DNA damage in placenta and embryos of rats exposed to peat smoke; antigenotoxic effects of afobazole

Full Text

Введение Лесные и торфяные пожары - масштабное биосферное явление, служащие источником загрязнения воздуха сложной смесью продуктов горения растительной биомассы и органических отложений. Различные газы, полидисперсные твердые микро- и наночастицы и летучие органические соединения, образующиеся в этом процессе, рассматриваются как потенциально опасные поллютанты. Их воздействию подвергается все больше людей, поскольку масштабность природных пожаров в районах крупных мегаполисов возрастает, что определяет необходимость разработки соответствующих лечебных и профилактических мер, направленных на предупреждение и купирование патогенетических эффектов экспозиции дымами на здоровье человека [1, 19]. Эпидемиологические исследования свидетельствуют о поражениях дыхательной и сердечно-сосудистой систем, а также возникновении цереброваскулярных, гемостатических и репродуктивных нарушений у лиц, находящихся в зонах задымленности [1, 15]. Вместе с этим открытым остается вопрос о генотоксических эффектах и отдаленных генетически обусловленных последствиях воздействия задымлений. В предыдущих исследованиях было показано, что экспозиция торфяным дымом беременных крыс вызывает эмбриотоксические эффекты и нарушения постнатального развития у потомства. Анксиолитик афобазол, обладающий цитопротекторными, антитератогенными и антимутагенными свойствами, значимо снижал выявленные негативные эффекты [2, 3]. В экспериментах с экспозицией табачным дымом была показана сопряженность эмбриопротекторных и антигенотоксических эффектов афобазола [1]. Целью настоящего исследования явилась оценка поврежденности ДНК в клетках плацент и эмбрионов крыс, подвергнутых принудительной экспозиции торфяным дымом, и возможности их коррекции афобазолом. Материалы и методы Исследования проводили на беспородных белых крысах массой 240-270 г (питомник РАМН «Столбовая»). Животных содержали в условиях вивария ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» при 12-часовом режиме на стандартном сбалансированном брикетированном корме, со свободным доступом к воде и пище, при естественной освещенности, температуре воздуха 20-21 °С. Все эксперименты проводили в соответствии с международными правилами (European Communities Council Directive of November 24,1986 (86/609/EEC)) и правилами работы с животными, утвержденными этической комиссией ФГБНУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова. Самцов и самок крыс ежедневно вечером ссаживали попарно в отдельные клетки. Утром после ссаживания у каждой крысы брали вагинальный мазок. Ссаживание прекращали при обнаружении сперматозоидов в вагинальных мазках. День обнаружения сперматозоидов рассматривали как первый день беременности. Животных с 1-го по 13-й день беременности подвергали принудительному ингаляционному воздействию торфяного дыма с использованием оригинальной установки в пластиковых камерах объемом 72 дм3. В камеры помещали по 5-6 животных одновременно. Задымление камеры проводили путем вдувания дыма от четырех последовательно сгорающих бумажных гильз (0,46 г каждая), наполненных смесью, состоящей из 70 % торфа и 30 % древесной массы (производитель ООО «Эксторф»). Время сгорания каждой гильзы составляло 6 минут, общий срок экспозиции торфяным дымом - 44 минуты. Афобазол (фармакологическая субстанция, синтезированная в НИИ фармакологии имени В.В. Закусова) в виде водного раствора вводили перорально в дозах 1 и 10 мг/кг ежедневно, непосредственно перед экспозицией торфяным дымом. Интактных животных подвергали аналогичным процедурам без вдувания в камеры торфяного дыма. Каждая группа включала 5-6 животных. На 13-й день беременности через 30 минут после обработки торфяным дымом животных умерщвляли. От каждой самки отбирали по 4 плаценты и 4 эмбриона, каждый из которых разделяли на туловище и голову. Оценку ДНК-повреждений в клетках плаценты и эмбрионов проводили методом ДНК-комет в щелочной версии в соответствии с рекомендациями [1, 16]. Образцы плацент, голов и туловищ эмбрионов помещали в стеклянные пробирки с охлажденным до 4 °С фосфатно-солевым буфером (ФСБ), содержащим 20 mM EDTA-Na2, и 10 % ДМСО [рН 7,5] и тщательно раздавливали тефлоновым пестиком. Пробирки выдерживали 5 минут при комнатной температуре для осаждения крупных фрагментов тканей. Суспензии клеток в объеме 60 мкл вносили в пробирки с 240 мкл 1 % раствора легкоплавкой агарозы в ФСБ, подогретом до 36 °С (микротермостат «Термит», Россия), и ресуспендировали. Затем 60 мкл раствора агарозы с клетками наносили на предварительно покрытые 1 % универсальной агарозой предметные стекла, покрывали покровным стеклом и помещали на лед. На каждый образец плаценты, головы и туловища эмбрионов готовили один микропрепарат (всего 88 микропрепаратов). Далее все операции проводили в затемненном помещении при желтом свете. После затвердевания агарозы (около 5-10 минут) покровные стекла осторожно удаляли, микропрепараты помещали в стеклянную кювету (тип Шиффендекер), заливали предварительно охлажденным до 4 °С лизирующим буфером (10 mM Tris-HCl (pH 10), 2,5 M NaCl, 100 mM EDTA-Na 2,1 % TritonX-100, 10 % ДМСО) и инкубировали 1 час. После микропрепараты переносили в охлажденный до 4 °С буфер для электрофореза (300 mM NaOH, 1 mM EDTA-Na2 (pH > 13)) и инкубировали в течение 20 минут для реализации щелочно-лабильных сайтов и щелочной денатурации ДНК. После микропрепараты переносили в камеру для электрофореза (SubCell GT, Bio-Rad), заполненную свежим охлажденным буфером, и проводили электрофорез в течение 20 минут при напряженности поля 1 V/cm и силе тока ~300 mA. По окончании электрофореза микропрепараты переносили в стеклянную кювету, отмывали в течение 10 мин в ФСБ и фиксировали в 70 % растворе этилового спирта в течение 15 минут. После фиксации микропрепараты высушивали и хранили до анализа при комнатной температуре. Непосредственно перед микроскопированием препараты окрашивали флуоресцирующим красителем SYBR Green I (1 : 10000 в ТЕ-буфере (рН 8,5) с 50 % глицерином) в течение 30 минут в темноте. Цифровые изображения с микропрепаратов получали на эпифлуоресцентном микроскопе Микмед-2 12T («Ломо», Россия), совмещенном с цифровой камерой высокого разрешения (VEC-335, ЭВС, Россия), при увеличении × 200 (рис. 1). С полученных на каждый микропрепарат 10-15 изображений в программной среде CASP 1.2.2 анализировали не менее 100 ДНК-комет. В качестве показателя поврежденности ДНК использовали процентное содержание ДНК в хвосте ДНК-комет (% ДНК в хвосте). Перед статистической обработкой полученных данных выборки в группах проверялись на нормальность и гомогенность дисперсий с использованием критерия Шапиро - Уилка и критерия Барлетта соответственно. Поскольку распределение в группах отличалось от нормального и были выявлены различия в дисперсиях, в соответствии с рекомендуемыми подходами к статистической обработке данных метода ДНК-комет проводили логарифмическое преобразование исходных показателей с последующим анализом с использованием параметрического критерия Даннета (Moller P. et al., 2014). Различия считали статистически значимыми при p < 0,05. Результаты и обсуждение У контрольных животных уровень ДНК-повреждений, оцениваемый по показателю «% ДНК в хвосте», в клетках плаценты составил 3,1 [1, 9; 5, 3] (Median (Q25 %; Q75 %), табл. 1). В клетках головы и туловища эмбрионов оцениваемый показатель зарегистрирован на уровне 2,2 [1, 3; 3, 3] и 2,1 [1, 2; 3, 6] % ДНК в хвосте соответственно. У крыс, подвергнутых воздействию торфяного дыма, выявлено статистически значимое увеличение уровня ДНК-повреждений в исследуемых тканях. В голове и туловище эмбрионов уровень ДНК-повреждений по сравнению с контрольными значениями возрос в 4,4 раза, в плаценте - в 4,1 раза. В группе животных, получавших афобазол в дозе 1 мг/кг, выявлено статистически значимое снижение индуцированных торфяным дымом ДНК-повреждений во всех исследуемых тканях. Генотоксический эффект в голове и плаценте снизился в 2,4-2,6 раза, в плаценте - в 1,7 раза. Антигенотоксические эффекты афобазола при его использовании в дозе 10 мг/кг оказались сходны. Таким образом, установлено, что экспозиция торфяным дымом приводит к индукции повреждений ДНК в клетках плаценты и эмбрионов крыс. Генотоксические эффекты в исследованных тканях оказались сопоставимы, более чем четырехкратное превышение спонтанного уровня ДНК-повреждений. Вместе с тем анализ индивидуальных данных демонстрирует высокую вариабельность выявленных эффектов как между животными, так и между плацентами и эмбрионами одного животного (рис. 2). В большинстве образцов уровень ДНК-повреждений в клетках плаценты оказался выше по сравнению с клетками соответствующего эмбриона. При этом выявлены пары плацента/эмбрион со значимо более выраженным эффектом в клетках плаценты и пары, для которых эти различия минимальны. Наблюдаемые внутрииндивидуальные различия могут быть связаны с так называемым феноменом внутриутробного положения (intrauterine position). Так, была показана более высокая устойчивость эмбрионов, расположенных в срединной части рога матки, к действию ионизирующего излучения, гипоксии и ряда химических агентов [11, 21, 22]. Анализ имеющихся на сегодня экспериментальных данных позволяет предположить три возможных механизма реализации генотоксических эффектов торфяного дыма. Во-первых, экспозиция торфяным дымом может приводить к гипоксическим состояниям матери и эмбрионов, сопровождающимся гиперпродукцией активных форм кислорода (АФК) в клетках и окислительным повреждением ДНК [9, 14]. Во-вторых, торфяной дым содержит значительные концентрации мутагенных и канцерогенных соединений, в первую очередь полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), свободно проникающих через плацентарный барьер [10, 20]. В этой связи стоит отметить данные эпидемиологического исследования, в котором была показана связь между уровнем специфических для ПАУ ДНК-аддуктов в клетках материнской и пуповинной крови и риском развития тревожно-депрессивных расстройств в возрасте 6-7 лет [17]. Эти данные являются важным свидетельством в поддержку разрабатываемой концепции патогенетической роли первичных ДНК-повреждений [4] в том числе в нарушениях анте- и постнатального развития. В-третьих, в торфяном дыме содержатся твердые микро- и наночастицы размером от 10 мкм до < 100 нм. Накапливаясь в альвеолах материнского организма, они способны попадать в системный кровоток, преодолевать плацентарный барьер и достигать тканей эмбрионов, проявляя при этом генотоксическую активность посредством активации свободнорадикальных процессов [12, 13]. Очевидно, что генотоксические эффекты торфяного дыма реализуются по нескольким путям одновременно и являются следствием суммарного воздействия всех факторов, в существенной мере реализующих генотоксический потенциал через продукцию генотоксических АФК. Отсюда антигенотоксические свойства афобазола логично объясняются его антирадикальной/антиоксидантной активностью [7, 8]. Связь между генотоксическими поражениями и болезнями хорошо известна [4]. Исследование генотоксических эффектов торфяного дыма является важным для разработки мер и средств профилактики отдаленных патогенетических проявлений. В настоящем исследовании установлено, что антимутаген афобазол снижает индуцируемые экспозицией торфяным дымом ДНК-повреждения в клетках плаценты и эмбриональных тканей крыс. Афобазол, как было показано выше, не демонстрировал per se генотоксических свойств ни в одном из предъявленных тестов, в том числе в тесте ДНК-комет в эмбриональных тканях [2, 3]. Протекторные эффекты афобазола оказались сходны для обеих использованных доз и исследованных тканей - 53-60 % снижение уровня индуцированных ДНК-повреждений. Анализ индивидуальных данных демонстрирует меж- и внутрииндивидуальные различия. Важно отметить, что для части эмбрионов наблюдалось снижение уровней ДНК-повреждений до спонтанного уровня. Таким образом, полученные в настоящем исследовании данные свидетельствуют о генотоксических эффектах в плаценте и эмбрионах крыс, подвергнутых экспозиции торфяным дымом. Анксиолитик афобазол, обладающий антимутагенными свойствами, снижает повреждения ДНК, индуцируемые торфяным дымом во всех исследованных тканях. При этом важно, что защитный эффект проявляется в том числе при использовании препарата в дозе 1 мг/кг, соответствующей терапевтической для человека [8]. В совокупности с данными предыдущих исследований [2, 3] вышеприведенные результаты определяют перспективность применения афобазола в качестве средства защиты от негативных эффектов торфяного дыма.

About the authors

Dinara M Gorbatova

Zakusov Institute of Pharmacology, Russian Academy of Sciences

Email: pharmacevt07@mail.ru
Researcher, Laboratory of Drug Toxicology, a group of reproductive toxicity

Aliy K Zhanataev

Zakusov Institute of Pharmacology, Russian Academy of Sciences

Email: pharmacol@yandex.ru
Leading Researcher, Ph.D, Laboratory of Pharmacology and mutagenesis

Helena P Nemova

Zakusov Institute of Pharmacology, Russian Academy of Sciences

Email: nemova_elena@mail.ru
senior researcher, PhD, Laboratory of Drug Toxicology, a group of reproductive toxicity

Andrey D Durnev

Zakusov Institute of Pharmacology, Russian Academy of Sciences

Email: food2003@yandex.ru
Corresponding Member. Russian Academy of Sciences, Doctor of Medical Sciences, Professor, Laboratory of Pharmacology and mutagenesis; Laboratory of Drug Toxicology, a group of reproductive toxicity

References

Supplementary files