Contents of ACTH and CRF in the rat blood serum after administration of orexin A antagonists in experimental alcoholization

Full Text

В настоящее время установлено, что в формирование аддикции вовлечен ряд сигнальных путей, причем в различных случаях зависимости эти пути могут быть различными [1, 2, 5]. В частности, в формировании алкогольной аддикции участвуют сигнальные системы грелинов, орексинов, нейропептида Y, рилизинг-факторов гипофизарных тропных гормонов и другие [1, 2, 4]. Работами последних лет продемонстрирован факт участия грелиновой и орексиновой систем в формировании алкогольной зависимости. В тоже время следует констатировать, что изучение роли грелиновой и орексиновой и других пептидергических систем в механизмах подкрепления и формировании алкогольной аддикции только начинается. При этом немногочисленные исследования в этой области говорят о перспективности экспериментальных исследований значения указанных пептидергических систем в аддикции и возможности фармакологической коррекции элементов зависимости с помощью антагонистов пептидных медиаторов/модуляторов [1, 3, 6]. При фармакологическом воздействии на орексиновую сигнальную систему важно также оценить различия в реакции организма в зависимости от способа введения фармакологического препарата. Традиционным для нейротропных препаратов считают системное введение: внутривенное или внутрибрюшинное (в экспериментальных условиях). Нередко при таком введении системный или висцеральный эффекты превалируют над центральным эффектом в ЦНС. Недавно появившиеся результаты об успешном действии нейроактивных пептидов при интраназальном введении параллельно со снижением побочного системного и висцерального воздействия пептидных препаратов требуют обратить внимание на данный аспект исследования [1, 3, 5, 7]. Целью настоящего исследования было проведение количественного сравнения концентраций кортикотропин-рилизинг фактора (КРФ) и адренокортикотропного гормона (АКТГ) в крови при разных способах алкоголизации: форсированном режиме и хронической алкоголизации. Параллельную задачу составляло выяснение фармакологического действия синтетического и рекомбинантного антагонистов орексина А на систему КРФ - АКТГ на фоне экспериментальной алкоголизации. Материал и методы В работе использовали 89 половозрелых крыс-самцов линии Вистар массой 250-300 г, полученных из питомника Рапполово РАМН (Ленинградская область). В экспериментальных группах число животных составляло от 8 до 10 особей. Животных содержали в стандартных пластмассовых клетках в условиях вивария при свободном доступе к воде и пище в условиях инвертированного света 8.00-20.00 при температуре 22 ± 2 °С. Все опыты проведены в весенне-летний период. 28 крысам этанол вводили внутрибрюшинно, 50 крыс в течение 6 месяцев подвергали полунасильственной алкоголизации 15 %-ным раствором этанола в качестве единственного источника жидкости при свободном доступе к брикетированному сухому корму. Животные контрольной группы в качестве источника жидкости получали воду. Экспериментальные животные были разделены на 10 групп, включая контрольную (получали воду), с хронической (в течение 6 мес.) алкоголизацией и форсированным режимом алкоголизации (этанол вводили 5 дней возрастающими вдвое дозами с 0,5 г/кг до 8 г/кг), с введением синтетического антагониста орексина А SB-408124 5 мкг интраназально, с введением рекомбинантного антагониста орексина АНТ3 5 мкг интраназально, а также в сходных условиях эксперимента, но с отменой этанола и определением концентраций КРФ и АКТГ на 2-е и 7-е сутки после отмены. Использовали два антагониста орексина А: синтетический SB-408124 (Сигма, США) и рекомбинантный (АНТ3, получен в ФГБНУ «ИЭМ»), которые вводили в дозе 5 мкг интраназально в течение 5 дней. Обозначения групп представлены в таблице 1. Экспериментальных животных декапитировали непосредственно после алкоголизации или алкоголизации и введения препаратов (группы II, III, IV, VIII), или через 2 и 7 суток после отмены алкоголя (группы V-VII, IX и X). Непосредственно после декапитации тотально собирали аутопсийную кровь, инкубировали в течение 30 мин при +4 °С и далее центрифугировали при температуре +4 °С и ускорении 300 г в течение 10 мин. Полученные образцы сыворотки крови замораживали и хранили при - 90 °С до проведения иммуноферментного анализа. Концентрации АКТГ и КРФ в образцах сывороток крови определяли путем высокочувствительного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-системы S-1181 CRF (human, mouse, rat) enzyme immunoassay kit: Extraction Free. Peninsuls laboratories, LLC (США). Концентрация АКТГ была определена также путем высокочувствительного твердофазного ИФА с использованием тест-системы S-1130 ACHT (mouse, rat) enzyme immunoassay kit. Peninsuls laboratories, LLC (США). Для статистической обработки полученных количественных данных и построения графиков применяли пакеты программ Graph Pad Prizm v.4; SPSS Sigma Stat 3,0 и Minitab 14. В качестве статистических критериев использовали традиционные показатели описательной статистики. План статистического анализа состоял из описательной и сравнительной статистик. В описательной статистике были вычислены: медиана, среднее, стандартное отклонение, ошибка среднего, 95 %-ный доверительный интервал. Проводили проверку гипотезы о нормальности распределения при помощи критерия нормальности Колмогорова-Смирнова. Данный анализ показал нормальное распределение во всех группах. Сравнительный анализ был выполнен при помощи дисперсионного анализа (ANOVA). В качестве уточняющего статистического показателя был проведен апостериорный анализ (post-hoc) при помощи критерия Бонферрони. Результаты исследований Всего в эксперименте были использованы 89 животных, в том числе в контрольную группу вошли 9 крыс, которые получали воду. Все экспериментальные животные были разбиты на 10 групп. Животные I-VII группы были обследованы непосредственно после процедуры алкоголизации (форсированный вариант алкоголизации и форсированная алкоголизация с отменой алкоголя). Животных VIII-X групп обследовали после двух или семи суток отмены этанола после хронической алкоголизации. Для животных контрольной группы средние значения концентрации КРФ и АКТГ составили 2,401 ± 0,66 нг/мл и 0,574 ± 0,24 нг/мл соответственно. Для того чтобы оценить значимость статистических различий между группами, была проведена оценка соответствия распределений в группах нормальному (гауссовому) путем использования критерия нормальности Колмогорова-Смирнова. Вследствие малого и неоднородного объема выборок в группах с учетом отрицательных показателей критерия нормальности было сочтено целесообразным использование непараметрических критериев сравнения, в частности ANOVA. Средние значения концентраций КРФ для алкоголизации в форсированном режиме 3,16 ± 0,64 нг/мл и полупринудительной алкоголизации 2,59 ± 0,34 нг/мл не демонстрировали значимых различий для рассматриваемых экспериментальных групп. То же самое следует сказать о содержании АКТГ, которое соответствовало 0,28 ± 0,086 нг/мл для форсированного режима и 0,50 ± 0,34 нг/мл для хронической (6 мес.) алкоголизации. Проведение алкоголизации как в форсированном, так и в длительном хроническом режиме приводили к практически одинаковому возрастанию уровней обоих гормонов (рис. 1 и 2). Интраназальное введение синтетического антагониста не влияло на эффект алкоголизации, проведенной в форсированном режиме, по показателям содержания АКТГ и КРФ. Введение рекомбинантного антагониста также не снижало эффекта алкоголизации в форсированном режиме. Проведенные эксперименты и последующая обработка данных показали, что в ходе экспериментальной хронической алкоголизации концентрация АКТГ и КРФ в сыворотках имела тенденцию к повышению, хотя различия не были статистически значимы, скорее всего в силу малого объема выборки. Также была определена корреляция для переменных концентраций КРФ и АКТГ. Результаты проведенного анализа показали наличие положительной корреляционной зависимости для контрольной группы, группы форсированной алкоголизации и группы хронической алкоголизации. Уровни статистической значимости корреляций составили, соответственно, p = 0,01, p = 0,02 и p = 0,022. Обсуждение полученных результатов В настоящее время нейроэндокринологи различают гипофизарное и экстрагипофизарное действие КРФ [1, 2, 4]. Под гипофизарным действием понимают стимуляцию продукции АКТГ клетками аденогипофиза с последующей активацией всей оси гипоталамус-гипофиз-надпочечники. Под экстрагипофизарным действием КРФ понимают активацию сигнальных путей посредством связывания КРФ с рецепторами в различных отделах головного мозга. Одновременно проведенное в единой серии опытов определение КРФ и АКТГ позволило оценить, насколько различные формы экспериментальной алкоголизации затрагивают систему КРФ-АКТГ, т. е. гипофизарную составляющую действия КРФ. Как показали проведенные экспериментальные исследования, имеет место практически одинаковое возрастание уровня КРФ и АКТГ в сыворотке, как при алкоголизации в форсированном режиме, так и длительной хронической алкоголизации. Полученные данные говорят о том, что система КРФ-АКТГ реагирует на алкоголизацию слабее по сравнению с изученной ранее грелиновой системой [2, 3]. Соответственно, КРФ и АКТГ представляют собой менее эффективные индикаторы алкоголизации, чем, например, неацилированный грелин, способный связываться в том числе и с рецепторами КРФ в головном мозге. В результате интраназального введения синтетического и рекомбинантного антагониста орексина А отмечено незначительное, статистически незначимое снижение концентраций КРФ и АКТГ по сравнению с животными, подвергнутыми алкоголизации в форсированном режиме. Данный факт можно интерпретировать как отсутствие заметного системного воздействия в отношении системы КРФ - АКТГ при интраназальном введении антагонистов орексина А. Тем самым подтверждается мнение о том, что интраназальное введение нейроактивных пептидов позволяет минимизировать побочные системные и периферические воздействия нейротропных препаратов за пределами ЦНС [5, 6]. Выводы 1. Хроническая (в течение 6 мес.) и форсированная (введение алкоголя в возрастающих дозах до максимально переносимых) алкоголизация повышает содержание АКТГ и КРФ в крови практически на одинаковую величину. 2. Отмена этанола после форсированной или хронической алкоголизации приводит к снижению повышенного уровня обоих гормонов вследствие алкоголизации. 3. Антагонисты орексина А (синтетический и рекомбинантный) при интраназальном введении умеренно снижают концентрации КРФ и АКТГ, повышенные при алкоголизации. 4. Система КРФ-АКТГ отличается высокой устойчивостью при алкоголизации, а также введении антагонистов орексина А.

About the authors

Petr Mikhailovich Vinogradov

Institute of Experimental Medicine

Email: pdshabanov@mail.ru
Post-Graduate Student, S. V. Anichkov Dept. of Neuropharmacology

Ilya Yurievich Tissen

Institute of Experimental Medicine

Email: pdshabanov@mail.ru
Post-Graduate Student, S. V. Anichkov Dept. of Neuropharmacology

Platon Platonovich Khokhlov

Institute of Experimental Medicine

PhD (Biochemistry), Senior Researcher, S. V. Anichkov Dept. of Neuropharmacology

Eugeny Rudolfovich Bychkov

Institute of Experimental Medicine

Email: bychkov@mail.ru
PhD (Biochemistry), Senior Researcher, S. V. Anichkov Dept. of Neuropharmacology

Andrei Andreevich Lebedev

Institute of Experimental Medicine

Email: aalebedev-iem@rambler.ru
Dr. Biol. Sci. (Pharmacology), Professor, Leading Researcher, S. V. Anichkov Dept. of Neuropharmacology

Petr Dmitriyevich Shabanov

Institute of Experimental Medicine

Email: pdshabanov@mail.ru
Doct. of Med. Sci. (Pharmacology), Professor and Head, S. V. Anichkov Dept. of Neuropharmacology

References