Association between polymorphic markers of IL-10 gene and chronic diseases of the upper respiratory tract in children living under technogenic pressure

Full Text

Введение Заболевания верхних дыхательных путей занимают одно из ведущих мест в структуре детской заболеваемости. На их долю приходится около 70 % заболеваемости и наблюдается тенденция к росту. В связи с этим лор-патология у детского населения является важной медико-социальной проблемой (Перевощикова с соавт., 2006; Bellanti, 1997). В генезе заболеваний верхних дыхательных путей (ВДП) все большее значение уделяется экологическим факторам. Многочисленные исследования доказывают, что загрязнение атмосферного воздуха является одной из причин повышения заболеваемости органов дыхания и изменения иммунного статуса, поскольку слизистая оболочка ВДП в первую очередь подвержена воздействию химических загрязнителей, которые поступают в организм ингаляционным путем (Коленчукова, Савченко, 2005; Третьякова с соавт., 2009; Шамсияров с соавт., 2002). Важную роль в развитии заболеваний респираторного тракта, как инфекционной, так и аллергической природы, играют нарушения в функционировании иммунной системы. Изменения уровней цитокинов, являющихся медиаторами воспаления, могут быть одной из причин развития патологических процессов и тяжести их течения (Доржиева с соавт., 2011; Корытина с соавт., 2008; Фрейдин с соавт., 2002; Gong et al., 2006). Интерлейкин-10 (IL-10) относится к ключевым регуляторам синтеза провоспалительных цитокинов и защищает, тем самым, ткани от повреждения при воспалении (Анохина, 2013). Снижение его содержания приводит к ослаблению ингибирующего действия на синтез провоспалительных цитокинов и, как следствие, повышению их уровней и развитию неадекватного воспалительного или аллергического процесса (Геренг с соавт., 2011). В то же время избыток IL-10 вызывает снижение содержания антимикробных пептидов (β-дефензин, HBD3, и LL-37), в результате чего может происходить снижение противоинфекционной защиты (Серебренникова, Семинский, 2008; Ong et al., 2006). В настоящее время в гене IL-10, локализованном на 1-й хромосоме в области 1q31-1q32, включающем 5 экзонов и 4 интрона и охватывающим 5,2 т. п.н., известно 49 полиморфных маркеров, из которых 28 находятся в промоторной зоне и 13 из них рассматриваются в качестве регуляторов транскрипции. Наиболее изучены однонуклеотидные замены в положениях (-1082), (-819) и (-592) гена IL-10, которые обусловливают низкий синтез его белкового продукта (Благодатских с соавт., 2011; Eskdale et al., 1998; Gong et al., 2006; Howell, Rose-Zerilli, 2007). Известно, что в некоторых случаях генетический полиморфизм может вызывать изменение содержания белка или нарушение его функциональной активности (Доржиева с соавт., 2011). Результаты эпидемиологических исследований показали, что в основе хронического воспалительного процесса респираторного тракта лежит генетическая предрасположенность организма (Караулов, Ликов, 2004). В связи с этим изучение генов, контролирующих синтез цитокинов, позволяет прогнозировать риск развития патологии и особенности ее течения, а также подобрать терапию для пациента с учетом его индивидуальных особенностей. На основании выше изложенного целью настоящей работы явилось изучение ассоциаций между полиморфными маркерами гена IL-10 и хроническими заболеваниями верхних дыхательных путей у детей, проживающих в условиях техногенного прессинга. Материалы и методы В обследование был включен 281 подросток в возрасте 14-17 лет, проживающий на территории промышленных центров Иркутской области, после подписания их родителями информированного согласия. 189 обследованных детей проживали на территории с высоким уровнем загрязнения атмосферного воздуха (I группа). Группу сравнения составили 82 школьника из города с умеренным уровнем загрязнения атмосферы. На основании полученных данных анамнеза и врачебного осмотра в каждой группе были выделены лица, имеющие хроническую патологию верхних дыхательных путей (ХП ВДП) (Тихонова, Ефимова, 2012). На момент обследования обострения заболеваний у детей не отмечалось. Для молекулярно-генетических исследований использовали ДНК, выделенную из лейкоцитов цельной крови. Забор крови производился с использованием вакуумной системы, содержащей в качестве антикоагулянта К3-ЭДТА (1,2-2,0 мг сухого реагента на 1 мл крови). После удаления плазмы, образцы крови аликвотировали и хранили при -70 °С. Выделение ДНК проводили модифицированным методом с использованием набора реагентов «ДНК-экспресс» (ООО НПФ «Литех», Россия) (Белик с соавт., 2014). Аллельные варианты -1082G/A, -592C/A, -819C/T гена IL-10 исследовали при помощи наборов реагентов SNP-экспресс (ООО НПФ «Литех», Россия). Проведение реакции амплификации осуществлялось с двумя парами аллель-специфичных праймеров. Разделение продуктов амплификации осуществляли методом горизонтального электрофореза в 3%-м агарозном геле. Визуализацию полученных амплификатов в электрофореграмме проводили в проходящем УФ-свете после окраски бромистым этидием. Распределение генотипов проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга в программе www.оege.org/software/hwe-mr-calc.shtml с использованием Hardy-Weinberg equilibrium calculator (Rodriguez еt al., 2009). Наличие различий в распределениях частот аллелей гена в группах обследованных оценивали по критерию χ2 при помощи программы «STATISTICA 6.0». При р < 0,05 различия между выборками считали статистически значимыми и рассчитывали отношение шансов. Результаты исследования Распределение изученных генотипов среди школьников каждой группы соответствовало равновесию Харди-Вайнберга. В результате исследования установлено, что гомозиготами по аллели -1082G гена IL-10 являлись 22,2 и 27,5 % детей из городов с высоким и умеренным уровнем загрязнения атмосферы, соответственно (табл. 1). Полученные результаты согласуются с данными других исследователей. Так, Gong M. N. с соавторами установили, что среди лиц изучаемой ими контрольной группы 24,2 % имели генотип GG (Gong et al., 2006). В исследованиях Giordani L. гомозиготами по аллели -1082G среди практически здоровых волонтеров являлись 33,0 % (Giordani et al., 2003). При сравнении частот встречаемости данного генотипа и аллелей в изучаемых нами группах детей, проживающих в условиях высокого и умеренного загрязнения воздуха, различий выявлено не было. Также не установлено статистически значимых различий в частоте встречаемости полиморфных маркеров в позиции -592. В группе I генотип СС встречался у 57,8 % детей, а у школьников группы сравнения - в 54,6 % случаев. Это согласуется с данными авторов, характеризующими распределение генотипов IL-10 по аллели -592 С среди населения Российской Федерации: гомозиготами СС являются от 57 до 64 % практически здоровых людей (Благодатских с соавт., 2011; Машкина с соавт., 2014). При анализе полиморфизма промоторной области гена IL-10 в позиции -819 статистически значимых межгрупповых различий выявлено не было. Генотип СС выявлен у 51,3 % детей первой группы и у 56,1 % - группы сравнения. В исследованиях Машкиной Е. В. с соавторами установлено, что в 60,5 % случаев обследованные здоровые женщины являлись гомозиготами по аллелю -819 С (Машкина с соавт., 2014). По данным Доржиевой Н. Э., генотип СС отмечен у 76,0 % обследованных русских и 71,6 % бурят (Доржиева с соавт., 2011). При анализе полиморфизма гена IL-10 среди здоровых детей и их сверстников, имеющих ХП ВДП, проживающих в городе с умеренным уровнем загрязнения атмосферного воздуха, установлены статистически значимые различия частоты встречаемости однонуклеотидных замен по позициям -1082 и -592 (табл. 2). Так, среди детей с ХП ВДП из группы сравнения реже встречались гетерозиготы -1082GA и гомозиготы -529 СС гена IL-10, по сравнению со здоровыми (OR = 0,51, 95 %СI = 0,26-0,99, р = 0,045 и OR = 0,50, 95 %СI = 0,25-1,00, р = 0,051 соответственно). При сравнении частоты встречаемости генотипов по полиморфизму -819 С/Т гена IL-10 среди здоровых детей и имеющих ХП ВДП из города с высоким уровнем загрязнения атмосферы статистически значимых различий выявлено не было. Анализ частоты встречаемости генотипов по полиморфным локусам -1082G/A, -592C/A, -819C/T гена IL-10 в группах здоровых подростков и с ХП ВДП, проживающих в городе с высоким уровнем загрязнения не выявил статистически значимых различий в их распределении (табл. 3). ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Причины развития хронической патологии верхних дыхательных путей многочисленны и разнообразны. Индивидуальная восприимчивость к инфекциям зависит как от патогенности микроорганизма, так и от факторов окружающей среды и состояния иммунной системы (Караулов, Ликов, 2004). Формирование патологии ВДП всегда включает в той или иной степени изменение специфической и неспецифической местной иммунной защиты, клеточного и гуморального звеньев иммунной системы в целом. Существенную роль в их функционировании играют цитокины. Особенности генотипа по генам про- и противовоспалительных цитокинов могут обусловливать их повышенную/сниженную продукцию или нарушение баланса между ними, что определяет различный характер протекания воспалительного ответа. По мнению некоторых исследователей, генетически обусловленной является до 75 % индивидуальной вариации экспрессии IL-10 (Eskdale et al., 1998; Howell, Rose-Zerilli, 2007). Гаплотип -1082 А, -819 Т и -592 А ассоциирован с низким уровнем синтеза данного цитокина (Giordani et al., 2003; Gong et al., 2006; Howell, Rose-Zerilli M., 2007). Среди обследованных детей гаплотип АТА встречался в 0,96 % случаев, доля детей с данным гаплотипом в группах I и II статистически значимо не различалась и составила 1,56 % и 0,43 % соответственно. Так же не выявлены различия по частоте его встречаемости среди здоровых школьников и имеющих ХП ВДП как в группе I (1,94 % и 1,51 % соответственно), так и в группе II (0,66 % и 0,00 % соответственно). По данным литературы, на продукцию IL-10 в большей степени влияет замена -592 С/А. Аллель А обусловливает изменение содержания мРНК и, следовательно, синтеза белка (Eskdale et al., 1997; Gong et al., 2006) и является маркером его низкой продукции (Благодатских с соавт., 2011; Eder et al., 2007; Lowe et al., 2007). Нами установлено, что дети, проживающие в условиях умеренного загрязнения воздуха, имеющие ХП ВДП, и без таковой отличаются друг от друга генотипами IL-10. Так, аллель С в позиции -592 встречалась реже среди школьников с ХП ВДП (OR = 0,53, 95 %СI = 0,36 - 0,90, р = 0,019). Это позволяет предположить, что дети с данной однонуклеотидной заменой имеют сниженный уровень IL-10, который способен подавлять экспрессию МНС II класса, пролиферацию Т-клеток, а также ингибировать синтез провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, IL-8, Il-12), интерферона в лимфоцитах и макрофагах, защищая ткани от повреждения при воспалении (Анохина, 2013; Михалевич, Исмаил, 2004). Таким образом, аллель С полиморфного локуса -592C/A маркирует устойчивость к развитию хронической патологии верхних дыхательных путей у детей, проживающих в условиях умеренного загрязнения атмосферного воздуха. Наличие нуклеотидной замены в данном положении может являться одной из причин развития хронических заболеваний респираторной системы. При этом среди школьников, длительно проживающих в условиях высокого уровня загрязнения атмосферы, развитие ХП ВДП не обусловлено нуклеотидной заменой в позиции -592 гена IL-10. Возможно, что для данной группы более значимую роль в формировании патологии играют высокие риски нарушения иммунитета и возникновения патологии органов дыхания (5,6 и 13,9 соответственно), обусловленные загрязнением атмосферного воздуха (Ефимова с соавт., 2009), что приводит к нивелированию вклада генетических факторов в развитие хронической патологии ВДП. Авторы выражают искреннюю благодарность заведующей лабораторией медицинской экологии ФГБУ «ВСНЦ ЭЧ» СО РАМН д. м. н., профессору Наталье Васильевне Ефимовой за организацию санитарно-гигиенических исследований изучаемых районов и обследования детей, врачу высшей категории клиники ФГБУ «ВСНЦ ЭЧ» СО РАМН к. м. н. Инне Владимировне Тихоновой за проведение клинического осмотра детей и постановку медицинского заключения.

About the authors

Lyudmila Borisovna Masnavieva

FSBI East-Siberian Scientific Center of Human Ecology, Siberian Branch of the RAMS

Email: Masnavieva_luda@mail.ru
Senior Researcher, PhD, biochemical laboratory

Irina Valer’yevna Kudaeva

FSBI East-Siberian Scientific Center of Human Ecology, Siberian Branch of the RAMS

Email: Kudaeva_irina@mail.ru
Head of the Laboratory, MD, biochemical laboratory

References

Supplementary files