Genetic polymorphism of natural isolates of Nosema Pyrausta (Microsporidia: Nosematidae)

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Тип Микроспоридии — группа одноклеточных эукариот, родственных грибам (Fungi), вместе с другими облигатными внутриклеточными паразитами (Cryptomycota и Aphelidea) составляющая надтип Opisthosporidia (Holomycota: Opisthokonta) [1]. Подавляющее большинство микроспоридий паразитируют в многоклеточных животных, достигая максимального разнообразия и обилия микроспоридий в членистоногих, а также в рыбах. Для целого ряда массовых видов чешуекрылых насекомых микроспоридии выступают в качестве естественных регуляторов численности, способствуя в том числе предотвращению вспышек массового размножения сельскохозяйственных вредителей [2, 3]. Считается, что микроспоридии инвазивных видов членистоногих при передаче популяциям аборигенных видов хозяев соответствующих систематических групп вызывают их угнетение, способствуя успеху видов-интродуцентов, имеющих большую устойчивость к паразитам благодаря сложившимся коэволюционным связям [4–7]. Кроме того, присутствие микроспоридий в производственных культурах насекомых может привести к значительному ухудшению состояния колоний, вплоть до их полной элиминации [2, 3, 8].

Nosema pyrausta (Paillot, 1927) Weiser, 1961 — микроспоридия, описанная из кукурузного мотылька Ostrinia (Pyrausta) nubilalis (Hübner, 1796) (Lepidoptera, Crambidae) во Франции [9]. Заражение кукурузного мотылька микроспоридиями предположительно данного вида регулярно детектировалось в Западной и Восточной Европе [10–12], а также в европейской части России [13]. Весьма существенное влияние микроспоридиоз оказывает на сезонную и многолетнюю динамику численности кукурузного мотылька в Северной Америке, куда вредитель был завезен в начале прошлого столетия [14]. В этой связи неудивительно, что наиболее интенсивно паразит изучается в США [15–18]. В то же время работы по выявлению микроспоридий в кукурузном мотыльке, обитающем в Европе, носят фрагментарный характер [10–13], что тормозит исследования в области видовой идентификации, генетического полиморфизма и разработки методов диагностики этих паразитов в природных популяциях, а также в лабораторных культурах насекомых-хозяев.

В настоящей работе проанализированы нуклеотидные последовательности двух локусов, SSU rRNA и IGS, для четырех изолятов N. pyrausta из двух видов стеблевых мотыльков рода Ostrinia, отловленных на территории России и Беларуси.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для экстракции геномной ДНК использованы следующие изоляты микроспоридий (каждый — из одной зараженной гусеницы насекомого-хозяина): Npyr1 и GM173 из гусениц O. nubilalis, собранных в посевах кукурузы в Гулькевичском районе Краснодарского края в 2014 и 2008 гг. соответственно; Mong1 из O. nubilalis, собранного в Мозырском районе Гомельской области Республики Беларусь в 2015 г.; и SС104 из гусеницы Ostrinia scapulalis (Walker, 1859) Muutura et Monroe, 1970, собранной на дикой конопле в Славянском районе Краснодарского края в 2008 г. Геномную ДНК выделяли по стандартной методике [20]. Для амплификации фрагментов гена рибосомальной РНК, соответствующих локусам малой субъединицы рРНК (small subunit ribosomal RNA, SSU rRNA) и межгенного спейсера (intergeniс spacer, IGS), использовали пары праймеров 18f::1492r [20] и HG4F::5SR [21] соответственно. ПЦР проводили в стандартных условиях с использованием Colored Taq-полимеразы (Силекс, Москва) на амплификаторе «Терцик» (ДНК-Технологии, Москва). Продукты амплификации разделяли электрофоретически в 1 % агарозном геле и очищали из фрагментов геля, расплавленного в растворе 6 М йодида натрия методом сорбции на оксиде кремния [22]. Нуклеотидные последовательности очищенных ампликонов определяли методом секвенирования на генетическом анализаторе ABI Prism Genetic Analyzer 3500, напрямую или предварительно клонировали их в векторе pAL-TA. Полученные нуклеотидные последовательности редактировали вручную в приложении BioEdit [23], сравнивали с таковыми, доступными в Генбанке, с помощью встроенной утилиты BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) и выравнивали в BioEdit с использованием функции Clustal W.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Амплификация локуса SSU rRNA микроспоридий с праймерами 18f::1492r была успешной для всех четырех изолятов микроспоридий, использованных в настоящем исследовании. Размер продуктов амплификации локуса SSU rRNA составил порядка 1200 н. о. Результаты секвенирования показали полную идентичность последовательностей локусов у четырех изолятов. Кроме того, было продемонстрировано их стопроцентное сходство с сиквенсом, депонированным в Генбанке под номером доступа HM566196. Данный гаплотип обнаружен у изолятов микроспоридий из кукурузного мотылька, собранных нами ранее во Франции и в европейской части России.

Указанная нуклеотидная последовательность имеет три точечные мутации на 1198 н. о., то есть характеризуется дивергенцией на уровне 0,03 % по сравнению с таковыми, известными как для типового вида рода Nosema Nägeli, 1857 — Nosema bombycis Nägeli, 1857 (номер доступа AY209011), так и для N. pyrausta, американского происхождения (номер доступа AY958071) (табл. 1). На основании этих данных ранее нами был пересмотрен таксономический статус N. pyrausta, и типовой нуклеотидной последовательностью признана таковая, зарегистрированная для Франции, поскольку типовое место обитания этого паразита — Франция [9]. Обнаружение идентичных последовательностей у паразитов кукурузного мотылька в Краснодарском крае (изоляты Npyr1, GM173 и SC104), а также в Республике Беларусь (изолят Mong1) позволяет считать данный гаплотип «фиксированным» для территории Европы и эталонным (типовым) для N. pyrausta.

N. bombycis — опасный паразит тутового шелкопряда Bombyx mori (L., 1758) (Lepidoptera, Bombycidae), вызывающий заболевание, впервые исследованное Луи Пастером в 1870 г. на примере культуры насекомых, интродуцированных во Францию из Китая [2]. Эта микроспоридия имеет широкое распространение в Европе и Азии и служит объектом многочисленных исследований биологии паразита и его взаимоотношений с насекомым-хозяином, включая разработку средств диагностики и профилактики вызываемого им заболевания [21, 24, 26]. На основании представлений об узкой гостальной специфичности микроспоридий целый ряд форм, отличающихся от N. bombycis прежде всего видом насекомого-хозяина, описаны как самостоятельные виды. Для некоторых из них, однако, идентичность нуклеотидных последовательностей гена SSU rRNA (см. табл. 1), как в случае с Nosema spodopterae Hsu, Hsu et Yen, 1991 и Nosema heliothidis Lutz et Splendor, 1904, позволяет считать их изолятами N. bombycis из Spodoptera litura F., 1775 и Heliothis zea Boddie, 1850 (Lepidoptera: Noctuidae) соответственно, что расширяет круг хозяев для этого вида паразита [19]. В свою очередь, другие виды микроспоридий, заражающие тутового шелкопряда, могут быть ошибочно отнесены к N. bombycis, как, например, изолят GX4 под номером доступа в Генбанке JF443580; однако еще более высокий уровень генетической дивергенции, чем у таких видов, как N. bombycis, N. pyrausta, Nosema antheraeae Simchuk, Lysenko et Chetkarova, 1979 и т. п. (см. табл. 1), позволяет однозначно дифференцировать его как самостоятельный таксон ранга вида. Расхождение нуклеотидных последовательностей гена SSU rRNA на уровне 0,03 % известно для близкородственных, но самостоятельных видов и в других таксонах микроспоридий, например, у Glugea anomala и Glugea gasterostei [27], а также у видов рода Tubulinosema [28–30]. В связи с этим сходство нуклеотидных последовательностей гена SSU rRNA на уровне 99,7 % микроспоридий N. bombycis, N. pyrausta и американского изолята Nosema cf pyrausta указывает на то, что последний таксон представляет самостоятельный вид, не имеющий валидного описания.

 

Таблица 1. Уровни сходства и различия микроспоридий рода Nosema по локусу SSU rRNA Levels of similarity and dissimilarity of SSU rRNA locus of microsporidia of the genus Nosema

Сиквенсы SSU rRNA		Сходство (снизу) и различия (сверху) сиквенсов SSU rRNA
№	Вид микроспоридии	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13
1	Nosema bombycis AY209011	=	0	0	0,001	0,003	0,003	0,002	0,003	0,003	0,005	0,006	0,008	0,009
2	Nosema spodopterae AY747307	1,000	=	0	0,001	0,003	0,003	0,002	0,003	0,003	0,005	0,006	0,008	0,009
3	Nosema heliothidis FJ772435	1,000	1,000	=	0,001	0,003	0,003	0,002	0,003	0,003	0,005	0,006	0,008	0,009
4	Nosema trichoplusiae U09282	0,999	0,999	0,999	=	0,002	0,002	0,001	0,002	0,004	0,006	0,006	0,009	0,010
5	Nosema pyrausta HM566196 (FR)	0,997	0,997	0,997	0,998	=	1,000	0,003	0,004	0,006	0,993	0,008	0,011	0,011
6	Nosema pyrausta Npyr1 (RU)	0,997	0,997	0,997	0,998	1,000	=	0,003	0,004	0,006	0,993	0,008	0,011	0,011
7	Nosema cf pyrausta AY958071 (US)	0,998	0,998	0,998	0,999	0,997	0,997	=	0,003	0,005	0,006	0,007	0,010	0,011
8	Nosema tyriae AJ012606	0,997	0,997	0,997	0,998	0,996	0,996	0,997	=	0,006	0,007	0,008	0,011	0,011
9	Vairimorpha imperfecta AJ131645	0,997	0,997	0,997	0,996	0,994	0,994	0,995	0,994	=	0,006	0,008	0,011	0,011
10	Vairimorpha ceraces EU267796	0,995	0,995	0,995	0,994	0,993	0,993	0,994	0,993	0,994	=	0,001	0,011	0,013
11	Nosema antheraeae EU864526	0,994	0,994	0,994	0,994	0,992	0,992	0,993	0,992	0,992	0,990	=	0,011	0,014
12	Nosema fumiferanae EU219083	0,992	0,992	0,992	0,991	0,989	0,989	0,990	0,989	0,993	0,989	0,989	=	0,016
13	Nosema cf bombycis GX4 JF443580	0,991	0,991	0,991	0,99	0,989	0,989	0,989	0,989	0,989	0,987	0,986	0,984	=
Названия таксонов аннотированы номерами доступа в Генбанке соответствующих сиквенсов (при наличии). Для изолятов N. pyrausta и Nosema cf pyrausta указано географическое происхождение: Франция (FR), Россия (RU) и США (US). Полужирным шрифтом выделен изолят, сиквенс для которого получен в настоящей работе

 

Таким образом, можно отметить, что для такой территории, как Беларусь, освоение которой кукурузным мотыльком, как вредителем кукурузы, отмечается начиная с 2010 г. [31], ассоциированный с природной популяцией этого насекомого-хозяина вид паразита соответствует таковому, зарегистрированному в других географических зонах Европы, где очаги массового размножения вредителя существуют сотни лет. С другой стороны, интродукция кукурузного мотылька в Северную Америку сопровождалась его заражением другим видом микроспоридии. К сожалению, накопленных к настоящему времени данных недостаточно для того, чтобы строить предположения о том, является ли данный паразит аборигенным для Северной Америки, или занесен туда вместе с насекомым-хозяином из Европы.

Размер продуктов амплификации фрагмента гена рибосомальной РНК, включающего локус IGS, составил порядка 500 н. о. Непосредственное секвенирование очищенных из геля продуктов не позволило прочитать нуклеотидную последовательность из-за гетерогенности матрицы, создающей характерную картину наложения пиков. В связи с этим проведено молекулярное клонирование и для каждой пробы отсеквенировано от 1 до 5 клональных вариантов, содержащих локус IGS протяженностью от 243 до 274 н. о. Их сравнительный анализ, показал высокий уровень полиморфизма нуклеотидных последовательностей. В частности, сходство молекулярных клонов в пределах каждого из трех изолятов Npyr1, GM173 и Mong1 колебалось в пределах 63–76, 69–77 и 65–73 % соответственно, а при сравнении их между изолятами — в диапазоне от 62 до 82 %, то есть некоторые варианты проявляли более высокий уровень сходства между изолятами из разных особей насекомого-хозяина и географических популяций, чем в пределах одного изолята (микропопуляции паразита). Аналогично единственный клон IGS, который удалось получить для изолята SC104 из другого вида насекомых-хозяев рода Ostrinia, проявил такой же уровень различий с этими изолятами — от 61 до 74 % (табл. 2). Сходство сиквенсов IGS N. pyrausta с гомологичными референсными сиквенсами N. bombycis колеблется в тех же пределах — от 61 до 74 %, то есть данный локус нельзя считать надежным маркером межвидовой дифференциации этих близкородственных таксонов, поскольку не позволяет провести четких границ между таксонами по уровню сходства нуклеотидных последовательностей, а их вариабельность в пределах изолятов из индивидуальных особей хозяев не позволяет предложить какие-либо из последовательностей в качестве эталонных для определения вида.

 

Таблица 2. Уровни сходства и различий молекулярных клонов IGS четырех изолятов микроспоридии Nosema pyrausta Levels of similarity and dissimilarity of molecular clones of IGS in four isolates of microsporidium Nosema pyrausta

IGS-клоны		Сходство (снизу) и различия (сверху) молекулярных клонов IGS
№	Название	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13
1	Npyr1_A1	=	0,316	0,311	0,346	0,326	0,32	0,335	0,375	0,323	0,302	0,348	0,303	0,389
2	Npyr1_A2	0,684	=	0,243	0,344	0,312	0,185	0,25	0,27	0,206	0,318	0,299	0,3	0,324
3	Npyr1_A3	0,689	0,757	=	0,369	0,283	0,283	0,346	0,34	0,304	0,32	0,311	0,283	0,314
4	Npyr1_A4	0,654	0,656	0,631	=	0,357	0,31	0,332	0,36	0,356	0,381	0,352	0,373	0,382
5	Npyr1_A5	0,674	0,688	0,717	0,643	=	0,33	0,3	0,355	0,317	0,324	0,336	0,247	0,348
6	GM173_B6	0,68	0,815	0,717	0,69	0,67	=	0,27	0,228	0,19	0,342	0,303	0,324	0,310
7	GM173_B7	0,665	0,75	0,654	0,668	0,7	0,73	=	0,308	0,227	0,343	0,281	0,288	0,297
8	GM173_B8	0,625	0,73	0,66	0,64	0,645	0,772	0,692	=	0,26	0,329	0,373	0,356	0,342
9	Mong1_C9	0,677	0,794	0,696	0,644	0,683	0,81	0,773	0,74	=	0,335	0,346	0,275	0,336
10	Mong1_G10	0,698	0,682	0,68	0,619	0,676	0,658	0,657	0,671	0,665	=	0,324	0,29	0,356
11	Mong1_C11	0,652	0,701	0,689	0,648	0,664	0,697	0,719	0,627	0,654	0,676	=	0,351	0,395
12	Mong1_C11	0,697	0,7	0,717	0,627	0,753	0,676	0,712	0,644	0,725	0,71	0,649	=	0,261
13	SC104_D13	0,611	0,676	0,686	0,618	0,652	0,690	0,703	0,658	0,664	0,644	0,605	0,739	=
Для молекулярных клонов N. pyrausta (№ 1–12) указаны названия изолятов и номера плазмид, одинаковыми буквами (А, В, С) отмечены клоны из одной особи насекомого-хозяина, полученные в рамках настоящей работы

 

Аналогичный разброс показателей сходства молекулярных клонов IGS известен для изолятов N. bombycis из различных областей Китая [25, 32] и других видов микроспоридий, например Nosema ceranae Fries et al., 1996, сравнение молекулярных клонов IGS которой проведено для изолятов из различных частей света [33]. И поскольку молекулярные клоны IGS паразита из одной особи хозяина могут различаться еще сильнее, чем между особями с разных материков, необходим поиск других молекулярных маркеров для генотипирования географических изолятов микроспоридий.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проекты № 14-04-31783 и 16-54-00144).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Inna V Grushevaya

All-Russian Scientific Research Institute of Plant Protection (VIZR)

Author for correspondence.
Email: grushevaya_12@mail.ru

Agronomist, Laboratory of agricultural entomology

Russian Federation, Pushkin, Saint Petersburg, Russia

Anastasia N Ignatieva

All-Russian Scientific Research Institute of Plant Protection (VIZR)

Email: edino4estvo@mail.ru

Junior Researcher. Laboratory of microbiological control

Russian Federation, Pushkin, Saint Petersburg, Russia

Julia M Malysh

All-Russian Scientific Research Institute of Plant Protection (VIZR)

Email: malyshjm@mail.ru

Researcher, Laboratory of agricultural entomology

Russian Federation, Pushkin, Saint Petersburg, Russia

Lyudmila I Trepashko

Institute for Plant Protection

Email: belizr@tut.by

Head, Laboratory of entomology

Russian Federation, Priluki, Republic of Belarus

Yuri S Tokarev

All-Russian Scientific Research Institute of Plant Protection (VIZR)

Email: jumacro@yahoo.com

Senior researcher, Laboratory of microbiological control

Russian Federation, Pushkin, Saint Petersburg, Russia

Andrei N Frolov

All-Russian Scientific Research Institute of Plant Protection (VIZR)

Email: cornborer@gmail.com

Head, Laboratory of agricultural entomology

Russian Federation, Pushkin, Saint Petersburg, Russia

References

Supplementary files