Genetic diversity comparative evaluation of Pinus Sylvestris L. and Picea x Fennica (regel) kom. native populations and clonal seed orchards in russian Karelia

Full Text

Введение Лесосеменные плантации (ЛСП) - это ключевая категория объектов в структуре постоянной лесосеменной базы лесообразующих хвойных видов. Главная задача ЛСП - обеспечение лесного хозяйства улучшенными семенами лесных пород, обладающими ценными наследственными свойствами и высокими посевными качествами. Важным аспектом в этом вопросе является сохранение и поддержание на лесосеменных плантациях I порядка уровня генетического разнообразия, свойственного природным популяциям основных лесообразующих пород того или иного региона. В публикациях приводятся противоречивые результаты оценки уровня генетической изменчивости в природных популяциях лесных древесных видов и на лесосеменных плантациях. В некоторых исследованиях было отмечено снижение генетического разнообразия в культурных насаждениях по сравнению с нативными популяциями (Adams, Joly, 1980; Moran et al., 1980; Conkle, 1981; Guries, Ledig, 1981; Knowles, 1985; Moran, Bell, 1987; Rajora, 1999; Williams, Hamrick, 1995). Основной причиной снижения уровня генетического разнообразия при создании культур является сокращение эффективного размера популяции, приводящее к утере редких аллелей (Godt et al., 2001). Существуют, однако, примеры, когда на лесосеменных плантациях уровень генетического разнообразия может быть выше, чем в местных родительских популяциях (Гончаренко и др., 1989; Eckert et al., 1981; Ryu, Eckert, 1983; Lefevre, 2004). В популяционных исследованиях в последние десятилетия особую популярность приобрели молекулярно-генетические маркеры - микросателлиты - варьирующие участки (локусы) в ядерной ДНК и ДНК органелл (митохондрий и пластид), состоящие из тандемно повторяющихся коротких нуклеотидных последовательностей. Микросателлиты характеризуются высоким уровнем полиморфизма и часто встречаются в геноме. Благодаря этим свойствам они могут использоваться в качестве тонкого и точного инструмента при определении филогенетических связей, изучении особенностей генетической структуры конкретных популяций, для исследования гибридизации и т. п. Микросателлитные праймеры были разработаны для большого числа видов древесных растений (Hodgetts et al., 2001; Rajora et al., 2001). В Карелии, в последней четверти ХХ века, при реализации системы плюсовой селекции основных лесообразующих видов (сосны обыкновенной и ели финской) были созданы 6 прививочных ЛСП I порядка общей площадью около 454 га, в том числе сосны - 365 га. На этих объектах произрастают сотни вегетативных потомств плюсовых деревьев. Однако до настоящего времени работ по изучению состояния генофондов клоновых плантаций и уровня их генетического разнообразия не проводилось. В свете вышесказанного целью исследования явилось изучение на основе использования микросателлитных локусов генетического разнообразия естественных популяций и лесосеменных плантаций хвойных Карелии (на примере ели финской Picea x fennica (Regel) Kom. и сосны обыкновенной Pinus sylvestris L.). Объекты и методы исследований Объектами исследования явились естественные популяции ели финской (Водлозеро_Е1, Водлозеро_Е2, Хелюля_Е1, Сортавала_Е1) и сосны обыкновенной (Заонежье_С1, Кивач_С1, Водлозеро_С1, Сортавала_С1), а также 2 поля Петрозаводской прививочной клоновой лесосеменной плантации (рис. 1). В естественных сосняках и ельниках средней подзоны тайги Карелии в Южнокарельском лесосеменном районе (Лесосеменное районирование … , 1982) были заложены постоянные пробные площади (ППП), главным образом в пределах существующих либо планируемых особо охраняемых природных территорий (ООПТ). Характеристика популяций приведена в таблице 1. Клоновые плантации представлены двумя участками Петрозаводской ЛСП I порядка, расположенной в пределах Южнокарельского лесосеменного района. Участок сосны обыкновенной закладывался в 1982-1984 гг. по рендомизированной схеме с расстоянием между деревьями 5 × 8 м, число клонов - вегетативных потомств плюсовых деревьев, отобранных в популяциях сосны обыкновенной в пределах Южнокарельского лесосеменного района - более 70 штук. Участок ели финской был создан в 1994 г. по рендомизированной схеме с расстоянием между деревьями 5 × 8 м, число клонов - 40 штук. Для анализа генетической структуры популяций отбирали образцы хвои с 30 модельных деревьев на каждой ППП. На ЛСП для генетического анализа были собраны образцы хвои с 40 клонов ели и 30 клонов сосны. Выделение образцов геномной ДНК ели и сосны осуществлялось с помощью набора Axyprep Multisource Genomic DNA (Axygen). Микросателлитный анализ ели финской проводили по 5 локусам ядерной ДНК: UAPgTG25, UAPgAG105, UAPgAG150 (Hodgetts et al., 2001), EATC2C06, EATC2C10 (Scotti et al., 2002). Для анализа популяций сосны обыкновенной было отобрано четыре ядерных микросателлитных локуса: PtTX2123, PtTX2146 (Elsik et al., 2000), SPAC11,8, SPAC12,5 (Soranzo et al., 1998). Характеристика микросателлитных праймеров («Синтол», Россия), использованных для амплификации ДНК, дана в таблице 2. Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали 26 мкл реакционной смеси следующего состава: 50 нг ДНК исследуемых образцов, 100 пМ праймера, 5 мкл набора с Taq ДНК-полимеразой (Москва, «Сибэнзим»). Для проведения амплификации применяли прибор iCycler iQ5 (Bio-Rad). Условия амплификации: денатурация - 30 с при 94 °C, отжиг - 30 с при 53-62 °C (в зависимости от используемого праймера), полимеризация - 40 с при 72 °C; количество циклов - 35; достраивание фрагментов - 6 мин при 72 °C. Разделение и определение микросателлитных фрагментов осуществляли с помощью капиллярного электрофореза на приборе CEQ 8000 Genetic analysis System (Beckman Coulter) с помощью набора GenomeLab Fragment analysis (Beckman Coulter). Основные показатели генетической изменчивости (среднее число аллелей на локус А99 %, среднее число аллелей с частотой >5 %, А95 %, среднее эффективное число аллелей ne, наблюдаемая Но и ожидаемая Не гетерозиготность, полиморфность Р99 %), показатели F-статистик Райта (Guries, Ledig, 1982), генетические дистанции (Nei, 1978) определяли с помощью программы GenAlEx 6.5 (Peakall, Smouse, 2006). Построение дендрограмм на основе матриц генетических расстояний проводилось с помощью метода невзвешенного попарного арифметического среднего UPGMA (Sneath, Sokal, 1973). Результаты и обсуждение Ель финская. Анализ генетической структуры карельских среднетаежных популяций ели финской показал, что все пять использованных ядерных микросателлитных локусов полиморфны (табл. 2, 3). Наибольшее аллельное разнообразие обнаружено в локусе UAPgAG150A. Всего при изучении четырех естественных популяций и ЛСП ели финской выявлено 42 аллеля, из их уникальных - 31 %. Для естественных популяций ели обнаружен высокий уровень аллельного разнообразия. В то же время популяция Водлозеро_E2 по локусу UAPgAG105 оказалась мономорфной. Результаты исследования генетического разнообразия популяций ели финской (табл. 4) обнаружили для ЛСП_Е1 минимальные значения по всем основным параметрам генетического разнообразия (А99 % = 3,60; А95 % = 2,20; ne = 1,80; Но = 0,08; Не = 0,39), за исключением полиморфности (Р99 % = 100 %). Популяции из Северного Приладожья Хелюля_Е1 и Сортавала_Е1, напротив, характеризовались максимальными значениями большинства параметров генетической изменчивости: А99 % = 5,40 и 5,80; А95 % = 3,40 и 3,80; Не = 0,57 и 0,54 соответственно. Различия оказались статистически значимы в аллельном разнообразии А99 % и А95 % - между ЛСП_Е1 и Хелюля_Е1, в уровне наблюдаемой гетерозиготности Но - между ЛСП и приладожскими популяциями Сортавала_Е1 и Хелюля_Е1 (табл. 4). Также статистически значимыми оказались различия в уровне наблюдаемой гетерозиготности Но между Хелюля_Е1 и Водлозеро_Е2, с одной стороны, и Сортавала_Е1 - с другой. Минимальный уровень генетического разнообразия для ЛСП_Е1 свидетельствует о недостаточной представленности генетического пула вида на лесосеменной плантации. Факт более высокого уровня генетического разнообразия приладожских популяций может быть объяснен тем, что по сравнению с остальной территорией Карелии данный агроклиматический район имеет наиболее благоприятные природно-климатические условия. Естественные популяции и ЛСП_Е1 характеризовались более низким уровнем наблюдаемой гетерозиготности Ho по сравнению с ожидаемой He, однако разница была статистически достоверной только в случае ЛСП_ Е1 и Хелюля_Е1. Тем не менее данный результат свидетельствует о дефиците гетерозигот по микросателлитным локусам в исследованной части ареала ели финской. В целом исследованные популяции ели финской характеризуются довольно высоким уровнем генетического разнообразия по микросателлитным локусам, особенно по сравнению с данными, полученными (Потенко и др., 1993) с помощью анализа изоферментов. Уровень внутривидового генетического разнообразия исследованных популяций ели финской оказался сравнимым с таковым у популяций ели сибирской из Сибири и Монголии (Экарт и др., 2014; Кравченко и др., 2015). Положительные значения F-статистик Райта (табл. 5) подтверждают наличие дефицита гетерозигот у ели финской как на популяционном уровне, так и для вида в целом в данной части ареала. Значения показателя Fst варьировали от 0,12 для локуса UAPgTG25 до 0,32 для EATC1C10, составляя в среднем 0,19, что указывает на достаточно высокий уровень межпопуляционной дифференциации ели. Анализ попарных значений этого показателя для отдельных популяций (табл. 6) выявил, что наибольший вклад в высокий уровень межпопуляционной дифференциации вносят различия между естественными популяциями и ЛСП_Е1. Это подтверждает и кластерный анализ (рис. 2) на основе матрицы генетических дистанций по Неи (Nei, 1978). Необходимо отметить несоответствие генетических дистанций и географических расстояний: расположенные рядом Сортавала_Е1 и Хелюля_Е1 попали в разные кластеры. Наиболее генетически близкими оказались популяции Хелюля_Е1 и Водлозеро_Е2 (DN = 0,04), затем обособились Водлозеро_Е1 и Сортавала_Е1 (DN = 0,07). Расстояние между двумя кластерами составило 0,14, что указывает на высокий уровень дифференциации карельских популяций. Лесосеменная плантация, как и в случае с анализом подразделенности, показала самый высокий уровень генетической обособленности (DN = 0,78) от остальных популяций. Таким образом, анализ особенностей генетического разнообразия на лесосеменной плантации ели показал снижение уровня изменчивости по сравнению с естественными древостоями. Это привело к значительной генетической обособленности ЛСП от естественных популяций ели финской. Сосна обыкновенная. В процессе исследования сосны обыкновенной из семи пар микросателлитных праймеров было отобрано четыре, характеризующиеся полиморфизмом амплифицированных фрагментов (табл. 2). Амплификация четырех микросателлитных локусов сосны из четырех естественных популяций и ЛСП позволила выявить 62 аллеля, 29 % из которых оказались уникальными (табл. 7). Наибольшее количество аллелей (31) найдено для локуса Spac12,5. Наименьшим уровнем аллельного разнообразия характеризовался локус PtTX2123. Исследованные популяции сосны обыкновенной отличались как по аллельному составу, так и по их соотношению. Сортавала_С1 и ЛСП_С1 обнаружили максимальный уровень аллельного разнообразия (42 и 41 аллель соответственно). Анализ основных параметров генетической изменчивости (табл. 8) показал, что все популяции сосны обыкновенной отличаются высокими значениями: среднее число аллелей на локус A99 % варьировало от 10,25 для Сортавала_С1 до 7,50 для Кивач_С1; среднее эффективное число аллелей на локус ne - от 5,83 для Сортавала_С1 до 3,23 для Заонежье_С1; наблюдаемая гетерозиготность Ho - от 0,50 для Сортавала_С1 до 0,28 для Кивач_С1; ожидаемая гетерозиготность He - от 0,68 для Сортавала_С1 до 0,51 для Заонежье_С1. Полиморфность P99 % оказалась максимальной для всех популяций сосны обыкновенной и ЛСП (100 %). Необходимо отметить, что, несмотря на различия в уровне генетического разнообразия между популяциями, выявленная разница оказалась статистически незначимой. Тем не менее наблюдается явная тенденция к снижению генетического разнообразия, выявленного с помощью микросателлитного анализа, в популяциях Кивач_С1 и Заонежье_С1. Одной из причин этого явления может быть история расселения сосны обыкновенной в регионе в послеледниковый период, однако для более обоснованных выводов необходимы дополнительные исследования. Высокий уровень генетической изменчивости, выявленный для ЛСП_С1 (по большинству характеристик она уступает лишь Сортавала_С1), свидетельствует о достаточной представленности генофонда сосны обыкновенной на лесосеменной плантации. Как и в случае с елью финской, для популяций сосны обыкновенной выявлен более высокий уровень ожидаемой гетерозиготности He по сравнению с наблюдаемой Ho, что указывает на дефицит гетерозигот относительно ожидаемого по Харди-Вайнбергу. В целом исследованные популяции Pinus sylvestris характеризуются достаточно высоким уровнем генетического разнообразия, выявленного с помощью микросателлитного анализа, по сравнению с данными, полученными с помощью анализа изоферментов для карельских популяций сосны (Янбаев и др., 1998). Анализ подразделенности карельских популяций сосны обыкновенной на основе F-статистик Райта (табл. 9) выявил для локусов Spac11,8 и Spac12,5 дефицит гетерозигот как на популяционном уровне (Fis = 0,63 и 0,38), так и у вида в целом (Fit = 0,70 и 0,40). В то же время локус PtTX2123 характеризовался отсутствием дефицита на обоих уровнях, а локус PtTX2146 обнаружил наличие дефицита гетерозигот только на видовом уровне. Значения Fst варьировали от 0,03 для PtTX2123 до 0,20 для Spac11,8, составляя в среднем 0,10, что подтверждает относительно высокий уровень межпопуляционной дифференциации популяций сосны обыкновенной в регионе. Наибольший вклад в межпопуляционную дифференциацию обнаружила популяция Заонежье_С1. Это подтверждается кластерным анализом на основе генетических расстояний по Неи (рис. 3): Заонежье_С1 оказалась наиболее генетически обособленной от остальных популяций сосны (DN = 0,28). Остальные популяции вошли в два кластера: в первом объединились Сортавала_С1 и Водлозеро_С1, значительно удаленные друг от друга географически; во второй кластер вошли ЛСП_ С1 и Кивач_С1. Расстояние между двумя кластерами составило 0,24, что также указывает на высокий уровень дифференциации между карельскими популяциями сосны обыкновенной. Сравнительная оценка карельских среднетаежных ельников выявила снижение уровня генетического разнообразия, в том числе аллельного, на лесосеменной плантации по сравнению с нативными популяциями. Сходное явление было обнаружено при сравнительном исследовании малонарушенных популяций и культурных насаждений у Picea glauca, Pinus banksiana (Godt et al., 2001) и Pseudotsuga menziessii (El Kassaby, Ritland, 1996), ели обыкновенной (Gömöry, 1992), Picea glauca × engelmanni (Stoehr, ElKassaby, 1997) и Pinus contorta (Thomas et al., 1999). Основной причиной снижения уровня генетического разнообразия при создании культурных насаждений может быть сокращение эффективного размера популяции, приводящее к утере редких аллелей (Godt et al., 2001). Согласно современным представлениям для начала селекционных работ в составе отдельной селекционной популяции (в пределах селекционной зоны или лесосеменного района) необходимо иметь не менее 500-600 плюсовых деревьев (Danel, 1990; Eriksson, Ekberg, 2001). В настоящее время в Карелии в государственном реестре числится 385 плюсовых деревьев ели. Все они отобраны в Южнокарельском лесосеменном районе, причем в пределах его небольшой части, главным образом в Северном Приладожье. Очевидно, что этого недостаточно. Результаты исследований показывают, что в таком случае прививочная ЛСП ели, имеющая в своем составе 40 клоновых потомств, не обеспечивает необходимого уровня генетического разнообразия. В то же время на лесосеменной плантации сосны обыкновенной уровень генетического разнообразия оказался не ниже, чем в малонарушенных популяциях. Исследования некоторых авторов указывают на сходные или даже более высокие уровни генетического разнообразия на семенных или промышленных плантациях по сравнению с природными популяциями (Bergmann, Ruetz, 1991; Chaisurisri, El-Kassaby, 1994; El-Kassaby, Ritland, 1996; İçgen et al., 2006; Wellman et al., 2003; Stefenon et al., 2008). Одной из причин более высокого уровня разнообразия на ЛСП может быть более высокий уровень гетерозиготности генетического материала (плюсовые деревья), используемого при создании плантаций (Jones et al., 2006). В Карелии в настоящее время в пределах Южнокарельского семенного района произрастает 766 плюсовых деревьев сосны, отобранных по всей территории. Данный показатель соответствует и даже превосходит упомянутую выше норму по объему исходного материала. Как показывают наши исследования в этом случае, при наличии 70 клонов в пределах поля плантации обеспечивается высокий уровень генетического разнообразия, который, безусловно, следует считать благоприятным фактором при начале реализации системы селекционных мероприятий. В результате изучения с помощью микросателлитного анализа особенностей генетического разнообразия во всех популяциях ели финской и сосны обыкновенной обнаружен более высокий уровень ожидаемой гетерозиготности по сравнению с наблюдаемой. В исследовании Е. А. Мудрик (Мудрик и др., 2008), посвященном геногеографическим исследованиям ели европейской, сибирской и гибридной с помощью микросателлитных локусов, были получены сходные результаты. Авторы высказывают предположение о том, что, возможно, это связано с присутствием «нуль»-аллелей, а также может отражать наличие самоопыления и других форм инбридинга в популяциях ели. По мнению Е. К. Потокиной и др., вероятной причиной недостатка гетерозигот в больших популяциях может быть эффект Валунда (Потокина и др., 2012). В целом, несмотря на то, что уровень генетического разнообразия у исследованных популяций, в том числе и на ЛСП, был высоким, выявлена генетическая обособленность лесосеменных плантаций. Этот факт диктует необходимость совершенствования системы селекционно-семеноводческих мероприятий. Следует признать обоснованными требования нормативных документов (Указания по лесному семеноводству … , 2000), устанавливающих нижний порог по числу прививочных потомств для ЛСП I порядка на уровне 50 клонов. Увеличение этого числа, например до 70 потомств, может только приветствоваться. Работа выполнена в рамках Государственного задания ИЛ КарНЦ РАН. Работа получила финансовую поддержку президиума РАН (программа фундаментальных исследований «Живая природа: современное состояние и проблемы развития», подпрограмма «Динамика и сохранение генофондов»).

About the authors

Aleksey Alekseevich Ilinov

Institute of Forestry of the Karelian Research Centre of the Russian Academy

Email: ialexa33@yandex.ru
Research Associate (Cand. (PhD) of Agricultural Sciences), Laboratory of dynamics and productivity of boreal forests

Boris Vladimirovich Raevsky

Institute of Forestry of the Karelian Research Centre of the Russian Academy

Email: borisraevsky@gmail.com
Research Associate (Cand. (PhD) of Agricultural Sciences), Laboratory of dynamics and productivity of boreal forests

References

Supplementary files