестве штаммов-продуцентов не приводило к желаемому результату, т. к. конститутивная экспрессия гетерологичного гена и индукция синтеза белка отрицательно сказывалась на жизнедеятельности дрожжевой клетки (Miyanohara et al., 1983). При увеличении количества Pho4p синтез основного белка p24 вируса лейкемии крупного рогатого скота (BLV) становился конститутивным, происходило снижение скорости роста штаммов-продуцентов и уменьшение выхода гетерологичного белка (Dumont et al., 1989). Несмотря на отмеченные недостатки, примеры использования РНО5 промотора в биотехнологии достаточно многочисленны. Так, под контролем РНО5 промотора были клонированы гены, кодирующие цитокины человека и животных: ИФН-α1, ИФН-α2, ИФН-α16 (Kramer et al., 1984; Schaber et al., 1986; Мясников и др., 1988 б), ИФН-β (Падкина и др.,1998), ИЛ-2 человека (Мясников и др.,1988 а), ИФН-γ быка (Мясников и др., 1989). Во всех случаях клетки дрожжей синтезировали биологически активные белки. Уровень продукции зависел от конкретного белка и варьировал от 1 мг ИФН-β до 30 мг интерлейкина-2 человека на литр культуральной жидкости. Эффективность экспрессии гетерологичного гена в клетках дрожжей также зависит от терминатора, который необходим для корректного процессирования матричной РНК, включающего терминацию транскрипции и полиаденилирование. Нуклеотидные последовательности, отвечающие за формирование 3’-конца матричной РНК у дрожжей, менее консервативны по сравнению с высшими эукариотами (Guo, Sherman, 1995). Общей чертой этих нетранслируемых последовательностей является высокое содержание АТ-нуклеотидов. Несмотря на то, что в терминаторе дрожжей есть последовательность, совпадающая с консервативным сигналом полиаденилирования млекопитающих, а сайты присоединения поли-(А)-последовательности одинаковы, дрожжи не способны узнавать сигналы полиаденилирования высших эукариот, и терминаторы высших эукариот, как правило, не функционируют в клетке дрожжей (Trachtulec, Forejt, 1999). Поэтому для обеспечения нормальной терминации транскрипции гетерологичных генов используют терминаторы генов дрожжей. Известно, что большинство генов высших эукариотических организмов содержат интроны. Интроны обнаружены и в генах дрожжей, тем не менее дрожжи не способны обеспечить корректный сплайсинг гетерологичной эукариотической мРНК, поэтому для клонирования в дрожжах используют кДНК копии (Trachtulec, Forejt, 1999). Синтез гетерологичных белков Элонгация трансляции может оказаться лимитирующей стадией при синтезе гетерологичного белка, если мРНК содержит много редких для дрожжей кодонов аминокислот. Предпочтительное использование определенных триплетов определяется уровнем соответствующих тРНК и аминоацил-тРНК-синтетаз. При отсутствии или недостатке определенных изо-акцепторных тРНК происходит замедление трансляции, возможно встраивание ошибочных аминокислот и преждевременная терминация (Eckart, Bussineau, 1996). В результате будет снижаться уровень продукции гетерологичного белка и/или будут синтезироваться измененные молекулы (мутеины). Мутеины могут быть иммуногенны, поэтому их присутствие нежелательно в препаратах медицинского назначения. Для решения этой проблемы можно модифицировать чужеродный ген таким образом, чтобы он не содержал редких для дрожжей кодонов. Именно такой подход использовали для продукции в клетках дрожжей протеазы возбудителя малярии Plasmodium falciparum (Withers-Martinez et al., 1999; Yadava, Ockenhouse, 2003) и белков пшеницы Р450 и Р450-редуктазы, определяющих ее устойчивость к гербицидам (Batard, 2000). В то же время, существуют примеры высокого уровня продукции гетерологичных белков, транскрипты которых содержат редкие для дрожжей кодоны аминокислот. В первую очередь следует отметить супероксиддисмутазу человека. Более того, за счет слияния ее кДНК с другим клонируемым геном удавалось увеличить выход интересующего гетерологичного белка. В виде таких гибридных белков в дрожжах были успешно синтезированы проинсулин человека (Cousens et al., 1987) и белки оболочки вируса иммунодефицита (HIV) (Barr et al., 1987). Основная масса гетерологичных белков накапливается в клетках дрожжей, как и в клетках бактерий, в виде «телец включения» (Cousens et al., 1987; Thomas et al., 1997). Одной из основных причин образования подобных агрегатов, по-видимому, является недостаток соответствующих шаперонов. Дефицит шаперонов при гетерологичной экспрессии может быть обусловлен как высокой скоростью синтеза гетерологичного белка, так и более продолжительным временем его фолдинга, что приводит, в свою очередь, к уменьшению пула шаперонов, способных выполнять свои функции. Действительно, уровень продукции люциферазы и GFP (green fluorescent protein) в дрожжах строго зависел от Ydj1p, одного из Hsp40p. Отсутствие этого шаперона приводило к резкому снижению эффективности трансляции гетерологичной мРНК (Brodsky et al., 1998). Примеры положительного влияния увеличения концентрации Hsp70 на выход гетерологичных белков у дрожжей показаны, в основном, для секреторных продуктов (Sudbery, 1996). Использование в качестве продуцентов гетерологичных белков штаммов дрожжей с суперпродукцией тех или иных шаперонов не всегда приводит к желаемому результату. Суперпродукция белков теплового шока имитирует реакцию клетки на определенные стрессорные факторы - повышение температуры, увеличение концентрации активных радикалов кислорода, голодание - и может сопровождаться снижением уровня экспрессии генов, кодирующих белки рибосом и шаперонов Ssb1 и Ssb2 (Lopez et al., 1999). Одним из основных факторов, определяющих уровень продукции рекомбинантных белков, является их стабильность или устойчивость к деградации. Стабильность гетерологичных белков можно повысить, если экспрессировать их в виде гибридных молекул, в которых интересующий полипептид слит с супероксиддисмутазой (Cousens et al., 1987; Barr et al., 1987) или с убиквитином (Sabin et al., 1989). В деградации гетерологичных белков могут участвовать вакуолярные протеазы, а секретируемые белки могут расщепляться также протеазами эндоплазматического ретикулума (ЭР), участвующими в процессинге белков, и экстраклеточными протеазами. Использование pep4-3 мутантов дрожжей, лишенных активности вакуолярных протеаз, увеличивало продукцию фактора роста фибробластов и IGF1 человека (Barr et al., 1988; Bayne et al., 1988). Предотвратить фрагментацию секретируемых β-эндорфина, ИФН-α, паратиреоидного гормона, альбумина человека и ряда других белков удалось только при использовании в качестве штаммов-продуцентов мутантов, у которых отсутствовали протеазы аппарата Гольджи (АГ) - Kex2p и/или Yap3p (Kang et al., 1998; Kerry-Williams et al., 1998). Секреция гетерологичных белков Секреция гетерологичных белков в культуральную среду имеет определенные преимущества по сравнению с внутриклеточной продукцией. В процессе секреции образуются дисульфидные связи, которые стабилизируют третичную структуру белка, а также происходят посттрансляционные модификации, необходимые для функциональной активности многих гетерологичных белков. Кроме того, секреция гетерологичного белка значительно упрощает его очистку, а также позволяет избежать возможного токсичного влияния продукта на клетку дрожжей. Структура и функции секреторного аппарата дрожжей и млекопитающих практически не отличаются, поэтому дрожжи могут синтезировать секреторные белки человека (FV фрагмент моноклональных антител, рецептор эритропоэтина, тромбомодулин, липазу, коллагеназу фибробластов, интерлейкин 8 и пр.). В качестве сигнальных последовательностей чаще всего используют препропептид α-фактора (MFα1) дрожжей (Idiris et al., 2010). Фолдинг секреторных белков В формировании нативной структуры белка в полости ЭР принимают участие шапероны ЭР и фольдазы, в частности, ферменты, катализирующие образование дисульфидных связей. У дрожжей шаперон Kar2p, локализованный на внутренней стороне мембраны, способствует транслокации полипептидной цепи в полость ЭР и обеспечивает фолдинг белковой молекулы (Zapun et al., 1999). Образование дисульфидных связей, которое катализирует протеиндисульфидизомераза (Pdip), является важнейшим этапом процессирования секреторных белков в ЭР (Zapun et al., 1999). Клетки дрожжей содержат все вспомогательные белки, необходимые для обеспечения нативной конформации гетерологичных секреторных белков. Но при суперпродукции гетерологичного белка шапероны и фольдазы могут не справляться со своими функциями, что приводит к появлению вЭР агрегатов несвернутого белка, которые переносятся в цитоплазму и расщепляются в протеасоме. Очевидно, что гетерологичные белки конкурируют с белками дрожжей за связывание с шаперонами и ферментами ЭР, и суперпродукция рекомбинантного белка может отрицательно сказываться на секреции дрожжевых белков. Для повышения уровня белков ЭР, участвующих в фолдинге, можно клонировать соответствующие структурные гены в составе мультикопийных плазмид под контролем сильных промоторов. Увеличение числа копий гена KAR2 восстанавливало рост дрожжей-суперпродуцентов протеиназы Rhizopus niveus (Umebayashi et al., 1999), повышало выход прохимозина быка (Harmsen et al., 1996), гирудина (Kim et al., 2003), глюкозидазы Pyrococcus sp. (Smith et al., 2004), но, в то же время, не влияло на секрецию растительного белка тауматина (Harmsen et al., 1996), CSF 3 человека, ингибитора трипсина быка, кислой фосфатазы Schizosaccharomyces pombe (Robinson et al., 1994). Одновременная сверхпродукция Kar2p и кошаперонов семейства Hsp40 повышала уровень продукции альбумина и трансферина человека (Payne et al., 2008). При сверхпродукции Pdi1p клетки дрожжей более эффективно секретировали как белки с дисульфидными связями, так и без них (Hou J. et al., 2012). Эти данные свидетельствуют о том, что уровень секреции в большей степени зависит от свойств гетерологичного белка. Гликозилирование секретируемых белков В процессе секреции происходит наиболее сложная модификация белков - гликозилирование. Ковалентное присоединение олигосахаридов к полипептидной цепи имеет значение для фолдинга белка и стабилизации его структуры. Углеводный компонент играет важную роль в функционировании гликопротеинов и оказывается вовлеченным в процессы связывания гормонов с рецепторами, антител с антигенами, в опознавание клеточных рецепторов и межклеточный сигналинг, во взаимодействие различных микроорганизмов с клеткой хозяина (Imperiali, O’Connor, 1999). Существует два типа гликозилирования белков: N-гликозилирование, при котором присоединение углеводных остатков происходит к аспарагину, и О-гликозилирование, когда углеводные остатки прикрепляются к серину или треонину. Первые этапы N-гликозилирования, протекающие на мембране и полости ЭР, не отличаются у дрожжей и млекопитающих и заканчиваются формированием корового олигосахарида, состоящего из 2 остатков N-ацетилглюкозамина и 9 остатков маннозы. Однако изменения структуры углеводного компонента гликопротеинов, которые происходят в АГ, существенно различаются у разных организмов. У млекопитающих часть манноз удаляется или замещается галактозой, фукозой, сиаловой кислотой. У дрожжей S. cerevisiae синтезируется маннан с разветвленной внешней цепью, включающей до 200 маннозных остатков. Структура олигосахарида при О-гликозилировании белков у дрожжей и млекопитающих также отличается (De Pourcq et al., 2010). Гетерологичные гликопротеины, секретируемые дрожжами S. cerevisiae, содержат ковалентно связанные олигосахариды, типичные для дрожжей (De Pourcq et al., 2010). Гипер