STREPTOCOCCUS MUTANS - POSSIBLE RISK FACTOR FOR ANTIBIOTIC RESISTANCE PREVALENCE

Cover Page

Abstract


Aim. To assess the prevalence of erythromycin and tetracycline-resistant S.mutans strains, isolated from child dental deposit; to determine the leading mechanism of their resistance to microlides. Materials and methods. Eighty six S. mutans strains, isolated from the dental deposits of children aged 6-17 years were studied. Screening of erythromycin resistance was fulfilled with two methods - phenotypical and genotypical, tetracycline - with phenotypical alone. Results. The share of S. mutans isolates, phenotypically resistant to erythromycin, was 16 % , to tetracycline - 26,7 %. The prevailing molecular-genetic mechanism of erythromycin resistance - presence of mef A-gene (78,6 % of all erythromycin-resistant strains); 10,5 % of all the studied S. mutans strains is a potential reservoir of antibiotic resistance genes ( erm B and mef A) in the horizontal transmission.

Введение S. mutans из группы Viridans Streptococci (VGS) являются частью нормальной микрофлоры ротовой полости, которая играет важнейшую роль в подавлении колонизации полости рта другими патогенами. Однако вирулентные штаммы S. mutans способны инициировать развитие кариеса зубов. У пациентов со снижением иммунитета (нейтропения, иммунокомпромисс) их наличие считается фактором риска аутоиммунного нефрита, неалкогольного стеатогепатита, атеросклероза, они также способны вызывать серьезные инфекции - эндокардит, сепсис и менингит [1-4, 6, 7]. Кроме того, эти бактерии могут обмениваться генетическим материалом с другими микроорганизмами, разделяющими их среду обитания. Известно, что у S. mutans и других VGS растет устойчивость ко многим антибиотикам, включая макролиды и тетрациклины [4, 9]. Стрептококки приобретают устойчивость к макролидам тремя механизмами: 1) посттранскрипционной модификацией 23S субъединицы рРНК аденин-N6-метилтрансферазами (кодируемые erm-геном); 2) действием эффлюксного насоса, опосредованным геном mef A, что помогает создать низкую концентрацию внутриклеточного лекарственного средства; 3) рибосомными мутациями в ключевом сайте при связывании с антибиотиками. Наиболее распространенный способ обмена детерминантами резистентности среди близкородственных бактерий происходит через генетический перенос in vivo. В одном из исследований была показана сильная корреляционная связь между концентрацией антибиотиков в слюне и ростом уровня колонизации резистентных штаммов S. mutans [12]. И, как следствие, S. pneumoniae или S. pyogenes и многие другие патогенные стрептококки становятся все более устойчивыми к макролидам. Наконец, индукция устойчивости к макролидам также может непреднамеренно способствовать устойчивости к тетрациклину, так как их основные детерминанты резистентности - гены erm B и tet M - часто располагаются на одном и том же мобильном элементе. Таким образом, потенциальную роль S. mutans в качестве резервуара устойчивости к макролидам нельзя игнорировать. Цель исследования - определение распространенности эритромицин- и тетрациклинрезистентных штаммов S. mutans, установление основного механизма приобретения резистентности. Материалы и методы исследования Микробиологическому исследованию был подвергнут зубной налет 80 детей в возрасте 6-17 лет, полученный при профилактическом осмотре в 2016-2017 гг. Пробы зубного налета отбирались стерильными деревянными зубочистками, образцы сразу помещались в пробирки Eppendorf. Содержимым пробирки являлась транспортная среда - триптозно-соевый бульон объемом 200 мкл с содержанием 20%-ной сахарозы и 10 %-ной глюкозы (либо THB, BHI), в который предварительно опускали диск с антибиотиком бацитрацином концентрацией 0,04 ед. в качестве селективного фактора. Пробы хранились при температуре 4 °С и доставлялись в лабораторию в первые сутки после отбора. Культивирование S. mutans осуществлялось при t = 37 °C на дифференциально-диагностических плотных питательных средах Mitis Salivarius agar в микроаэрофильных условиях в течение 24 часов. Чувствительность к эритромицину, клиндамицину и тетрациклину определялась диско-диффузионным методом коммерческими дисками, минимальные ингибирующие концентрации интерпретировались в соответствии с критериями NCCLS (США) [9]. Изоляты S. mutans изучены на устойчивость к макролидам, был определен их фенотип методом «двойных дисков» на чашках Петри с Muller - Hinton агаром. Для этого диски с эритромицином (15 мкг) и клиндамицином (2 мкг) были размещены на расстоянии 16 мм друг от друга. После инкубации отмечалиcь два различных вида устойчивых фенотипов [10]. Устойчивость к клиндамицину и эритромицину интерпретировалась как конститутивный тип макролида - линкозамидстрептомина (cMLSB). Восприимчивость к клиндамицину и резистентность к эритромицину без Д-зоны дифференцировалась как фенотип М. Чувствительность к тетрациклинам также определялась диско-диффузионным методом с концентрацией диска 30 мкг. Геномная ДНК выделялась с помощью набора химических реагентов для получения ДНК из проб («ДНК-экспресс», производство НПФ «Литех», г. Москва) в соответствии с инструкциями производителя. Наличие генов erm В и mef А определяли методом ПЦР-амплификации, используя ранее описанные специфичные праймеры 10-превалентен. Амплификация выполнялась в термоциклере CFX-96 (BIO-RAD, США) с последующей электрофоретической оценкой результатов реакции. Каждый раз при постановке реакции совместно с образцами ставились положительный и отрицательный контроль для предотвращения получения ложных результатов. Анализ ПЦР-продуктов осуществлялся методом гель-электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле с окраской ДНК этидиумом бромида (10 MG/ML) производства «Helixon», г. Москва, и визуализацией в УФ-лучах на трансиллюминаторе «UVT1» производства «Biokom». В качестве стандарта для оценки длины полученных ампликонов использовали маркер длин фрагментов с шагом в 100 пар нуклеотидов производства НПО «Сибэнзим» (8 мкл маркера на дорожку). Электрофорез осуществлялся при помощи источника питания для электрофореза нуклеиновых кислот в агарозных и акриламидных гелях «Эльф-4» и «Эльф-8». Параметры электрофореза: 180 В, 19,0 Вт, 180 мА в течение 25 минут. Результаты и их обсуждение За время обследования были выделены 86 штаммов S. mutans от 80 детей. Из 86 тестируемых изолятов S. mutans у 11 (12,8 %) обнаружен M-фенотип резистентности к макролидам, у 3 (3,5 %) - cMLSB-фенотип. Индуцибельный тип iMLSB выявлен не был. Остальные 72 (83,7 %) штамма были восприимчивы к антибиотикам. Количество фенотипически резистентных штаммов S. mutans к тетрациклину - 23 изолята (26,7 %). Среди 14 резистентных к макролидам изолятов 11 (78,6%) имели mef A-ген. Один (33,3 %) штамм с cMLSB-фенотипом был позитивен на ген erm B. М-фенотип был доминирующим (78,6 %) среди устойчивых к эритромицину штаммов. Другие исследования также показали, что М-фенотип преобладает среди VGS из ротоглотки [5]. В нашем исследовании ген erm B обнаруживался в изолятах с cMLSB-фенотипом, об этом также сообщают и другие исследователи [5, 11]. Ген mef A был обнаружен исключительно у штаммов с фенотипом М. Доля изолятов S. mutans, фенотипически резистентных к эритромицину, составила более 16,0 %, к тетрациклину - 26,7 %. Преобладающий молекулярно-генетический механизм резистентности к эритромицину - наличие mef A-гена (78,6 % всех эритромицинрезистентных штаммов). Из всех исследованных штаммов S. mutans 10,5 % являются потенциальным резервуаром генов антибиотикорезистентности (erm B и mef A) в горизонтальной передаче. Выводы 1. Обнаружена высокая частота резистентности штаммов S. mutans к макролидам и тетрациклинам у детей в Санкт-Петербурге. 2. Необходим мониторинг резистентности к антибиотикам как S. mutans, так и других видов стрептококков, в том числе и молекулярно-генетический. Это поможет координировать направления индивидуальной (ориентированной на пациента) и популяционной терапевтической стратегии.

T V Brodina

brodina23@gmail.com

A V Lyubimova

A E Feting

A V Silin

R F Yusupova

A V Kiselev

E A Klimova

  • Bruckner L., Gigliotti F. Viridans group streptococcal infections among children with cancer and the importance of emerging antibiotic resistance. Semin Pediatr Infect Dis 2006; 17: 153-160.
  • Balletto E., Mikulska M. Bacterial infections in hematopoietic stem cell transplant recipients. Mediterr J Hematol Infect Dis 2015; 7: 101-109.
  • Douglas C. Identity of viridans streptococci isolated from cases of infective endocarditis. J Med Microbiol 1993; 39: 179-182.
  • Gordon, K.A., Beach M.L., Biedenbach D.J., Jones R.N., Rhomberg P.R., Mutnick A.H. Antimicrobial susceptibility patterns of hemolytic and viridans group streptococci: report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (1997-2000). Diag Microbiol Infect Dis 2002; 43: 157-162.
  • Ioannidou S., Papaparaskevas J., Tas-sios P.T., Foustoukou M., Legakis N.J., Vatopoulus A. Prevalence and characterization of the mechanisms of macrolide, lincosamide and streptogramin resistance in viridans group streptococci. Int J Antimicrob Agents 2003; 22: 626-629.
  • Kennedy H.F., Gemmell C.G., Bagg J., Gibson B.E.S., Michie J.R. Antimicrobial susceptibility of blood culture isolates of viridans group streptococci: relationship to a change in empirical antibiotic therapy in febrile neutropenia. J Antimicrob Chemother 2001; 47: 693-696.
  • Luna V.A., Coates P., Eady E.A., Cove J.H., Nguyen T.T., Roberts M.C. A variety of gram-positive bacteria carry mobile mef genes. J Antimicrob Chemother 1999; 44: 19-25.
  • National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing - Thirteenth Informational Supplement M100-S13. NCCLS, Wayne, PA, USA 2003.
  • Seppala H., Haanpera M., Al-Juhaish M., Jarvinen H., Jalava J., Huovinen J. Antimicrobial susceptibility patterns and macrolide resistance genes of viridans group streptococci from normal flora. J Antimicrob Chemother 2003; 52: 636-644.
  • Seppala H., Nissinen A., Yu Q., Huovinen P. Three different phenotypes of erythromycin-resistant Streptococcus pyogenes in Finland. J Antimicrob Chemother 1993; 32: 885-891.
  • Seppala H., Skurnik M., Soini H., Roberts M.C., Huovinen P. A novel erythromycin resistance methylase gene (ermTR) in Streptococcus pyogenes. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42: 257-262.
  • Soriano F., Rodriguez-Cerrato V. Pharmacodynamic and kinetic basis for the selection of pneumococcal resistance in the upper respiratory tract. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2002; 50: 51-58.

Views

Abstract - 64

PDF (Russian) - 69


Copyright (c) 2017 Brodina T.V., Lyubimova A.V., Feting A.E., Silin A.V., Yusupova R.F., Kiselev A.V., Klimova E.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 International License.