Cryptic species in plants and their detection by genetic differentiation between populations

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Криптическими (или скрытыми) называют виды, морфологически настолько сходные, что при таксономическом анализе входящие в них особи были отнесены к одному виду, но позже, при более детальном анализе, было выяснено, что они репродуктивно изолированы и различаются какими-либо другими особенностями (поведенческими, экологическими, цитогенетическими и др.). Описание форм, подходящих под описание криптических видов, можно прочесть еще у Ч. Дарвина (Darwin, 1859) - «формы, обладающие признаками вида, но настолько сходные с другим видом или связанные с ним рядом промежуточных градаций, что натуралисты не склонны относить их к отдельному виду». Однако сам термин «криптический» применительно к виду впервые появился в работе Дарлингтона (1940). Вскоре Э. Майр (Mayr, 1942) предложил использовать (возможно, неудачно - см. ниже) термин sibling species как виды-двойники - виды, которые невозможно распознать по морфологическим различиям, по крайней мере, что важно подчеркнуть, при обычном таксономическом анализе. Существование криптических видов было одним из главных аргументов за использование биологического критерия вида (Mayr, 1963). Нередко более пристальное изучение таких видов, привлечение дополнительных морфолого-анатомических признаков, все же позволяло обнаружить между ними небольшие отличия, тогда их называли «псевдо-криптическими», «псевдо-двойниками» или «полукриптическими» (Knowlton, 1993; Dong et al., 2012). Таким образом, для некоторых видов статус «криптических» можно считать временным но важным этапом в ходе их изучения. Хотя термин «виды-двойники» редко используется нашими ботаниками, хочется отметить, какая это удачная замена (скорее, чем перевод) английского «sibling species». Последнее было введено Майром (1942), с уточняющей оговоркой о широком понимании, но часто используется как синоним термина «криптический вид». Между тем, как неоднократно указывалось (Steyskal, 1972; Knowlton, 1993; Bickford et al., 2007), главный смысл в термине «sibling» - генетическая близость. Энтомолог G. Steyskal (1972) полагал, что само предложение термина sibling в значении «виды-двойники» и его широкое распространение является искажением (perversion) основного смысла термина, так как в нем упор на родство, а не на сходство. Всё же недавно было предложено (Bickford et al., 2007) использовать sibling species в значении «сестринские криптические виды» в отличие от sister species - сестринские виды вообще. Однако ещё Steyskal (1972) подчёркивал, что если виды сестринские, они непременно и «siblings». Нам представляется, что в связи с открывшейся в последние годы частой встречаемостью криптических видов, следовало бы рекомендовать использование именно этого термина (cryptic species) в статьях на английском. При этом стоит учесть, что именно несестринский статус выявляемых внутривидовых линий (немонофилетичность вида) часто является аргументом в пользу трактовки этих линий как видов (а не подвидов или разновидностей) в соответствии с филогенетической или генеалогической концепциями вида. Однако часто криптическими видами называют и сестринские линии. Свидетельством того, что речь в данном случае идет именно о видообразовании, считают наличие явной филогенетической структуры (высокий уровень дивергенции последовательностей и четкое разделение линий с высокой статистической поддержкой) и дополнительные географические, экологические или иные различия. В настоящее время важным свидетельством наличия криптических видов признается выраженная внутривидовая генетическая дифференциация, первым молекулярным методом выявления которой был электрофоретический анализ изозимов, затем добавились методы анализа нуклеотидных последовательностей ДНК. Ситуация с выявлением криптических видов особенно резко поменялась с внедрением ПЦР (полимеразной цепной реакции), когда стало возможным массово секвенировать протяженные участки геномов, что стимулировало молекулярно-филогенетические исследования, в том числе на видовом уровне. От использования в работах отдельных образцов, представляющих вид, перешли к анализу множества их. Такая возможность предопределила появление подхода, названного ДНК- штрихкодирование, заключающегося в секвенировании у разных (конечная цель - всех) видов определенного (ДНК-штрихкодового) участка генома, нуклеотидная последовательность которого у всех видов разная и может обеспечить молекулярную идентификацию вида (Hebert et al., 2003, см. Шнеер, 2009). Подход предполагает, в идеале, чтобы ДНК-штрихкод вида был определен на основе анализа множества образцов, представляющих всё его эколого-географическое разнообразие. Устанавливаются определенные пороговые значения внутривидовой дивергенции для данного участка генома (и для данной таксономической группы), при превышении которых следует рассмотреть возможность, что это может быть не один вид. Кроме того, как упоминалось выше, выявляемая немонофилия образцов какого-либо вида при построении филогенетического древа по секвенированным последовательностям служит указанием на возможное наличие криптических видов. В результате развертывания работ по ДНК-штрихкодированию появилось множество сообщений о выявлении в пределах одного вида в разных группах животных молекулярно дивергентных линий, которые могут оказаться отдельными видами. Было замечено, что количество обнаруживаемых криптических видов у животных увеличивается в последние годы экспоненциально (Bickford et al., 2007), и эта тенденция не ослабевает. Много их находят в тех группах, где скудны морфологические признаки, например, у земляных червей, причем в разных родах и на разных территориях (Novo et al., 2010), и особенно много - у очень мелких организмов, например, микроскопических простейших (Harper et al., 2009). Но и у более крупных животных криптические виды встречаются гораздо чаще, чем это ранее предполагали. Их находят даже в давно известных и хорошо изученных видах. Часто в одном виде обнаруживается по 2-3 вида, иногда их число превышает десяток. Их много у беспозвоночных, наибольшее количество пока найдено у ракообразных остракод Eucypris virens - 35 (Koenders et al., 2012). Немало их обнаруживается и у позвоночных, например, в виде рыб Schindleria praematura найдено 14 видов (Kon et al., 2007), у лягушки Limnonectes kuhlii - 16 (McLeod, 2010), и предполагают, что их много даже в таких, лучше других исследованных группах, как млекопитающие. Часто криптические виды находят на малоисследованных территориях, например, в бассейне Амазонки (Fouquet et al., 2007), и особенно часто - в недостаточно изученных средах, водной, почвенной (Knowlton, 1993). Последнее в полной мере относится к грибам и водорослям, многие из которых живут в почвенной и водной среде и, к тому же, часто представлены очень мелкими организмами. Сообщений об обнаружении криптических видов у грибов очень много (Pavlic et al., 2009; Bennett et al., 2011). У них, впрочем, и до появления молекулярных методов скрупулезное изучение отдельных видов на большом и представительном материале почти в каждом случае выявляло репродуктивно изолированные линии, часто различающиеся по патогенности, условиям роста или по виду организма-хозяина (Hawksworth, Rossman, 1997; Михайлова и др., 2009). Допускают, что у водорослей около половины всех неописанных еще видов может быть представлено криптическими видами (Guiry, 2012). Их находят особенно много у красных (Saunders, 2005; Payo et al., 2012), но также у зеленых (Fawley et al., 2005), диатомовых (Amato et al., 2007), бурых (Poong et al., 2013) водорослей. Авторы обзора-сводки по криптическим видам отметили, что на удивление мало сообщений об их обнаружении у растений (Bickford et al., 2007), хотя выдающийся ботаник-эволюционист В. Грант допускал, что виды-двойники встречаются во многих видах высших растений, особенно в сочетании с полиплоидией (Grant, 1971). Далее в обзоре будет рассмотрено выявление криптических видов у споровых и семенных растений путем исследования внутривидовой молекулярной дифференциации. ПРИЧИНЫ РЕДКИХ НАХОДОК КРИПТИЧЕСКИХ ВИДОВ У РАСТЕНИЙ Впрочем, сразу укажем, что поиск статей для обзора (Bickford et al., 2007) велся по ключевым словам «cryptic species» и «sibling species». Однако знакомство с литературой показывает, что эти термины (особенно второй) более популярны у зоологов, тогда как ботаники не всегда прибегают к ним, констатируя в работе выявление возможного нового вида в пределах существовавшего, даже в тех случаях когда дифференцирующие морфологические признаки не найдены. Так, филогения семейства Apiaceae (Зонтичные) очень активно изучается молекулярными методами и часто исследуется много образцов каждого вида. Считается, что виды в нем неплохо разграничены. Мы взяли такие работы по 5 небольшим родам и обнаружили, что в четырех из них у одного вида была обнаружена выраженная внутривидовая дивергенция по ITS участку, позволившая авторам предположить наличие новых видов (Downie et al., 2004; Lee, Downie, 2006; Feist, Downie, 2008). Изучение нуклеотидных последовательностей у представительной выборки ряда видов бобовых из рода Coursetia позволило обнаружить наличие двух новых видов (Duno de Stefano et al., 2010; Queiroz, Lavin, 2011). Исследование 7 видов злаков из рода Cynоdon выявило более 7 групп гаплотипов (по хлоропластным участкам), авторы работы предположили, что две группы могут представлять новые виды (Jewell et al., 2012). В упомянутых случаях новые виды не были названы криптическими, поэтому они не попадают в число соответствующих статей при поиске по ключевым словам (и не включены в нашу таблицу), по-видимому, немало подобных случаев и в работах по другим таксонам. Авторы, обнаруживающие криптические виды у растений, обсуждая причины их редких находок в молекулярных исследованиях, допускают, что классификации растений, основанные на морфологии, высоко надежны (Okuyama, Kato, 2009), но подчеркивают, что экспериментальных работ такого рода явно недостаточно. Число исследованных образцов может быть очень важным фактором. Сообщения о нахождении криптических видов у животных, как правило, основаны на изучении большого числа образцов. К сожалению, для растений нет таких надежных вариабельных молекулярных маркеров, как для животных. У большинства животных высокая и относительно стабильная по темпам накопления вариабельность присуща митохондриальным генам, один из которых (половина субъединицы гена цитохромоксидазы СО1) используется в качестве ДНК-штрихкода в большинстве таксономических групп. У большинства растений митохондриальная ДНК эволюционирует медленно и неравномерно (подвержена частым перестройкам, что не позволяет использовать универсальные праймеры для амплификации). У растений на видовом уровне наиболее информативными являются хлоропластные некодирующие последовательности (интроны и спейсеры), а также ядерные внутренние и внешние транскрибируемые спейсеры рибосомальных генов (ITS1, ITS2 и ETS). Высоко вариабельны ядерные низкокопийные гены, но последние гораздо успешнее амплифицируются из свежего материала, чем из гербарного, что ограничивает их использование. Кроме того, уровень их вариабельности может сильно варьировать даже у близких видов - участок, демонстрирующий высокую вариабельность в одной группе видов растений, не обязательно будет таковым в другой группе, поэтому приходится проводить предварительный поиск подходящих маркеров, что тормозит темпы исследований. В некоторых случаях авторы, при нахождении внутривидовой дифференциации, констатировали, что для окончательного решения о статусе разных линий необходимо исследование дополнительных образцов (Särkinen et al., 2011; Kadereit et al., 2012). Есть основания полагать, что по мере увеличения выборок число обнаруживаемых криптических видов растений будет расти быстрее. КРИПТИЧЕСКИЕ ВИДЫ У СПОРОВЫХ РАСТЕНИЙ Тем не менее надо оговорить, что у споровых растений - мохообразных и папоротников, криптические виды выявлялись молекулярными методами уже давно - поначалу методом электрофореза изозимов. При некоторой скудости морфологических признаков мохообразных построить основанную на них систему очень непросто. Некоторые виды, при единообразии морфологических признаков, занимают очень широкие ареалы, встречаясь на разных континентах, в различных условиях, и вопрос о том, действительно ли столь разобщенные популяции представляют один вид, занимал бриологов давно. Уже к 2001 году методом электрофореза энзимов были достоверно выявлены криптические виды не менее чем в 7 видах мхов (Fontinalis antipyretica, Mielichhoferia elongata, M. mielichhoferiana, Mnium hornum, Neckera pennata, Plagiomnium ciliare, Polytrichum commune) и 7 видах печеночниц (Aneura pinguis, Conocephalum conicum, Marchantia polymorpha, Pellia endivifolia, Porella cordeana, Reboulia hemisphaerica, Riccia dictiospora). Эти случаи описаны в обзорной работе (Shaw, 2001). При этом было найдено, что, например, представитель маршанциевых Conocephalum conicum включает 6-7 морфологически очень сходных видов, генетическое расстояние между которыми больше, чем между многими морфологически различными видами маршанциевых. Оценка дивергенции последовательностей участков ДНК подтвердила многие результаты, полученные электрофоретически, и расширила список предполагаемых находок криптических видов у мхов: Pyrrhobrium mnioides (McDaniel, Shaw, 2003), в нескольких видах рода Campylopus (Stech, Wagner, 2005), у Grimmia laevigata (Fernandez et al., 2006), Hamatocaulis vernicosus (Hedenäas, Eldenäas, 2007), Leptodon corsicus (Sotiaux et al., 2009). В видовом комплексе Orthotrichum consimile было обнаружено 4 криптических вида (Medina et al., 2012). Много их выявлено у печеночников: Pellia epiphylla (Fiedorow et al., 2001), Conocephalum japonicum (Miwa et al., 2003), Herbertus sendtneri (Feldberg et al., 2004), Ptychanthus striatus (Ahonen et al., 2005), Marchesinia brachiata (Heinrichs et al., 2009), Metzgeria furcata, M. conjugata (Fuselier et al., 2009), Adelanthus lindenbergianus (Feldberg et al., 2010), Frullania asagrayana (Ramaiya et al., 2010), F. tamariscii (Heinrichs et al., 2010), Ptilidium ciliare (Kreier et al., 2010), Diplasiolejeunea pauckertii, D. cavifolia (Dong et al., 2012). В виде печеночника Frullania tamariscii, возможно, содержится до 8 видов (Heinrichs et al., 2010). Криптический вид, описанный как Herbertus norenus, был найден среди образцов Herbertus borealis в ходе разворачивающихся работ по ДНК-штрихкодированию (Bell et al., 2012). В ряде случаев исследование молекулярных маркеров позволило решить давно стоявшие вопросы о самостоятельности некоторых видов мохообразных. Так, в 1919 году был обнаружен подземный беловато-желтоватый печеночник, который приняли за бесхлорофильную форму вида Aneura pinguis (L.) Dumort.; позже его описали как Cryptothallus mirabilis Malmb. Оба варианта находили сторонников, пока анализ участков ядерного, хлоропластного и митохондриального геномов не дали оснований полагать, что печеночник представляет собой самостоятельный вид рода Aneura - A. mirabilis (Malmb.) Wickett & Goffinet (Wickett, Goffinet, 2008). Молекулярный анализ помог положительно решить и вопрос о видовой самостоятельности Homalothecium mandonii, встречающегося на Мадейре и морфологически очень сходного с H. sericeum, распространенным в западной Палеарктике и Северной Америке (Huttunen et al., 2008). В большинстве случаев криптические виды мохообразных имеют широко перекрывающиеся ареалы, хотя экологически дифференцированы. Например, изучение около 50 образцов произрастающего на камнях космополитного мха Grimmia laevigata (методом AFLP - анализа длин амплифицированных фрагментов) показало существование лишь в одной Калифорнийской Флористической Провинции двух репродуктивно изолированных видов с перекрывающимися ареалами (Fernandez et al., 2006). Тщательное исследование таких групп показало, что выделяемые нередко «морфовиды» представляют собой искусственные группировки, появившиеся в результате конвергентного развития морфологических признаков, например формы листа. В то же время стоит оговорить, что хотя исследование ряда видов мхов с широким ареалом и некоторой морфологической или фитохимической вариабельностью выявило у них генетическую дифференциацию (Hylocomium splendens: Chiang, Schaal, 1999; Plagiochila bifaria: Heinrichs et al., 2004), она была недостаточна для выдвижения гипотезы о видовом статусе дивергентных линий. Кроме того, как было отмечено (Heinrichs et al., 2009), еще не ясно, относится ли выявляемая во многих морфовидах мохообразных генетическая дифференциация к генетически несовместимым единицам. Отсутствие обмена генов может вызываться не генетическими, а географическими причинами - значительной удаленностью, при сохраняющемся потенциале к скрещиванию. Криптические виды были найдены по генетической дифференциации в нескольких видах папоротников - Adiantum pedatum (Paris and Windham 1988), Polypodium vulgare (Haufler and Windham 1991), Gymnocarpium dryopteris (Pryer and Haufler 1993), Athyrium oblitescens (Kurihara et al. 1996), Botrichium lunaria (Hauk and Haufler 1999; Daufin et al., 2014), Asplenium nidus (Yatabe et al., 2001), Metaxya rostrata (Smith et al., 2001), Ceratopteris thalictroides (Masuyama et al. 2002), Microlepia marginata (Inoue et al., 2004), Cheilanthes yavapensis (Grusz et al., 2009). По большей части это полиплоидные комплексы, в которых тетраплоидные виды представляют собой чаще гибриды разных диплоидных видов, чем результат внутривидовых скрещиваний (Hauk, Hoffler, 1999). При этом у папоротников внутривидовые дивергентные линии обнаружены даже по такому консервативному гену как rbcL - (Metaxya lanosa, Ceratopteris thalictroides, Asplenium nidus). У A. nidus уровень его дивергенции (найдено 5 линий) составляет 4-5 % (Murakami et al., 1999), что очень много, и разные rbcL-типы этого папоротника не скрещиваются между собой (Yatabe et al., 2001). C. thalictroides - морфологически полиморфный вид, встречающийся в теплых водах тропических областей. В нем, среди японских образцов, сначала нашли два криптических вида с помощью изозимного анализа (Watano, Masuyama, 1994). Позднее, с помощью анализа последовательностей хлоропластных маркеров - еще один, причем результат был подтвержден экспериментальными скрещиваниями (Masuyama, 2008). У плаунов криптический вид был найден при изучении дивергенции ITS и интрона гена LEAFY в американском видовом комплексе Isöetes melanopoda; он был представлен популяцией из штата Арканзас, отличавшейся от популяций из соседних штатов Миссисипи и Луизиана (Hoot, Taylor, 2001). Высказывались предположения, что у споровых растений, где размножение не требует привлекать опылителей и вырабатывать соответствующие морфологические изменения, может быть больше криптических видов, чем у семенных, однако пока изученность этих групп не достаточна, чтобы оценить, так ли это. КРИПТИЧЕСКИЕ ВИДЫ У СЕМЕННЫХ РАСТЕНИЙ А как же обстоит дело с выявлением молекулярными методами криптических видов в самой большой группе растений, у семенных? Криптические виды были найдены у некоторых голосеменных, в родах Juniperus (Adams et al., 2005) и Taxus (Liu et al., 2011). При этом у вида Taxus wallichiana было найдено, пожалуй, наибольшее из известных на настоящий момент у семенных растений число дивергентных линий - семь. Две из них представляли выделявшиеся ранее некоторыми исследователями подвиды (или даже самостоятельные виды), а четыре соответствовали географическим группам, из которых существование лишь одной было показано ранее на основании морфологического анализа. Но что касается покрытосеменных, действительно, они найдены пока у сравнительно небольшого числа видов относительно их общей численности в этой группе (около 350 000), но постепенно их количество увеличивается (табл. 1), хотя и медленно по сравнению с тем, что мы видим для животных. Как отмечал еще Майр (1963), большинство криптических видов было открыто не в процессе обычного таксономического анализа, а при изучении видов, имеющих особое значение для медицины, сельского хозяйства, генетики и других областей науки и практики, т. е. более скрупулезного, чем обычно, изучения. Некоторые виды действительно вызывают повышенный интерес. Так, Brachypodium distachyon, самоопыляющийся вид с маленьким геномом и коротким жизненным циклом, служит моделью для исследования пищевых, кормовых и биотопливных злаков, поэтому выяснение того, что в его соcтав входят три криптических вида (Catalan et al., 2012) очень важно. Скрупулезному изучению подвергаются некоторые инвазионные виды растений из-за их вредного воздействия на местные виды и сельское хозяйство, и у них тоже обнаружены криптические виды. Предположительно, новые виды найдены в одном из самых злостных сорных видов, занесенных в США - «русском чертополохе» Salsola tragus (Hrusa, Gaskin, 2010), среди австралийских инвазионных видов злаков из рода Cynodon (Jewell et al., 2012). Обнаружение криптических видов во многих случаях стало результатом целенаправленного поиска и проверки видов, у которых ранее была выявлена выраженная внутривидовая вариабельность или даже дивергенция по каким-либо признакам, или существовали гипотезы о наличии криптических видов и/или внутривидовых подразделений (подвидов, разновидностей) в данной группе (Linanthus bicolor: Goodwill, Stiller, 2001; Lasthenia californica: Chan et al., 2002; Brachypodium distachyon: Catalan et al., 2012; Gymnadenia conopsea: Ефимов, 2013). Однако морфологические различия иногда вызываются фенотипической пластичностью, а не генетическими различиями, поэтому так ценен молекулярно-филогенетический анализ. В виде Linanthus bicolor по морфологическим данным выделялось два подвида. Но дифференциация на два ITS-типа, соответствующих этим подвидам, оказалась столь велика (более 50 нуклеотидных замен, дивергенция 8,5 %), что авторы сочли ее соответствующей видовым различиям (Goodwill, Stiller, 2001). Морфологически вариабельная и сложная серия Andinae рода Mimosa включала 4 общепризнанных вида, а также ряд видов и подвидов, выделявшихся отдельными авторами. Исследование плотной выборки образцов этих таксонов по всему ареалу молекулярным и последующим морфологическим анализом подтвердило наличие 6 видов и 3 криптических линий, одна из которых была описана как новый вид M. jaenensis (Särkinen et al., 2011). У вышеупомянутого Brachypodium distachyon имелось до 30 гетеротипных синонимов, хотя в последние годы преобладала широкая концепция вида. Согласно выявленным цитогенетическим, молекулярным (по ядерным и хлоропластным маркерам) и фенотипическим различиям, в нем были выявлены три криптических вида, соответствующих разным циторасам (Catalan et al., 2012). Насекомоядное охраняемое растение Sarracenia alata - вид с разорванным ареалом в юго-восточных штатах США, разрыв проходит по бассейну реки Миссисипи. Такой же разрыв свойствен некоторым другим видам растений и животных, поэтому значительные усилия были предприняты американскими учеными для изучения Sarracenia alata, и в конце концов высокая генетическая дифференциация, соответствующая видовой, была выявлена (Сarstens, Satler, 2013). В некоторых случаях выраженная молекулярная дифференциация выявляется в малоизученных видах, что неудивительно. Род Schoenocaulon включает более 20 эндемичных видов Южной Америки и Мексики, разграничение которых неясно, а сборов немного и их нельзя повторить, так как соответствующие территории застроены. Четыре вида из 24 изученных оказались немонофилетичными, авторы предполагают, что в выборке могут присутствовать криптические виды (Zomlefer et al., 2006). Малоизученными были виды Plantago (подорожника) с Гавайского архипелага, где, при множестве островов и разнообразии экологических условий, активно проходят процессы адаптивной радиации. Оказалось, что образцы Plantago princeps var. princeps образуют не монофилетическую кладу, а граду, причем морфологически неотличимые образцы разделились в соответствии с географической приуроченностью к разным островам архипелага (Dunbar-Co et al., 2008). Авторы считают, что разные группы могут быть криптическими видами. Исследование 10 видов рода Mitella из Японии выявило криптические виды в двух из них, и двух подвидов - в третьем, причем наличие репродуктивной изоляции между криптическими видами было показано проведением экспериментальных скрещиваний (Okuyama, Kato, 2009). Весьма велика вероятность нахождения криптических видов в тех родах, где затруднена видовая идентификация, и они были найдены у Potamogeton (Whittall et al., 2004), Carex (Roalson, Friar, 2004), а также в составе сложных видовых комплексов (Cesalpinia hintonii: Sotuyo et al., 2007; Ancistrocladus tectorius: Meimberg et al., 2010). Разные авторы насчитывали в роде Ancistrocladus в Юго-Восточной Азии от 1 (A. tectorius s. l.) до 12 морфологически мало отличающихся видов. При этом у образцов из данного региона был выявлен значительный полиморфизм по составу нафтилизохинолиновых алкалоидов и наблюдалась некоторая географическая приуроченность отдельных вариантов. Исследование выявило не менее выраженную генетическую дифференциацию среди образцов этого вида, оказавшегося парафилетичным относительно индийских видов, а также внутривидовую вариабельность, превышающую таковую у африканских видов рода, свидетельствующую о возможном присутствии криптических видов (Meimberg et al., 2010). Однако иногда криптические виды выявляются весьма неожиданно. При исследовании рода Allium (лук) оказалось, что образцы вида Allium darwasicum разделились на две ITS-клады, которые не были сестринскими, более того, они располагались на филогенетическом древе довольно далеко друг от друга, хотя все образцы были собраны примерно в одном географическом районе (Gurushidze, 2008). Их генетическая дифференциация свидетельствует, что это могут быть криптические виды. Совершенно неожиданно две несестринские группы были выявлены в виде злаков с широким ареалом - Milium effusum (бор развесистый). Этот вид широко распространен в бореальной зоне в Евразии и на северо-востоке Северной Америки. Молекулярный анализ (ITS) десятков образцов из разных точек ареала показал наличие двух клад - одной, включающей образцы из Европы, Азии вплоть до Забайкалья, Джунгарии и Гималаев, и Северной Америки, и другой, восточноазиатской (Дальний Восток России, включая Камчатку, Курилы, о-ва Японского моря, некоторые провинции Китая, Корея, Япония). Генетическая дивергенция между кладами составляет более 5 %, при этом вторая клада является сестринской кладе секции Milium, включающей первую кладу, и 2 других вида секции (Коцеруба и др., 2008). По-видимому, восточноазиатская клада является криптическим видом. Морфологических или цитогенетических различий пока найти не удалось. Характерно, что некоторые из выявленных сильно дивергировавших линий и внутренне негомогенны (Lasthenia californica - White: Chan et al., 2002; Milium effusum восточноазиатская клада: Коцеруба и др., 2008; Ancistrocladus tectorium: Meimberg et al., 2010; Gymnadenia conopsea азиатская клада: Ефимов, 2013), что дало основания авторам в ряде случаев предполагать присутствие нескольких криптических видов в одном. Возможно, применение дополнительных маркеров и увеличение выборки может внести бóльшую ясность относительно генетической и таксономической структуры этих групп. Иногда не все использованные в конкретной работе маркеры выявляют дифференциацию. Так, в таксономически сложной серии Trichophyllae рода Gaulteria дифференциацию, свидетельствующую о наличии криптических видов, показали участки хлоропластной ДНК, а по ITS полиморфизм практически отсутствовал (Lu et al., 2010), сходная картина получена при изучении Plantago princeps (Dunbar-Co et al., 2008). А вот при изучении видов Mitella (Okuyama, Kato, 2009) была обратная картина - хлоропластный участок psbA-trnH дифференцировал виды рода хуже, чем ядерные ITS + ETS. При этом степень репродуктивной изоляции у них больше соответствовала генетическим расстояниям, выявляемым ядерными маркерами, чем хлоропластными. У Cedrella odorata участки ITS показывали три отдельных линии, а 4 хлоропластных участка - лишь две (Muellner et al., 2009). По-видимому, для надежного выявления криптических видов растений желательно исследование и ядерных и хлоропластных участков. Иногда криптические виды удавалось обнаружить только после приложения немалых усилий. Так, у уже упоминавшегося вида Sarracenia alata исследование участка ITS2 не показало разницы между восточными и западными популяциями (Neuland, 2008). Однако анализ микросателлитной ДНК, а также участка trnK-rps16 (он один из 6 изученных хлоропластных участков оказался более или менее вариабельным) указывали на существование некоторой структуры популяций (Koopman, Karstens, 2010). Анализ последовательностей 21 локуса методами секвенирования следующего поколения (NGS) все же убедительно показал, что в виде существуют две дивергентные линии, по-видимому, представляющие собой криптические виды (Сarstens, Satler, 2013). Пока метод NGS широко не вошел в практику подобных исследований, и используются методы множественных локусов (RAPD, ALFP, микросателлиты, ISSR), также иногда дающие хорошие результаты. Выявляемое наличие криптических видов заставляет вспомнить о дуализме биологических и таксономических видов, о котором писал еще Грант (1971). В качестве яркого примера криптических видов он приводил комплекс Gilia transmontana (Polemoniaceae), содержащий 5 видов, столь сходных по фенотипу, что их идентификация затруднена, но при этом полностью взаимостерильных (к сожалению, этот комплекс, произрастающий в пустыне Мохаве, до сих пор не проанализирован с помощью молекулярных методов). Все же Грант указывал, что такие виды нельзя считать таксономическими видами в силу трудностей с их определением, поэтому за единицу классификации приходится принимать весь комплекс видов-двойников. То, что криптические виды, найденные по генетической дифференциации, являются и репродуктивно изолированными биологическими видами, было продемонстрировано для некоторых растений экспериментальными скрещиваниями (Masuyama, 2008; Okuyama, Kato, 2009; Yatabe et al., 2001). Но такая корреляция не всегда наблюдается, что показало изучение трех арктических видов рода Draba (D. fladnizensis, D. subcapitata, D. nivalis). Экспериментальные скрещивания были проведены внутри разных географических популяций и между ними. Они выявили в каждом из видов множество репродуктивно изолированных популяций - возможных криптических видов (Grundt et al., 2006). Но последующее исследование молекулярной дифференциации или совсем не выявило ее (по ITS и хлоропластным маркерам), или выявило в гораздо меньшей степени (по микросателлитной ДНК) - когда в одном виде найдено три дивергентных линии, в другом - две, в третьем их не было (Skrede et al., 2009). Тот факт, что молекулярная дифференциация в видах Draba выявила гораздо меньшее количество генетически обособленных групп, чем экспериментальные скрещивания, авторы (Skrede et al., 2009) объясняют тем, что развитие барьеров стерильности в этой группе происходит очень быстро и затрагивает лишь маленькую часть генома. Если раньше допускали, что при возникновении репродуктивной изоляции изменениям подвергается весь геном или большая его часть, теперь показано, что на первых порах она может быть вызвана действием отдельных генов, называемых генами видообразования. У растений уже известно более 40 таких генов, действующих на разных этапах изоляции - презиготическом, постзиготическом, нежизнеспособности гибридов или их стерильности (Rieseberg, Blackman, 2010). В таких случаях исследование отдельных участков генома обеспечивает меньшую вероятность уловить начинающуюся дивергенцию, чем методы множественных локусов, даже если изоляция уже произошла некоторое время назад. Обычно считается, что криптические виды - молодые, представляющие собой начальные этапы видообразования. По-видимому, это справедливо для большинства случаев. Однако показано, что возраст некоторых может быть солидным. Время дивергенции двух видов, обнаруженных у мха Pyrrhobryum mnioides, оценивается в 80 млн лет (McDaniel, Shaw, 2003). Отметим, что эта цифра превышает таковые, найденные пока для криптических видов в других группах организмов. ВОЗМОЖНЫЕ РАЗЛИЧИЯ КРИПТИЧЕСКИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ Известно, что у животных морфологически неразличимые криптические виды могут различаться по характеру издаваемых звуков, демонстрационному и миграционному поведению, феромонам, специфичности по «хозяину», пищевым предпочтениям и т. п. По каким же признакам различаются криптические виды растений? Существование криптических видов у растений связывали в первую очередь с полиплоидией. У многих видов покрытосеменных (до 13 % по разным оценкам), еще чаще - у папоротников, существуют хромосомные расы (циторасы или цитотипы) с разным уровнем плоидности. Иногда при тщательном изучении между ними выявлялись географические, морфологические, экологические и другие различия, хотя вопрос о том, в какой степени эти различия присущи расам, и как часто они репродуктивно изолированы друг от друга, - остается открытым. Высказывалось предложение о выделении циторас как таковых в самостоятельные виды (Löve, 1964), делались предложения, касающиеся отдельных таксонов (например, Ball, Heywood, 1962; Vaghan et al., 1997), хотя по большей части их рассматривали в рамках внутривидовой изменчивости. Также следует отметить, что морфологические различия между диплоидами и полиплоидами (и циторасами вообще) чаще всего носят скорее количественный, чем качественный характер (это касается и генеративных и вегетативных органов), то есть их сложно выявить и зафиксировать так, как требуется для таксономических признаков. Тем не менее, не так давно группа авторитетных авторов выступила с предложением описывать автополиплоидные цитотипы как отдельные виды (Soltis et al., 2007), если получены дополнительные доказательства их видового статуса (например, экологические различия, отсутствие потока генов). В статье приводились примеры наиболее подходящих, по мнению авторов, кандидатов в новые виды - это цитотипы видов Tolmiea menziesii и Heuchera grossulariifolia (Saxifragaceae), Galax urceolata (Diapensiaceae), Chamerion angustifolium (Onagraceae), Vaccinium corymbosum (Ericaceae). Чтобы избежать путаницы в названиях, было предложено в названиях новых видов добавлять к видовому эпитету существовавшего вида указание на уровень плоидности, как было с видами рода Zea - был известен тетраплоидный Zea perennis, а найденный позже похожий диплоидный вид был назван - Zea diploperennis (Iltis et al., 1979). Надо сказать, что В. Грант, Д. Л. Стеббинс и ряд других видных исследователей не считали автополиплоидию значимым механизмом видообразования (считали строго доказанными менее десятка примеров) и не допускали, что цитотипы могут представлять собой разные виды. Грант полагал, что автополиплоидия - явление, необычное у растений, а цитогенетические критерии, по которым оно обычно распознается - в первую очередь спаривание бивалентов в мейозе - нельзя считать диагностическими (как и морфологическое сходство полиплоидов с близкими диплоидными видами). Позже было установлено, что наиболее надежным доказательством автополиплоидной природы является полисомное наследование. В последнее десятилетие использование генетических и в особенности молекулярных маркеров позволило получать во многих случаях убедительные свидетельства автополиплоидии и показало, что она распространена гораздо более, чем предполагалось раньше (Soltis et al., 1999), особенно в некоторых семействах, например, Saxifragaceae и Cactaceae. В то же время установить, являются ли расы автополиплоидными или аллополиплоидными бывает очень сложно. Даже анализ четырех ядерных низко-копийных генов видов Zea perennis и Z. diploperennis не позволил полностью исключить гипотезу о происхождении Z. perennis путем межвидовой гибридизации с участием предка вида Z. diploperennis и какого-то ныне вымершего вида рода (Tiffin, Gaut, 2001). Три циторасы вида Brachypodium distachyon s. l. долго считались автополиплоидной серией, пока GISH и FISH гибридизация не показали, что расы с 2n = 10 и 2n = 20 являются диплоидами с х = 5 и х = 10, а раса с 2n = 30 - производным от них аллотетраплоидом (Hasterok et al., 2004). Детальные морфометрический, цитогенетический и молекулярный анализы показали, что все три расы - самостоятельные криптические виды (Catalan, 2012). Стоит отметить, что и в случае исследования циторас (в том числе по молекулярной дивергенции) заключения авторов о том, что данный вид может содержать несколько самостоятельных видов часто выражены в неявной форме, не содержат таксономических рекомендаций (напр., Glycine tomentella: Doyle et al., 2004; Solidago simplex: Peirson et al., 2012, Aster amellus: Münzbergová et al., 2013 и др.). и остаются мало замеченными, особенно при поиске по названиям или ключевым словам. Тем не менее комплексы циторас представляют собой потенциальный резерв криптических видов и ожидают своего исследования современными методами, включая молекулярные. Известно, что у покрытосеменных в большинстве случаев дифференцирующими видовыми признаками являются признаки генеративной сферы, а различия в вегетативных признаках часто относят за счет внутривидовой вариабельности. Но оказалось, что, например, два криптических вида у орхидей Gymnadenia conopsea и G. densiflira, выявленных по молекулярной дифференциации, весьма устойчиво различаются по вегетативным признакам (Ефимов, 2013). В случае криптических видов хорошие результаты иногда дает морфометрический анализ (Catalan et al., 2012; Ефимов, 2013), Что касается признаков генеративных, показано, что они могут носить более сложный характер, чем простое описание отдельных элементов. В виде Caesalpinia hintonii различали три морфы, отличавшиеся некоторыми морфологическими особенностями соцветий и цветков, обеспечивавших три разных синдрома опыления. Оказалось, что одна из этих морф образует отдельную кладу на дереве, построенном по последовательностям 4 участков хлоропластной ДНК, она аллопатрична относительно других морф и была выделена в самостоятельный вид (Sotuyo et al., 2007). Некоторые с трудом уловимые морфологические различия еще необходимо отличать от возможной фенотипической пластичности, изучение которой очень важно, так как наличие её может затуманивать картину соответствия морфологической и генетической дифференциации, их корреляции. Криптич

About the authors

Viktoriya Semenovna Shneyer

Komarov Botanical Institute of RAS

Email: shneyer@rambler.ru
Department of Biosystematics and Cytology

Violetta Vladimirovna Kotseruba

Komarov Botanical Institute of RAS

Email: viola.kotseruba@gmail.com
Department of Biosystematics and Cytology

References

Supplementary files