Morphogenetic analysis of populations of Helix pomatia L. (Pulmonata, Helicidae) on the south-eastern and eastern part of the current area

Full Text

Введение Виноградная улитка (Helix pomatia Linnaeus, 1758) является одним из самых крупных наземных моллюсков. Исходным ареалом и, по всей видимости, центром происхождения этого вида являются районы Средней и Юго-Восточной Европы. Современный ареал виноградной улитки, обусловленный интродукцией, охватывает Поволжье, западные районы Белоруссии, Украину и Прибалтику, включая г. Калининград, (Стародубцева, Дедков, 2003; Артемьева, Семенов, 2004; Румянцева, 2006). Кроме того, моллюск был интродуцирован в ряд городов, таких как Санкт-Петербург, Курск, Москва, Харьков и др. (Величковский В. А., 1910; Белецкий, 1918; Лихарев, Раммельмейер, 1952). Есть сообщения об интродукции H. pomatia на территории Финляндии (Jarvinen et all., 1976) и США (Dees, 1970). Такое искусственное расселение объясняется тем, что виноградная улитка издавна считалась ценным гастрономическим объектом, в связи с чем на территориях, ранее представлявших собой частные парки, поместья, усадьбы и т. п., проводились попытки акклиматизации H. pomatia с целью введения вида в культуру, зачастую успешные. Помимо населенных пунктов, куда был завезен данный вид, его популяции в некоторых районах натурализовались в естественных лесных сообществах, имеющих природоохранный или культурно-исторический статус. Результатом интродукции H. pomatia в чужеродные, но, как оказалось, вполне пригодные для натурализации данного вида биогеоценозы, явилось возникновение многочисленных, географически изолированных популяций виноградной улитки, которые являются хорошими объектами для научных исследований микроэволюционных явлений, происходящих в современных урбанизированных ландшафтах. По всей видимости, точное число территориально обособленных популяций H. pomatia, существующих в настоящее время, неизвестно, но некоторые из них являются объектами для проведения эколого-генетических исследований. Несколько работ было посвящено изучению популяционной структуры данного вида на основе анализа морфологических признаков (Pollard, 1975; Хлус, Хлус, Грицюк, 2001; Крамаренко, Сверлова, 2005; Сверлова, 2005; Andreev, 2006; Хлус, 2007) и аллозимных маркеров (Vincent, Magron, 1972; Wahren, Tegelström, 1973; Tegelström et al., 1975). На территории юго-восточной и восточной части современного ареала H. pomatia подобные исследования ранее не проводились. Цель настоящей работы - провести анализ популяционной структуры H. pomatia в условиях урбанизированных ландшафтов Восточной Европы с использованием конхиометрических признаков и изоферментных маркеров для изучения микроэволюционных явлений, происходящих в популяциях данного вида. Материал и методика Сбор материала Материалом для исследования служили живые моллюски H. pomatia и их пустые раковины. В наших предыдущих работах были изучены три популяции, обитающие в городах Белгород и Харьков (Снегин, 2010; Артемчук, Снегин, 2012). В настоящей работе количество исследуемых популяций было увеличено до двенадцати (рис. 1, табл. 1). Учитывая прямую зависимость активности особей H. pomatia от влажности окружающей среды, наиболее массовые сборы свободно ползающих особей осуществляли обычно через некоторое время после дождя. Помимо ручного сбора открыто ползающих особей, проводили поиск экземпляров, находящихся в состоянии временного анабиоза (с устьем, закрытым эпифрагмой) в различного рода укрытиях на поверхности почвы, а также в её рыхлом поверхностном слое и лесной подстилке. Кроме того, в ряде случаев также осуществляли сбор пустых раковин улиток для морфометрических исследований. Морфометрический анализ Измерение раковин проводили по стандартной схеме (Шилейко, 1978): большой диаметр раковины (БДР), малый диаметр раковины (МД), высота раковины (ВР), высота устья (ВУ), ширина устья (ШР), высота завитка (ВЗ), ширина завитка (ШЗ). Вычисляли площадь устья (S = (3,14 · ВУ · ШУ) / 4) и объем раковины (V = (БДР 2 · ВР) / 2), а также индексы ВР/БД, ВУ/ШУ, ВЗ/ВР, ВЗ/ШЗ и V/S. Для анализа использовались только раковины закончившие рост и образовавшие отворот на устье. Электрофоретический анализ ферментов Для проведения электрофоретического анализа использовались кусочки тканей ноги, взятые у живых моллюсков. Учитывая небольшой объем отбираемого на исследование материала, а также высокую регенеративную способность улиток, удалось избежать умерщвления животных. Экстракция водорастворимых белков производилась при помощи трис-HСl-буфера (рН = 6,7) с последующей механической гомогенизацией, циклом замораживания-оттаивания и центрифугированием образцов в течение 20 минут в центрифуге Eppendorf 5424 при 10 000 об./мин. Электрофорез проводили в камере VE-3 (Helicon) в 10 % полиакриламидном геле (разделяющий гель рН = 8,9 и концентрирующий гель рН = 6,7; электродный трис-глициновый буфер рН = 8,3). Для выявления неспецифических эстераз гели инкубировали в смеси: трис-HСl-буфер (рН = 7,4), α-нафтилацетат, прочный красный TR. Перед окрашиванием гель инкубировали в холодном растворе борной кислоты (3 %). Для выявления супероксиддисмутаз использовали инкубационную смесь: калий-фосфатный буфер (рН = 7,8), НТС, ФМС, MgCl2; для выявления малатдегидрогеназ: трис-HСl-буфер (рН = 8,4), НТС, ФМС, НАД, L-малат натрия. На электрофореграммах ферментов H. pomatia нами были определены границы двух локусов неспецифических эстераз EST3 и EST4[1] (мономеры с тремя аллелями), один локус супероксиддисмутазы SOD2 (димер с двумя аллелями) и один локус малатдегидрогеназы MDH1 (димер с двумя аллелями) (рис. 2). Полученные результаты анализировали при помощи программы GenAlex 6.4. (Peakall, Smouse, 2001), MEGA5 (Tamura et al., 2011), Statistica 6.0. Результаты и обсуждение Результаты морфометрического анализа демонстрируют неоднозначную картину (табл. 2). С одной стороны, получены достоверные отличия изученных популяций, как по абсолютным показателям промеров раковины, так и по индексам. Значительную оригинальность исследуемых популяций по метрическим характеристикам подтверждает результат однофакторного дисперсионного анализа (табл. 3), согласно которому по всем конхиометрическим признакам внутрипопуляционные вариансы достоверно превосходят межпопуляционные (Р < 0,05). С другой стороны, кластеризация выборок по конхиологическим признакам не выявила какой-либо зависимости средних параметров раковины от географического положения группы (рис. 3). Например, в один и тот же кластер со смежными популяциями «Житомир» (№ 9), «Киев» (№ 10), «Харьков» (№ 8) и «Яблоново» (№ 11) попала довольно удаленная от них группа «Быково» (№ 12). А популяции из окрестностей г. Белгород (№ 2, 4, 6, 7) попали в разные кластеры. Существует представление, что метрические характеристики раковины являются индикаторами тех климатических зон, в которых обитают улитки. Вместе с тем стоит отметить, что это положение справедливо в тех случаях, когда речь идет о естественном местообитании аборигенных видов, генофонды которых формировались длительное время. Все анализируемые нами популяции виноградной улитки являются адвентивными и сравнительно молодыми (хотя некоторые из них существуют не менее 100 лет - пункты 8 и 11). Кроме того, эти группы приурочены к урбанизированным территориям, где городская среда создает определенный микроклимат, который может сильно отличаться от зонального климата. Известно, что у мезофильных видов моллюсков, к которым относится H. pomatia, увеличение размеров тела (а соответственно и раковины) свидетельствует о более благоприятных значениях характера увлажнения, температуры и кормообеспеченности (Лихарев, Раммельмейер, 1952; Goodfriend, 1986). В нашем случае, если следовать этому правилу, то можно ожидать увеличение размеров тела виноградной улитки по мере продвижения с северо-востока на юго-запад. Однако такой клинальной изменчивости мы не наблюдаем. Самые крупные особи H. pomatia отмечены в восточной популяции г. Курска (пункт 3), а также в самой западной из изученных популяции г. Житомир (пункт 9). В других крупных городах (Киев, Харьков, Белгород) улитки обладают достоверно меньшими морфометрическими показателями, сходными с северными группами из г. Тверь (пункт 1) и Подмосковья (пункт 12). Это отчасти подтверждает предположение, согласно которому в урбанизированных ландшафтах у H. pomatia происходит уменьшение размеров раковины (Хлус, Хлус, 2001). Вместе с тем есть данные, опровергающие это предположение (Сверлова, 2005). Причина такого несоответствия, вероятно, кроется в том, что вариации размера раковины определяется особенностями популяционных генофондов[2]. Происхождение адвентивных колоний может быть различным и их аллельный состав, а соответственно и размерные характеристики особей, во многом могут определяться генофондами родительских популяций, сформировавшихся в иных климатических зонах. На форму раковины может оказывать определенное влияние рыхлость почвы. В период летней засухи и в зимний период улитки зарываются глубоко в почву. Поэтому в плотном грунте идет отбор на более вытянутую раковину. Кроме того, это способствует увеличению основного локомоторного органа - ноги, с помощью которого улитки зарываются, а увеличение ноги сопровождается увеличением относительного размера устья. Особи с наиболее вытянутыми раковинами, имеющие наибольшие значения индекса ВР/БДР, отмечены в пунктах «Майский» и «Белгород». Особи с относительно более крупным устьем отмечены в пунктах «Тверь» и «Киев». Улитки с наиболее прижатым завитком и уплощенной раковиной характерны для популяций «Яблоново». Данная группа, обитающая в Валуйском районе Белгородской области, была отмечена еще в начале XX века (Величковский, 1910) и является единственной из изученных популяций натурализовавшейся в естественной среде. В настоящее время эта популяция, вероятно, находится в состоянии депрессии. Здесь нами было найдено только три живых экземпляра, поэтому сравнительный анализ нам удалось провести, используя только раковины отмерших моллюсков. Частоты аллелей и уровни гетерозиготности по используемым локусам представлены таблице 4. В 27,2 % случаев отмечается достоверный (P≥0,05) дефицит гетерозиготных фенотипов[3], в 29,5 % процентов случаев выявлена гомозиготность по одному из аллелей. Достоверный избыток гетерозигот зафиксирован только в одном случае (пункт 5, локус EST4). В остальных случаях достоверных различий между фактической и теоретической гетерозиготностью не отмечено. Наиболее мономорфной популяцией оказалась самая западная из изученных групп, обитающая в г. Житомир (табл. 5). Также пониженные значения показателей генетической изменчивости характерны для популяций из пунктов 2 и 8, а наибольшие значения коэффициента инбридинга отмечены в популяциях из пунктов 3, 9, и 10. При этом по разным локусам уровень гетерозиготности неодинаков в различных популяциях. Гетерозиготные варианты чаще всего встречаются в локусах EST4 (H0 = 0,398) и MDH1 (H0 = 0,271). Именно эти локусы вносят наибольший вклад в межпопуляционное разнообразие, оцениваемое по коэффициенту инбридинга Fst (табл. 6). Это вероятно, связано с различной селективной значимостью изучаемых локусов и с различными направлениями отбора в изучаемых популяциях. Кроме того, нельзя исключать, что данное явление является результатом дрейфа генов из-за так называемого «эффекта основателя» (Майр, 1968). Стоит отметить, что в изучаемых популяциях нами зафиксирована достоверная корреляция между объемом раковины и коэффициентом инбридинга (RF/V = 0,598±0,214, t = 2,79, P < 0,05). Объяснить это явление довольно сложно. В качестве рабочей гипотезы можно предположить следующее. Вопреки бытующему мнению, согласно которому увеличение инбридинга ведет к снижению жизненного потенциала популяций (например, Charlesworth, Willis, 2009), у многих организмов, особенно у малоподвижных видов и видов, способных к самооплодотворению (к которым относятся наземные моллюски), есть механизмы, препятствующие инбридинговой депрессии. Например, при искусственном разведении гигантских устриц (Crassostrea gigas) отмечено, что угнетающее действие инбридинга проявлялось, как правило, в снижении выживаемости на личиночных стадиях и слабо приспособленные особи не вовлекались в последующие скрещивания и тем самым из популяции удалялись вредные рецессивные аллели. Выжившие и достигшие половозрелости особи инбредных линий по темпу роста и выживаемости не отличались от устриц из естественных мест обитания (Холодов и др., 2010). Аналогичные данные были получены в опытах с жуком Stator limbatus (Fox et al., 2008). Кроме того, у паразитических трематод Coitocaecum parvum отмечено, что особи, получившиеся в результате самооплодотворения, не отличались по жизнеспособности от особей, рожденных при ауткроссинге (Lagrue, Poulin, 2009). В случае с виноградной улиткой нельзя исключать, что некоторые адвентивные группы могли быть основаны единичными особями. В ходе близкородственного скрещивания (а возможно и аутомиксиса[4]) после достижения инбредного минимума отбор мог способствовать выживанию улиток с наиболее удачными генетическими комбинациями, побочным эффектом действия которых было увеличение размеров животных. Сохранению инбредных линий мог способствовать конкурентный вакуум, в котором оказались адвентивные группы[5]. В дальнейшем, вполне возможно, происходило ассортативное скрещивание, в ходе которого наиболее крупные особи предпочитали образовывать пары с себе подобными. Довольно сильную генетическую дифференциацию изучаемых популяций демонстрирует анализ молекулярной дисперсии (AMOVA, Excoffier et al., 1992). Индекс дифференциации Фst = 0,291 незначительно превосходит аналогичный индекс, полученный с помощью F-статистики Райта Fst = 0,254 (табл. 7). При этом на долю межпопуляционного разнообразия (Vар) приходится 30 %, на долю внутрипопуляционного (Vwp) - 70 %, что соответствует уровню дифференциации у других изученных нами ранее аборигенных фоновых видов наземных моллюсков, обитающих в естественных биотопах района исследования (Bradybaena fruticum: Фst = 0,300, Fst = 0,228, Vар / Vwp = 30 / 70 %; Chondrula tridens: Фst = 0,295, Fst = 0,198, Vар /Vwp = 30 / 70 %) (Снегин, 2012). Результаты кластерного анализа на основе генетических расстояний (Nei, 1978) невзвешенным парногрупповым методом (UPGMA) (рис. 4) показывают весьма неоднозначную картину распределения популяций по группам. При этом степень сходства популяций по частотам аллелей изоферментов, в отличие от раковинных фенотипов, отчасти зависит от их географического положения. Данный факт отражен в регрессионном анализе между попарными значениями логарифмов уровня потока генов между популяциями (logNm) и логарифмов географических дистанций между ними (logD) (рис. 5). Коэффициент корреляции R = -0,525 ± 0,117 (t = 4,5 P < 0,001) указывает на имеющуюся обратную зависимость между этими показателями, что соответствует эффекту изоляции расстоянием, который характерен для селективно нейтральных генов. Согласно этой модели, по мере увеличения географических дистанций между популяциями увеличивается степень генетических различий между ними. Если локусы подвержены действию стабилизирующего отбора, то эффект изоляции расстоянием должен отсутствовать (Slatkin, 1993). Таким образом, согласно этим представлениям, может создаться впечатление, что используемые нами генетические маркеры являются селективно нейтральными, и наблюдаемые различия между популяциями являются следствием генетического дрейфа. Однако данная модель характерна для описания географически и исторически связанных популяций, и вряд ли применима для случайно возникающих адвентивных колоний H. pomatia. Например, популяции, обитающие в г. Белгороде и его окрестностях разбились на два удаленных друг от друга кластера: в один попали группы из пунктов 2, 4, 7, а в другой - 5, 6. Также в один из этих кластеров попала популяция из г. Житомира (пункт 9), а в другой - популяции из г. Харькова (пункт 8) и г. Твери (пункт 1). Еще один кластер образовали значительно удаленные друг от друга популяции из г. Курска (пункт 3), г. Киева (пункт 10) и Московской области (пункт 12). Такое атипичное распределение популяций по разным кластерам, полагаем, можно объяснить дрейфом генов и разными направлениями естественного отбора под влиянием микроклиматических и биотопических условий городской среды, которые, как уже нами было отмечено, могут значительно отличаться от зональных характеристик[6]. Эффективная численность исследуемых популяций улиток была рассчитана по формуле, учитывающей уровень инбридинга в популяции (Ли, 1978): . Для получения сопоставимых данных мы вычислили отношение эффективного размера выборки к ее общему объему (табл. 5). Согласно полученным значениям, в среднем соотношение Ne/N равно 0,870 ± 0,043, что укладывается в общий диапазон доли Ne, предложный Кроу, Мортоном и Кимурой (Crow, Morton, 1955; Crow J. F., Kimura M., 1970)[7]. Кроме того, среднее значение доли Ne, полученное для H. pomatia, достоверно превышает аналогичные значения, полученные для аборигенных фоновых видов наземных моллюсков, обитающих в районе исследования: Br. fruticum - 0,800 ± 0,021, Ch. tridens - 0,661 ± 0,013 (Снегин, 2012), что косвенно указывает на высокий уровень жизнеспособности изучаемых популяций виноградной улитки. Заключение Таким образом, полученные результаты дают представление о структуре расселения и о состоянии популяционных генофондов H. pomatia в условиях урбанизированных ландшафтов юго-восточной и восточной части современного ареала. Согласно полученным данным, большинство популяций этого моллюска находятся в удовлетворительном состоянии. Об этом говорят большие значения эффективной численности, высокий уровень гетерозиготности и пониженный инбридинг. Повышенная гомозиготность некоторых популяций может быть вызвана различными причинами. Либо это относительно старые группы, и, соответственно, более длительно существующие в изолированном состоянии, либо эти группы появились недавно, но были основаны небольшим количеством особей. Стоит отметить, что представленные результаты можно считать отправной точкой для дальнейшего мониторинга этого вида с целью выяснения особенностей эволюционных процессов, происходящих в его популяциях.

About the authors

Eduard Anatol'yevic Snegin

Belgorod national research university

Email: snegin@bsu.edu.ru
Dr.Biol.Sci., senior lecturer, head of department of biocenology and ecological genetics

Olesya Yur'yevna Artemchuk

Belgorod national research university

Email: ris-med@yandex.ru
postgraduate of department of biocenology and ecological genetics

References

Supplementary files