Combination of rice blast resistance genes in the genotypes of russian rice varieties with the use of marker assisted selection

Cover Page

Abstract


Grain productivity of rice is significantly reduced by dangerous disease – blast. Therefore, the development of resistant high yielding rice varieties with the Pi group of genes is important. Use of molecular markers linked with the loci of resistance significantly optimizes the breeding process.

The purpose of the research is to develop rice lines combining 2-6 loci of resistance to blast: Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-ta, Pi-b, Pi-40 by molecular marking.

Materials and Methods. As donors of resistance genes foreign samples were used, recipient – Russian varieties. In the studies we used micro-satellites markers and PCR analysis.

Results. In the first stage of the research as a result of hybridization domestic lines with genes Pi-l, Pi-2, Pi-33 were obtained. At the second stage – hybrids with all 3 genes were developed. In the third stage genes Pi-b and Pi-ta and on the fourth – Pi-40 were introduced.

Conclusion. As a result, rice genotypes, combining 6 loci of blast resistance were developed with use of marker assisted selection.


ВВЕДЕНИЕ

Рис — одна из основных продовольственных культур во всем мире, представляющая собой основной продукт питания для более чем 60 % населения мира. Его выращивают на всех континентах, за исключением Антарктиды. Он имеет огромное экономическое значение, более 23 % от потребляемых населением мира калорий получают из риса. Различные патогены приносят большие убытки при выращивании культуры. Самой вредоносной болезнью является пирикуляриоз, вызываемый грибом Pyricularia oryzae Cav., который представляет собой серьезную угрозу для мировой продовольственной безопасности. Снижение урожая от него в годы эпифитотий достигает иногда 100 % [1]. Это заболевание присутствует почти во всех странах и агроэкологических зонах, где выращивается рис, и вызывает поражение листьев, междоузлий и метелок. Количество риса, теряющееся от этой болезни ежегодно, таково, что можно обеспечить пищей 60 миллионов человек [2]. Ежегодно в мире применяется для борьбы с пирикуляриозом 20–30 тыс. тонн фунгицидов [2], в том числе 220–380 тонн в России [3]. Проводятся химические обработки против других патогенов, что оказывает неблагоприятное влияние на среду обитания и здоровье человека.

Выращивание сортов, резистентных к болезням, представляет собой перспективный способ защиты риса без применения химикатов. Выведение таких сортов и оперативное внедрение их в сельское хозяйство — самое эффективное действие для устранения этой болезни. Однако создание устойчивых сортов — наиболее сложное направление селекции. Pyricularia oryzae Cav. обладает огромным спектром вариабельности, что в комплексе с его большими способностями к размножению обусловливает успешную приспособляемость.

Линии, совмещающие в себе два и более локуса Pi, часто демонстрируют существенное повышение уровня устойчивости к этой болезни и имеют большую ценность при создании сортов. В связи с этим в сельскохозяйственном производстве нужно возделывать болезнеустойчивые сорта, совмещающие в одном генотипе несколько генов, каждый из которых вносит свой вклад по этому признаку.

Резистентность к пирикуляриозу обусловлена классической схемой «ген на ген» [4], когда основной аллель устойчивости эффективно действует против штаммов P. oryzae Cav., имеющих соответственный ген авирулентности [5]. Белки растений, определяющие устойчивость, кодируются семейством сцепленных генов. Высокая вариабельность продуктов этих генов позволяет препятствовать заражению новыми вирулентными видами и расами патогенов.

В ходе генетических экспериментов было определено более 100 генов, повышающих резистентность к этой болезни — Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-b, Pi-ta, Pi-z и др. [2, 6].

Обобщая информацию о локализации генов устойчивости риса к пирикуляриозу в геноме, была построена генетическая карта с позициями генов [7]. Расположение генов устойчивости было установлено путем выявления BAC- или PAС-клонов, содержащих последовательности клонированного гена или фланкирующих маркеров [8].

Во многих источниках отмечается, что гены, влияющие на устойчивость к пирикуляриозу, расположены совместно близко друг к другу на хромосомах 6, 11 и 12 [9, 10]. На 6-й хромосоме не менее 14 генов были выявлены в районе центромеры [7]. Среди них Pi-2, Pi-z-t и Pi-9клонированы и обнаружены в одной и той же части хромосомы. Они встроены в генный кластер, содержащий тандемно повторяющиеся гены NBS-LRR [11, 12].

На длинном плече хромосомы 11 картированы по крайней мере девять генов (Pi-1, Pi-7, Pi-18, Pi-f, Pi-34, Pi-38, Pi-44(t), PBR, Pi-lm2) и шесть аллелей локуса Pi-k. На хромосоме 12 вблизи центромеры были картированы не менее 17 генов устойчивости (Pi-ta, Pi-ta-2, Pi-tq6, Pi-6(t), Pi-12, Pi-12(t), Pi-19(t), Pi-20(t), Pi-21(t), Pi-24(t), Pi-31(t), Pi-32(t), Pi-39(t), Pi-62(t), Pi-157(t), IPi и IPi3) [7]. Анализ протеома линий с разными аллелями Pi-ta показал, что белки восприимчивых и устойчивых сортов различаются по одной аминокислоте [9].

Применение ДНК-маркеров, тесно сцепленных с генами резистентности растений риса к P. oryzae Cav., значительно облегчает селекционную работу в этом направлении. Способы молекулярного маркирования дают возможность существенно ускорить введение целевых генов в ходе селекции и обеспечить создание современных сортов, интегрирующих комплект нужных признаков [13].

Стратегии улучшения должны рассчитывать не на один ген, а на несколько объединенных генов для долговременной устойчивости, так как гриб имеет сложный набор рас и олигогенная устойчивость зачастую преодолевается возбудителем за очень короткий промежуток времени. Поэтому нужно выращивать устойчивые к пирикуляриозу сорта риса, которые имеют в своем геноме группу генов, вносящих свой вклад в резистентность. Сорта, обладающие комбинацией из 3–5 генов устойчивости, показывают более значительное увеличение и расширение диапазона резистентности к пирикуляриозу, чем единичные гены.

В некоторых странах реализованы успешные селекционные программы по созданию устойчивых к пирикуляриозу сортов риса методом пирамидирования генов с применением маркерной селекции. Например, в Колумбии пирамидирование генов Pi-1, Pi-2 и Pi-33 в геноме использовали в качестве стратегии селекции, эффективной для создания сортов риса с длительной устойчивостью к пирикуляриозу [14].

В Китае перспективная линия G46B, используемая для получения гибридного риса, но поражаемая пирикуляриозом, была скрещена с тремя сортами риса — Digu, BL-1 и Pi-4, обладающими генами Pi-d(t), Pi-b и Pi-ta2 соответственно [15]. В процессе пирамидирования выделено 15 растений с этими тремя генами резистентности. Эти результаты показывают возможности маркерной селекции в работах по повышению устойчивости риса к болезням [15].

Селекция высокоурожайных сорта риса с надежной устойчивостью к пирикуляриозу является одним из приоритетов в Китае и в странах, где возделывание риса — главное направление в сельском хозяйстве. Эффективность и точность селекции резистентных сортов во многом зависят от создания маркеров, специфичных для целевого гена. Для гена Pi-39 был разработан специфический маркер (InDel), основанный на вставке-делеции [16]. Этот ген был успешно введен в два лучших сорта с использованием генотипического и фенотипического отбора. Пять выделенных линий BC3F3 показали высокий уровень устойчивости к пирикуляриозу. По крайней мере 97,5 % их генома было унаследовано от их рекуррентных сортов. Агрономические признаки четырех линий (D94, D98, D112 и D113) были так же хороши, как и у рекуррентного родителя [16].

В работе других китайских селекционеров три гена резистентности (Pi-1, Pi-2, Pi-33) из донорных образцов риса C101-Lac и C101-A-51 были перенесены в элитный сорт Jin 23В путем гибридизации и беккроссов. Шесть почти изогенных линий Jin 23В с тремя генами резистентности были созданы с помощью сочетания традиционной и маркерной селекции. Резистентность трехгенных линий была выше, чем моногенных. Следовательно, пирамидирование генов устойчивости к пирикуляриозу представляет собой результативный подход для улучшения сортов риса по устойчивости к этой болезни [17].

В Индии гибриды F1, F2 от скрещивания между восприимчивым к пирикуляриозу высокоурожайным сортом риса ADT 43 и резистентной почти изогенной линией (NIL) CT13432–3R, несущей четыре гена устойчивости к пирикуляриозу — Pi-1, Pi-2, Pi-33 и Pi-54, были использованы для изучения взаимодействия генов, контролирующих признаки устойчивости к болезням и урожайности [18]. Взаимодействие генов было комплементарным по числу продуктивных побегов, урожайности, количеству поражений, инфицированной площади листьев, однако для остальных признаков наблюдали эпистаз. Среди генотипов, испытанных в условиях эпифитотий, линии с несколькими генами имели более высокую устойчивость к пирикуляриозу по сравнению с образцами, несущими единичные гены. Это указывает на то, что неаллельные гены имеют комплементарный эффект, когда присутствуют вместе. Информация о генетике различных признаков, способствующих повышению устойчивости, будет в дальнейшем помогать селекционерам растений в выборе подходящей стратегии селекции на устойчивость к пирикуляриозу и повышение урожайности риса [18].

У некоторых сортов подвида indica были обнаружены два гена устойчивости, Pi-b и Pi-ta, которые были изучены на молекулярном уровне и перенесены в сорта подвида japonica [5, 9, 19]. Они контролируют синтез протеинов, обеспечивающих резистентность к пирикуляриозу [19].

Оба гена Pi-b и Pi-ta относятся к наиболее распространенному типу генов резистентности NBS-LRR, которые кодируют белки, содержащие нуклеотид-связывающий домен (NBS), а также рецепторный район с более высоким содержанием лейцина (LRR) [19].

Ген резистентности к пирикуляриозу Pi-b открыл японский ученый Shinoda (1971) у сортов риса indica. В 1978 г. были получены изогенные линии ВL-1–BL-7 на сортах japonica, получивших от устойчивых образцов фрагмент хромосомы 2 с геном Pi-b [20]. В дальнейшем этот ген был клонирован и секвенирован [21]. Ген Pi-b эффективно защищает рис от пирикуляриоза в районах производства риса на юге России [22].

Во Всероссийском НИИ риса (лаборатория биотехнологии) ранее была создана система внутригенных маркеров гена Pi-b [23]. С применением маркеров на основе ПЦР-анализа выведены хорошие селекционные образцы с этим геном на базе генотипов сортов Янтарь и Хазар [24].

Другой доминантный секвенированный ген устойчивости к пирикуляриозу — Pi-ta вносит свой вклад в формирование иммунитета риса [9]. Он тоже относится к типу генов устойчивости растений — NBS-LRR [25].

Присутствие в коллекции образцов, имеющих гены Pi-b и Pi-ta, дало нам возможность провести работу по выведению на их базе сортов риса с пирамидированными генами устойчивости.

Ген Pi-40, по данным литературных источников, обладает высокой степенью устойчивости к различным патогенным расам возбудителя пирикуляриоза [26]. Этот ген был перенесен в геном культурного риса Oryza sativa L. в результате гибридизации с дикорастущим австралийским видом O. australiensis Domin. и последующих беккроссов. Реципиентом послужил сорт подвида japonica из Кореи. Сначала была выведена линия IR65482-4-136-2-2, на основе которой был создан ряд селекционных линий, несущих ген Pi-40 [27].

Этот ген расположен на коротком плече в шестой хромосоме. Выявлено два микросателлитных локуса (RM527 и RM3330), находящихся с двух сторон от гена Pi-40 на расстоянии 1,1 и 2,4 сМ [27]. Они являются кодоминантными, что позволяет различить аллельное состояние этого гена, и используются при анализе расщепления в потомстве для определения гибридных растений, несущих доминантный аллель Pi-40 в гомозиготном состоянии [27].

Для выведения новых сортов риса может быть использован генетический полиморфизм. Достижения в молекулярной генетике риса позволяют применять технологии ДНК-маркирования. Расшифровка генома риса и клонирование генов обеспечивают возможность получения внутригенных маркеров, ценных для использования в селекции. Данный подход существенно расширяет границы возможностей обычной селекции. При помощи надежных маркеров к генам, контролирующим устойчивость риса к пирикуляриозу или другие хозяйственно значимые признаки, можно существенно уменьшить период создания новых форм растений, ускорить перемещение ценных аллелей в генотипы реципиентов и вывести новые сорта с комплексом ценных признаков [13, 28]. Положительный момент заключается в том, что на молекулярные маркеры не оказывают влияния условия выращивания и их можно определять на любой фазе онтогенеза растений. Таким образом, выведение резистентных высокоурожайных сортообразцов риса с группой генов Pi с использованием ДНК-маркеров, сцепленных с локусами устойчивости, является актуальным.

Цель наших исследований — получение линий риса с 2–6 генами резистентности к пирикуляриозу: Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-ta, Pi-b, Pi-40 методом молекулярного маркирования.

Практическая значимость состоит в том, что с применением эффективной стратегии маркерной селекции удалось объединить несколько различных генов Pi на генетической базе российских сортов и создать устойчивые к изменчивым расам возбудителя пирикуляриоза образцы риса, которые можно выращивать без использования фунгицидов. Впервые в Ростовской области при помощи маркерной селекции были созданы комплексно устойчивые к пирикуляриозу сорта риса Магнат, Пентаген и другие.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Продуктивные скороспелые отечественные сорта подвида japonica Вираж и Боярин были взяты в качестве отцовских сортов-реципиентов. Линии подвида indica С101-А-51 (Pi-2), С101-Lас (Pi-1 и Pi-33) (CIRAD, Франция), Мороберекан (Pi-b), IR-58 (Pi-ta), IR-83243-2-1-24-4-B (Pi-40) (IRRI, Филиппины), взятые в качестве материнских форм, выступали в качестве доноров. В данной работе использовали не оригинальные сорта Мороберекан и IR-58, а полученные ранее скороспелые чистые линии из гибридов Аметист × Мороберекан (Л-10189, ВНИИ риса) и IR-58 × Кубань 3 (Л-10136, ВНИИЗК).

Пирамидирование генов осуществляли с помощью ступенчатой гибридизации. На первом этапе исследований в результате гибридизации получены линии с генами Pi-1, Pi-2, Pi-33. На втором этапе созданы гибриды, обладающие всеми тремя генами. На третьем этапе перенесены гены Pi-b и Pi-ta, на четвертом — Pi-40. При скрещивании растений удаление пыльников с цветков материнских растений проводили вакуумным способом, а опыление — твел-методом, путем стряхивания пыльцы с отцовских метелок. Гибридные растения выращивали на чеках ФГУП «Пролетарское» Ростовской области. Геномную ДНК выделяли из листьев растений, семена которых были  убраны.

Экстракцию ДНК осуществляли методом СТАВ, который заключается в использовании цетилтриметиламмоний бромида (СТАВ) в качестве основного компонента буфера экстракции и преципитации [29].

Для идентификации генов применяли микросателлитные SSR-маркеры. Нуклеотидные последовательности праймеров представлены на сайте www.gramene.org. В течение всех циклов возвратных скрещиваний перенос доминантных аллелей каждого такого гена в потомстве контролировался тесно сцепленными или внутригенными молекулярными маркерами. Для определения гена Pi-1 использовали маркеры RM224, гена Pi-2 — RM527, гена Pi-33 — RM310, Pi-40 — RM527. Они локализованы в хромосомах: 11, 6, 8, 6 соответственно. Внутригенные маркеры, созданные в лаборатории биотехнологии Всероссийского НИИ риса, применялись для идентификации генов Pi-b (IGM Pi-b, хромосома 2) и Pi-ta (IGM Pi-ta, хромосома 12) [28, 29].

ПЦР проводили с 40–50 нг ДНК в конечном объеме 25 мкл. Состав реакционной смеси: 0,05 мМ dNTPs, 0,3 мМ каждого праймера, 25 мM KCL, 60 мM Tris-HCL (pH 8,5), 0,1 % Тритон Х-100, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1,5 мM MgCL2, 1 единица Taq-полимеразы. Амплификацию осуществляли в ДНК-амплификаторе «Терцик» при следующих условиях: начальная денатурация ДНК при 94 °C 5 минут; следующие 35 циклов: денатурация при 94 °C 30 с; отжиг праймеров при 56 °C 35 с; элонгация при 72 °C; последний цикл синтеза длится 3 минуты при температуре 72 °C.

Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 8 % полиакриламидном геле (напряжение 250 вольт в течение 3 часов). Для визуализации результатов гелевые пластины помещали на 20–30 минут в раствор бромистого этидия (5 мкг/мл) и фотографировали при ультрафиолетовом свете в гель-документирующей системе (Gel Doc 2000, BioRad, США).

Инокуляцию растений проводили культурой гриба, отобранного на чеках Краснодарского края. Оценку устойчивости риса к пирикуляриозу осуществляли по 9-балльной шкале Международного института риса: устойчивые (1 балл) — отсутствие поражения, мелкие коричневые пятнышки в виде точек; среднеустойчивые (2–5 баллов) — типичные пирикуляриозные пятна эллиптической формы, 1–2 мм длиной, покрывающие до 10 % общей поверхности листьев; слабо устойчивые (6–7 баллов) — типичные пятна длиной 3 мм и более, инфицирующие от 11 до 50 % поверхности листьев; неустойчивые (8–9 баллов) — типичные пирикуляриозные пятна 3 мм длиной или более, покрывающие более 75 % площади листьев, многие листья мертвы [30].

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программ Excel и Statistica 6.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

С помощью ДНК-маркеров было проведено объединение нескольких генов устойчивости к пирикуляриозу на основе генотипов риса, приспособленных к климату юга России.

На первом этапе работы в 2005 г. была проведена гибридизация сортов Боярин и Вираж с тремя донорами генов Pi-1, Pi-2, Pi-33. После анализа ДНК у растений были отобраны гомозиготные образцы, несущие доминантные аллели устойчивости.

Продолжительность вегетационного периода донорных образцов была на 30–35 дней больше, чем у сорта Боярин, поэтому межподвидовые гибриды F1 характеризовались продолжительным вегетационным периодом и значительной стерильностью колосков (91–95 %) (рис. 1).

 

6084-8135-1-SP.png

Рис. 1. Метелка гибрида F1 C101-Lас (Pi-1+33) × Боярин

 

В каждой расщепляющейся широко варьирующей по многим признакам популяции F2, состоящей из 310–720 индивидуумов, было отобрано по 20–30 растений, которые характеризовались скороспелостью, низкорослостью, неосыпаемостью и фертильностью колосков. С помощью ПЦР-анализа из них были выделены растения, гомозиготные по доминантным аллелям генов устойчивости.

ПЦР-анализ образцов риса с использованием микросателлитного маркера RM224 к локусу Pi-1 показал, что он обеспечивает надежный хорошо воспроизводимый результат для идентификации этого гена. Результаты ДНК-маркирования гена Pi-1 в растениях F2, полученных при гибридизации C101-Lac × Боярин, показаны на рисунке 2.

 

6084-8136-1-SP.png

Рис. 2. Результаты разделения методом электрофореза продуктов амплификации ДНК растений F2 (C101-Lac × Боярин) с маркером RM224 к гену устойчивости риса к пирикуля-риозу Pi-1. Примечание: 56–39 – анализируемые растения; B — сорт-реципиент Боярин; линия C101-Lac — донор гена Pi-1. При наличии доминантного аллеля гена Pi-1 амплифицируется фрагмент размером 158 п. н.

 

Анализ показал, что только растения с номерами 41, 45, 47, 54 несут доминантный аллель Pi-1, унаследованный от материнской линии-донора C101-Lac, у остальных он отсутствует, как и у Боярина (B).

Наиболее информативными для анализа аллельных состояний локусов Pi-2 и Pi-33 являются SSR-маркеры RM527 и RM310 соответственно. Результаты электрофоретического разделения продуктов амплификации ДНК растений F2 с маркером RМ527, который сцеплен с геном Pi-2, показаны на рисунке 3. Доминантный аллель устойчивости Pi-2 донорной родительской линии C101-A-51 был обнаружен в гомозиготном состоянии у генотипов 108, 105, 104. У других растений выявлен только рецессивный аллель от сорта Боярин, и они были выбракованы в ходе селекции.

 

6084-8137-1-SP.png

Рис. 3. Результаты разделения методом электрофореза продуктов амплификации ДНК растений F2 (C101-A-51 × Боярин) с маркером RM527 к гену Pi-2 устойчивости риса к пирикуляриозу. Примечание: 110–65 — анализируемые растения; B — сорт-реципиент Боярин; линия C101-A-51 — донор гена Pi-2. При наличии гена Pi-2 амплифицируется фрагмент размером 233 п. н.

 

На рисунке 4 видно, что гибридные растения 70–73, 56, 57 имеют доминантный аллель Pi-33 от C101-Lac — линии-донора (в том числе у растений 71 и 72 в гетерозиготном состоянии), у остальных он отсутствует, как и у сорта Боярин (B).

 

6084-8138-1-SP.png

Рис. 4. Результаты разделения методом электрофореза продуктов амплификации ДНК-растений F2 (C101-Lac × Боярин) с маркером RM310 к гену устойчивости риса к пирикуляриозу Pi-33. Примечание: 73–56 — анализируемые растения; B — сорт-реципиент Боярин; линия C101-Lac — донор гена Pi-33. При наличии доминантного аллеля Pi-33 амплифицируется фрагмент размером 85 п. н.

 

У гибридов F3 от скрещиваний С101-Lас (Pi-1 + 33) × Боярин и С101-Lас (Pi-1+33) × Вираж было выделено большое число среднеспелых гомозиготных линий с двумя доминантными аллелями генов резистентности: Pi-1 и Pi-33.

На следующем, втором этапе (2008) от ступенчатой гибридизации гомозиготных по доминантным аллелям растений [С101-А-51 (Pi-2) × Боярин] и [С101-Lас (Pi-1 + 33) × Боярин] были получены гомозиготные образцы, несущие все три пирамидированных гена: Pi-1, Pi-2, Pi-33. Аналогичная работа по объединению генов устойчивости проведена с гибридами на основе сорта Вираж.

В настоящее время модельный сорт риса должен состоять из низкорослых растений, устойчивых к полеганию. Метелка должна быть плотной, продуктивной с большим числом фертильных, не осыпающихся при созревании колосков. Из гибридных растений, обладающих по данным ДНК-анализа тремя пирамидированными генами, контролирующими устойчивость, удалось отобрать три линии (Ил. 13, Ил. 14 и Ил. 28), совмещающие в себе среднеспелость, низкорослость, хорошую озерненность метелки, выполненное зерно.

В таблице 1 представлены сортообразцы с пирамидированными генами широкого спектра устойчивости к пирикуляриозу: Рi-1, Pi-2, Pi-33, на генетической основе сорта Боярин, находящиеся в родительском питомнике лаборатории риса. Для сравнения приводятся также характеристики реципиентной родительской формы — сорта Боярин.

В лаборатории защиты риса Всероссийского НИИ риса в инфекционном питомнике рисовой оросительной системы была проведена фитопатологическая оценка полученных таким образом линий с пирамидированными генами устойчивости к пирикуляриозу Pi-1 + Pi-2 + Pi-33 и сорта-реципиента Боярин. Тестирование показало их устойчивость (табл. 1).

 

Таблица 1. Некоторые характеристики сортообразцов риса Ил. 13, Ил. 14 и Ил. 28 с пирамидированными генами устойчивости к пирикуляриозу Рi-1, Pi-2, Pi-33, созданные на генетической основе сорта Боярин с применением методов маркерной селекции Some characteristics of the accessions with pyramiding blast resistance genes Рi-1, Pi-2, Pi-33,  created on the genetic basis of variety Boyarin with MAS

Признак

Сорт, образец

Ошибка средней

Боярин

Ил. 13

Ил. 14

Ил. 28

Вегетационный период, дни

116

122

120

128

2,9

Высота растений, см

86

106

78

122

11,5

Длина метелки, см

13,9

17,8

14,6

21,2

1,9

Число колосков в метелке, шт.

114,5

134,7

129,1

153,8

9,4

Масса 1000 зерен, г

29,9

23,1

23,2

28,9

2,1

Масса зерна с метелки, г

3,42

3,11

3,00

4,44

0,4

Устойчивость к пирикуляриозу, балл

8

2

1

2

1,8

 

Из селекционного материала гибридной комбинации (С101-А-51 × Боярин) × (С101-Lас × Боярин) с генами Pi-1 и Pi-2 в 2011 г. был выделен по урожайности образец Дон 1664, который в пересчете на 1 га сформировал более 10 т зерна. Он был изучен в контрольном питомнике 2012 г. и размножен. В 2013 г. он прошел конкурсное сортоиспытание, в котором превысил стандарт Боярин на 1,1 т/га и был передан под названием Магнат на ГСИ с 2014 г. Растения этого сорта высотой 100–110 см. Соломина толстая, прочная, придающая устойчивость к полеганию. Метелка прямостоячая, рыхлая, длиной 14–15 см. Зерно мелкое, масса 1000 семян — 24 г. В контрольном питомнике 2015 г. Магнат сформировал урожайность 8,65 т/га, а в 2016 г. — 10,8 т/га, превысив стандарт Южанин на 0,79 и 1,62 т/га соответственно. В конкурсном сортоиспытании 2016 г. в ФГУП «Пролетарское» сорт риса Магнат дал урожайность 8,81 т/га, что на 0,34 т/га выше стандарта Южанин.

В этом питомнике хорошую урожайность показали образцы из гибридной комбинации (С101-А-51 × Боярин) × (С101-Lас × Боярин), несущие три гена устойчивости к пирикуляриозу: Pi-1, Pi-2, Pi-33 (табл. 2).

 

Таблица 2. Сортообразцы риса с генами устойчивости к пирикуляриозу Pi-1 + 2 + 33 в конкурсном сортоиспытании, 2016 г. Rice accessions with blast resistance genes Pi-1 + 2 + 33 in competitive varieties testing, 2016

Номер делянки 2016 г.

Наименование образца

Период «всходы – созревание», дни

Урожайность, т/га

Устойчивость к пирикуляриозу, балл

Стандарт

Южанин

127

8,48

8

Дон 1664

Магнат

127

8,81

3

Дон 5896

Ил. 13 (Pi-1 + 2 + 33)

122

8,43

2

Дон 5841

Ил. 14 (Pi-1 + 2 + 33)

120

8,75

1

Дон 5759

Ил. 28 (Pi-1 + 2 + 33)

128

8,19

2

 

НСР05

2,2

0,69

 

 

Полученные гомозиготные образцы по трем генам устойчивости к пирикуляриозу (Pi-1, Pi-2, Pi-33) по урожайности были на уровне стандарта. В дальнейшем их использовали в гибридизации с донорами других генов устойчивости — Pi-b и Pi-ta.

На третьем этапе исследований в 2010 г. созданные нами трехгенные линии риса (Pi-1+2+33) скрестили с донорами генов Pi-ta — Л-10136 и Pi-b: Л-10189 — для пирамидирования пяти генов. Гибридизацию проводили по схеме: Ил. 14 (Pi-1 + 2 + 33) × × F1 [Л-10189 (Pi-b) × Л-10136 (Pi-ta)]. Поскольку в качестве отцовской формы был взят гибрид F1, полученное потомство было разнородным и несло от 3 до 5 доминатных аллелей. Семена растений первого поколения, у которых на электрофореграммах было выявлено гетерозиготное состояние всех пяти аллелей, в 2012 г. были репродуцированы в поле, где выделили 93 лучших растения F2 по комплексу хозяйственно ценных признаков.

ПЦР-анализ всех пяти генов показал, что сегрегация по маркерам у изученных гибридов F2 отличалась от классического соотношения по Менделю 1 : 2 : 1. На эти результаты повлиял отбор, поскольку для ПЦР-анализа брали листья с пригодных для селекционной работы растений, имевших метелки с плодовитыми колосками и полностью созревшим зерном без остей [31].

В процессе анализа удалось выделить два образца риса (1225/13 и 1396/13), у которых все пять доминантных аллелей устойчивости (Pi-1 + 2 + 33 + ta + b) были в гомозиготном состоянии. Это значительно выше, чем теоретически ожидаемая частота 1 : 1024, и связано с отбором высокофертильных растений, которые с большей вероятностью являются гомозиготными, чем полустерильные.

Кроме того, обнаружены 4 растения, несущие 4 гена в гомозиготном, а 1 — в гетерозиготном состоянии. В последующие годы из их потомства выделены линии, гомозиготные по 5 генам с частотой 25 %. Данные линии изучены в селекционном питомнике по урожайности, устойчивости к пирикуляриозу и качеству крупы. Осуществлен следующий цикл отборов лучших растений и их ПЦР-анализ.

На рисунке 5 представлены электрофореграммы разделения продуктов амплификации ДНК растений двух линий 1225/13 и 1396/13 (номера проб 2 и 19) с маркерами к тестируемым генам устойчивости к пирикуляриозу.

 

6084-8139-1-SP.png

Рис. 5. Электрофореграммы разделения продуктов амплификации ДНК растений риса с маркерами RM224, RM527, RM310, IGM Pi-b, IGM Pi-ta к пяти генам Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-b, Pi-ta соответственно. Линии 1225/13 и 1396/13 (номера проб 2 и 19) имеют доминантные аллели в гомозиготном состоянии в пяти локусах, сорт Боярин (B) — рецессивные. При наличии генов Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-b, Pi-ta амплифицируются фрагменты размером 158, 233, 85, 302, 132 п. н. соответственно

 

Линия 1225/13 скороспелая, ее период вегетации составляет в среднем 110 суток, полукарликовая (80 см), с метелкой средней длины (15 см). Вторая линия 1396/13 — среднеспелая, период вегетации до созревания 120 суток, растения более высокие (100 см), метелка длинная (22 см), с большим количеством зерен.

Эти линии испытаны в селекционных посевах по урожайности и устойчивости к пирикуляриозу. Наиболее урожайная линия 1396/13 размножена в 2015 г. и посеяна в 2016 г. в конкурсном испытании и в производственных условиях на площади 0,5 га для изучения продуктивности и качества. Поскольку этот образец обладает пятью генами резистентности к пирикуляриозу — Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-b, Pi-ta, он получил название Пентаген [32]. Его урожайность в КСИ 2016 г. составила 6 т/га.

Поскольку растения сорта Пентаген имели поникающие метелки и были склонны к полеганию, его скрестили в 2013 г. с высокопродуктивным сортом Кубояр, имеющим оптимальный габитус растений и компактные прямостоячие метелки. Из 100 растений F2 комбинации Пентаген × Кубояр в 2015 г. выявлены 23 гомозиготных растения по гену Pi-1; 5 — по Pi-2; 5 — по Pi-33; 13 — по Pi-b; 52 — по Pi-ta. По результатам ПЦР-анализа были отобраны 7 идентичных сорту Кубояр растений, которые несли доминантные аллели в пяти локусах. При этом у одного из них была гомозиготность по трем локусам, у трех — по двум и у двух — по одному.

На четвертом этапе нашей работы получены образцы риса, несущие шесть доминантных аллелей генов резистентности к пирикуляриозу, у которых, кроме аллелей Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-b, Pi-ta, в генотип добавлен Pi-40. В качестве донора Pi-40 использовали образец IR-83243-2-1-24-4-B.

В 2013 г. нами была проведена гибридизация Пентаген × IR-83243-2-1-24-4-B. С лучших по комплексу хозяйственно ценных признаков гибридных растений F2 взяли отрезки листьев для анализа ДНК с использованием SSR-маркеров к каждому гену, провели ПЦР-анализ образцов и в 2015 г. выявили образцы, несущие в своем генотипе гены устойчивости к пирикуляриозу. При этом были обнаружены гибридные растения с четырьмя, пятью и шестью генами устойчивости: Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-b, Pi-ta и Pi-40. Они имели длинные поникающие метелки.

Таким образом, многолетние ступенчатые скрещивания на основе сортов Боярин и Вираж позволили создать линии риса с несколькими генами устойчивости к пирикуляриозу (Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-b, Pi-ta, Pi-40) в гомозиготном состоянии. С помощью современных методов молекулярного маркирования совместно с традиционной селекцией за короткий период времени созданы линии риса, в генотипе которых объединено до шести генов резистентности, обеспечивающих долговременную устойчивость к пирикуляриозу, что снизит риск эпифитотии болезни, сохранит биологическую урожайность риса и позволит получать экологически чистую продукцию.

ВЫВОДЫ

  1. В процессе многолетней селекционной работы на генетической базе российских сортов созданы образцы риса, несущие в одном генотипе 2–6 генов устойчивости к пирикуляриозу.
  2. С использованием маркер-опосредованной селекции созданы сорта риса Магнат с генами Pi-1 и Pi-2 и Пентаген, имеющий пять эффективных генов устойчивости к различным расам возбудителя пирикуляриоза — Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-b, Pi-ta.

Pavel I. Kostylev

Author for correspondence.
p-kostylev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4371-6848
SPIN-code: 7901-1531
Agrarian Scientific Center “Donskoy”
Russian Federation, 3, Nauchny Gorodok, Zernograd, Rostov region, 347740

doctor of agricultural sciences, head, laboratory of breeding and seed production of rice

Elena V. Krasnova

krasnovaelena67@mail.ru
Agrarian Scientific Center “Donskoy”
Russian Federation, 3, Nauchny Gorodok, Zernograd, Rostov region, 347740

candidate of agricultural sciences, leading researcher, laboratory of breeding and seed production of rice

Aleksandr A. Redkin

Rs.07.Pro@mail.ru
Agrarian Scientific Center “Donskoy”
Russian Federation, 3, Nauchny Gorodok, Zernograd, Rostov region, 347740

candidate of agricultural sciences, researcher, laboratory of breeding and seed production of rice

Elena V. Dubina

lenakrug1@rambler.ru
All-Russian Research Institute of Rice
Russian Federation, 3, Belozerny, Krasnodar, 35092

cand. of Biol. Sci., head of the laboratory

Zhanna M. Mukhina

agroplazma@gmail.com
All-Russian Research Institute of Rice
Russian Federation, 3, Belozerny, Krasnodar, 35092

doctor of biological sciences, Deputy Director on innovation

  • Костылев П.И., Редькин А.А., Краснова Е.В., и др. Создание устойчивых к пирикуляриозу сортов риса с помощью ДНК-маркеров // Вестник российской сельскохозяйственной науки. – 2014. – № 1. – С. 26–28. [Kostylev PI, Redkin AA, Krasnova EV, et al. Creating rice varieties, resistant to pirikulariosis by means of DNA markers. Vestnik rossijskoj selskohozyajstvennoj nauki. 2014;(1):26-28. (In Russ.)]
  • Sharma TR, Rai AK, Gupta SK, et al. Rice blast management through host-plant resistance: Retrospect and prospects. Agricultural Research. 2012;1(1):37-52. doi: 10.1007/s40003-011-0003-5.
  • Костылев П.И., Шилов И.А., Мухина Ж.М. Перенос пяти генов устойчивости риса к пирикуляриозу с помощью ДНК-маркеров // Вестник российской сельскохозяйственной науки. – 2014. – № 2. – С. 33–34. [Kostylev PI, Shilov IA, Mukhina ZhM. Transferring five genes of rice resistance to piriculariose by means of DNA-markers. Vestnik rossijskoj selskohozyajstvennoj nauki. 2014;(2):33-34. (In Russ.)]
  • Flor HH. Current status of the gene-for-gene concept. Annu Rev Phytopathol. 1971;9:275-296.
  • Silue D, Notteghem JL, Tharreau D. Evidence for a gene-for-gene relationship in the Oryza sativa – Magnaporthe grisea pathosystem. Phytopathology. 1992;82:577-580. doi: 10.1094/phyto-82-577.
  • Mackill DJ, Bonman JM. Inheritance of blast resistance in near-isogenic lines of rice. Phytopathology. 1992;82:746-749. doi: 10.1094/phyto-82-746.
  • Koide Y, Kobayashi N, Xu D, et al. Blast resistance genes and their selection markers in rice (Oryza sativa L.). JIRCAS Working Report. 2009;63:95-122.
  • Harushima Y, Yano M, Shomura A, et al. A high-density rice genetic linkage map with 2275 markers using a single F2 population. Genetics. 1998;148:479-494.
  • Bryan GT, Wu K, Farrall L, et al. A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible alleles of the rice blast resistance gene Pi-ta. Plant Cell. 2000;12:2033-2045. doi: 10.1105/tpc.12.11.2033.
  • Wu JL, Fan YY, Li DB, et al. Genetic control of rice blast resistance in the durably resistant cultivar Gumei 2 against multiple isolates. Theoretical and Applied Genetics. 2005;111:50-56. doi: 10.1007/s00122-005-1971-2.
  • Qu S, Liu G, Zhou B, et al. The broad-spectrum blast resistance gene Pi9 encodes a nucleotide-binding site-leucine-rich repeat protein and is a member of a multigene family in rice. Genetics. 2006;172:1901-1914. doi: 10.1534/genetics.105.044891.
  • Zhou B, Qu S, Liu G, et al. The eight aminoacid differences within three leucine-rich repeats between Pi2 and Piz-t resistance proteins determine the resistance specificity to Magnaporthe grisea. Molecular Plant-Microbe Interactions. 2006;19:1216-1228. doi: 10.1094/MPMI-19-1216.
  • Jena KK, Moon HP, Mackill DJ. Marker assisted selection – a new paradigm in plant breeding. Korean J Breed. 2003;35:133-140.
  • Correa-Victoria FJ, Tharreau D, Martinez C, et al. Studies on the rice blast pathogen, resistance genes, and implication for breeding for durable blast resistance in Colombia. Rice Blast: Interaction with Rice and Control. 2004. P. 215-227. doi: 10.1007/978-0-306-48582-4_26.
  • Chen XW, Li SG, Ma YQ, et al. Marker-assisted selection and pyramiding for three blast resistance genes, Pi-d(t)1, Pi-b, Pi-ta2, in rice. Chinese Journal of Biotechnology. 2004;20(5):708-714.
  • Hua LX, Lianga LQ, Hed XY, et al. Development of a marker specific for the rice blast resistance gene Pi39 in the Chinese cultivar Q15 and its use in genetic improvement. Biotechnology & Biotechnological Equipment. 2015;29(3):448-456. doi: 10.1080/13102818.2015.1011894.
  • Chen HQ, Chen ZX, Ni S, et al. Pyramiding three genes with resistance to blast by marker assisted selection to improve rice blast resistance of Jin 23B. Chinese Journal of Rice Science. 2008;22(1):23-27.
  • Divya B, Biswas A, Robin S, et al. Gene interactions and genetics of blast resistance and yield attributes in rice (Oryza sativa L.). J Genet. 2014;93(2):415-424. doi: 10.1007/s12041-014-0395-7.
  • Wang ZX, Yano M, Yamanouchi U, et al. The Pi-b gene for rice blast resistance belongs to the nucleotide binding and leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes. The Plant Journal. 1999;19:55-64. doi: 10.1046/j.1365-313x.1999.00498.x.
  • Yokoo M, Kikushi F, Fujimaki H, et al. Breeding of blast resistance lines (BL1 to 7) from indica-japonica crosses of rice. Japan J Breed. 1978;28:359-385. doi: 10.1270/jsbbs1951.28.359.
  • Tsunoda Y, Jwa NS, Akiyama K, et al. Cloning of the rice blast resistance gene Pi-b. Developments in Plant Pathology. 2000;1:9-16. doi: 10.1007/978-94-015-9430-1_2.
  • Коломиец Т.М. Отбор исходного материала риса для селекции на иммунитет к пирикуляриозу: автореф. дис. … канд. биол. наук. – Голицино,1990. – 21 с. [Kolomiec TM. Otbor iskhodnogo materiala risa dlya selekcii na immunitet k pirikulyariozu [dissertation]. Golicino; 1990. 21 p. (In Russ.)]
  • Супрун И.И., Ильницкая Е.Т., Мухина Ж.М. Создание внутригенного ДНК-маркера гена устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-b и его использование в практической селекции // Сельскохозяйственная биология. – 2007. – № 5. – С. 63–66. [Suprun II, Ilnitskaya ET, Mukhina ZhM. Development of intragene DNA-marker for rice blast resistance gene Pi-b and its using in practical breeding. Selskohozyajstvennaya biologiya. 2007;(5):63-66. (In Russ.)]
  • Супрун И.И., Шиловский В.Н., Рубан В.Я. Селекционные и молекулярно-генетические методы в создании устойчивых к пирикуляриозу линий риса // Вестник российской сельскохозяйственной науки. – 2012. – № 1. – С. 60–62. [Suprun II, Shilovsky VN, Ruban VYa. Breeding and molecular-genetic methods in creating piriculariose-resistant lines in rice. Vestnik rossijskoj selskohozyajstvennoj nauki. 2012;(1):60-62. (In Russ.)]
  • Keen NT. The molecular biology of disease resistance. Plant Molec Biol. 1992;19:109-122. doi: 10.1007/978-94-011-2656-4_7.
  • Suh JP, Roh JH, Cho YC, et al. The Pi40 gene for durable resistance to rice blast and molecular analysis of Pi40-advanced backcross breeding lines. Phytopathology. 2009;99(3):243-250. doi: 10.1094/PHYTO-99-3-0243.
  • Jeung JU, Kim BR, Cho YC, et al. A novel gene, Pi-40(t), linked to the DNA markers derived from NBS-LRR motifs confers broad spectrum of blast resistance in rice. Theoretical and Applied Genetics. 2007;115:1163-77. doi: 10.1007/s00122-007-0642-x.
  • Хавкин Э.Е. Молекулярная селекция растений: ДНК-технологии создания новых сортов сельскохозяйственных культур // Сельскохозяйственная биология. – 2003. – № 3. – С. 26–41. [Khavkin EE. Plant molecular breeding: DNA technologies of creating new crop varieties. Selskohozyajstvennaya biologiya. 2003;(3):26-41. (In Russ.)]
  • Murray MG, Thompson WF. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Thompson Nucleic Acids Research. 1980;10:4321-4325. PMC324241.
  • Stress and disease tolerance. In: http://www.knowledgebank.irri.org/ricebreedingcourse 10.12.2016.
  • Костылев П.И., Краснова Е.В., Редькин А.А., и др. Объединение в одном генотипе риса пяти генов устойчивости к пирикуляриозу с помощью ДНК-маркеров // 8-я Междунар. научно-практ. конф. «Биологическая защита растений — основа стабилизации агроэкосистем». – Краснодар, 2014. – С. 25–28. [Kostylev PI, Krasnova EV, Redkin AA, et al. Combined in one rice genotype five blast resistance genes with DNA markers. 8 Mezhdunar. nauchno-prakt. konf. “Biologicheskaya zashhita rastenij – osnova stabilizacii agroekosistem”. (conference proceedings) Krasnodar; 2014. P. 25-28. (In Russ.)]
  • Костылев П.И., Краснова Е.В., Редькин А.А., и др. Пентаген — новый сорт риса с пятью генами устойчивости к пирикуляриозу, созданный с помощью маркерной селекции // Фундаментальные и прикладные исследования в биоорганическом сельском хозяйстве России, СНГ и ЕС. Междунар. научно-практ. конф. (9–12 августа 2016 г.). Мат. докл., сообщ. – М., 2016. – Т. 2. – С. 113–121. [Kostylev PI, Krasnova EV, Redkin AA, et al. Pentagen – new rice of rice with five genes of resistance to blast, created by marker assisted selection. Fundamentalnye i prikladnye issledovaniya v bioorganicheskom selskom hozyajstve Rossii, SNG i ES. Mezhdunar. nauchno-prakt. konf. 9-12.08.2016 (conference proceedings). Moscow; 2016;2:113-121. (In Russ.)]

Supplementary files

Supplementary Files Action
1. table1eng Download (81KB) Indexing metadata
2. table2eng Download (151KB) Indexing metadata
3. Fig. 1. The panicle of hybrid F1 C101-Lас (Pi-1+33) × Boyarin View (85KB) Indexing metadata
4. Fig. 2. Results of the separation by electrophoresis of the amplification products of DNA plants F2 (C101-Lac × Boyarin) with the RM224 marker to the rice blast resistance gene Pi-1. Note: 39-56 – analyzed plants; B – recipient variety Boyarin; line C101-Lac – donor of gene Pi-1 View (91KB) Indexing metadata
5. Fig. 3. Results of the separation by electrophoresis of the amplification products of DNA plants F2 (C101- A-51 × Boyarin) with the RM527 marker to the rice blast resistance gene Pi-2. Note: 65-110 – analyzed plants; B – recipient variety Boyarin; line C101 A-51 – donor of gene Pi-2 View (86KB) Indexing metadata
6. Fig. 4. Results of the separation by electrophoresis of the amplification products of DNA plants F2 (C101-Lac × Boyarin) with the RM310 marker to the rice blast resistance gene Pi-33. Note: 56-73 – analyzed plants; B – recipient variety Boyarin; line C101-Lac – donor of gene Pi-33 View (88KB) Indexing metadata
7. Fig. 5. Electrophoregrams for dividing the products of DNA amplification of rice plants with RM224, RM527, RM310, IGM Pi-b, IGM Pi-ta to five genes Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-b, Pi-ta, respectively. Lines 1225/13 and 1396/13 (numbers of samples 2 and 19) have dominant al-leles in the homozygous state in five loci, variety Boyarin (B) – recessive. In the presence of the genes Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-b, Pi-ta fragments of 158, 233, 85, 302, 132 bp, respectively, are amplified View (184KB) Indexing metadata

Views

Abstract - 42

PDF (Russian) - 31


Copyright (c) Kostylev P.I., Krasnova E.V., Redkin A.A., Dubina E.V., Mukhina Z.M.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License.