Research of genetic markers in susceptibility to arterial hypertension in Russian Northwest region children

Full Text

Введение Эссенциальная артериальная гипертензия (АГ) — заболевание, основным клиническим признаком которого является длительное и стойкое повышение артериального давления от 140/90 мм рт. ст. и выше при отсутствии изменений в каких-либо других системах органов, которые могли бы спровоцировать повышение артериального давления. АГ является мультифакторным полиэтиологическим заболеванием, в основе патогенеза которого лежит как генетическая компонента, так и неблагоприятные факторы внешней среды. К экзогенным факторам риска можно отнести курение, злоупотребление алкоголем, ожирение, диабет, гиподинамию, стрессовые ситуации и др. Если рассматривать генетическую компоненту, то на данный момент времени известно более 150 генов, варианты которых связывают с предрасположенностью к сердечно-сосудистым заболеваниям (Нефедова, 1998). К ним относят, например, отдельные варианты генов ангиотензиногена, рецептора ангиотензина II, ангиотензинпревращающего фермента, ренина, альдостеронсинтетазы, β-субъединицы амилоридчувствительных натриевых каналов почечного эпителия и др. (Глотов, 2007; Баранов, 2009). Как было отмечено в докладе экспертов ВОЗ № 792 в 1992, значительная часть взрослого контингента больных АГ формируется из детей и подростков с повышенным артериальным давлением. Поэтому ранняя диагностика АГ в подростковом периоде весьма актуальна с целью проведения эффективной и своевременной профилактики и лечения, что позволит предотвратить неблагоприятный прогноз в зрелом возрасте. Адекватные профилактические мероприятия, направленные на коррекцию и превентивную терапию АГ в юном возрасте, дадут значительно более высокий медицинский, социальный и экономический эффект, чем лечение АГ у взрослых. В настоящее время существует несколько стратегий выявления генов, которые могут быть вовлечены в развитие того или иного мультифакториального заболевания (МФЗ). В первую очередь, это поиск генов-кандидатов или генов предрасположенности. Подбор ведется на основании уже имеющихся данных по этиологии и патогенезу конкретного заболевания, основным метаболическим, биохимическим и функциональным нарушениям, вызванным патологическим процессом. Одним из метаболических путей, вовлеченных в регуляцию тонуса сосудов и, как следствие, в формирование патологии сердечно-сосудистой системы, является каскад арахидоновой кислоты (АК). В ряду жирных кислот АК является уникальным соединением. Она служит предшественником большого ряда физиологически активных веществ — эйкозанойдов. Эйкозанойды, включающие в себя простагландины, тромбоксаны, лейкотриены и ряд других веществ, относятся к классу регуляторов клеточных функций (Сергеева, 2009). В регуляции тонуса сосудов наибольшее участие принимают такие соединения как простациклин, эпоксиэйкозатриеновые кислоты и гидроксиэйкозатетраеновые кислоты. Они образуются из АК под действием ферментов простациклинсинтазы, цитохрома 2J2 и цитохрома 4А11, соответственно. В таблице 1 представлены гены, кодирующие эти три фермента, и их полиморфные сайты. Значительно более обширные данные о генах, ассоциированных с МФЗ, могут быть получены с помощью нового метода — метода полногеномного анализа ассоциаций (Genome Wide Association Studies — GWAS). Успех данного метода предопределяется, как обширными выборками тестируемых индивидов в опытной и контрольной группах (от нескольких сотен до десятков тысяч), так и огромным набором (сотни тысяч) молекулярных маркеров (однонуклеотидных замен). К настоящему времени имеются результаты GWAS-исследований по идентификации генов предрасположенности для повышенного систолического и диастолического давления, ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда, ишемического инсульта и еще более, чем 200 МФЗ (Speicher, 2010). В таблице 2 представлены сведения о некоторых полиморфных сайтах, выявленных методом GWAS в качестве значимых для риска развития повышенного артериального давления. Патогенез АГ обусловлен изменениями во многих генах. Несмотря на множество исследований, изучение генетической компоненты этого заболевания не теряет своей актуальности. Для проведения исследования нами были отобраны и проанализированы полиморфные сайты в 3 генах, участвующих в метаболизме АК и регулирующих активность и количество её метаболитов — CYP2J2 –50G/T, CYP4A11 8590T/C и PTGIS rs6090996. Во время исследования также были изучены результаты полногеномных ассоциативных исследований, проведенных в Европе и США в 2009 году. На их основе были отобраны 3 полиморфных локуса в генах CDH13, MTHFR и CDKN2BAS, а также один внегенный локус rs11191548. По всем 7 изученным молекулярным маркерам были получены распределения частот генотипов в группе детей с АГ и в контрольной группе здоровых детей Северо-Западного региона России. Материалы и методы В работе были использованы образцы ДНК, выделенные из лейкоцитов периферической крови двух групп детей. Опытная группа была сформирована из 115 детей в возрасте от 9 до 17 лет с АГ, контрольная группа из 100 школьников из Санкт-Петербурга в возрасте от 7 до 17 лет без АГ. АГ, как диагноз ставился в тех случаях, когда при измерениях артериального давления (АД) у ребенка неоднократно (не менее 3 раз при отдельных визитах к врачу) отмечался его повышенный уровень. Всем детям было проведено суточное мониторирование артериального давления с целью подтверждения наличия АГ и уточнения ее выраженности. В среднем у каждого обследованного ребенка АД измеряли 55 раз в течение суток. Опекунами всех обследованных несовершенных лиц было подписано информированное согласие на проведение исследования. Выделение ДНК: ДНК выделяли в соответствии с описанной в литературе методикой Миллера с некоторыми модификациями (Miller et al., 1988). Анализ образцов ДНК: Для оценки частот аллелей и генотипов по генам PTGIS (rs6090996 G/A), CYP2J2 (–50 G/T), CYP4A11 (8590 T/C), CDH13 (rs11646213 A/T), MTHFR (rs17367504 A/G), CDKN2BAS (rs4977574 A/G) и rs11191548 T/C было проведено генотипирование изученных групп детей с помощью метода ПЦР-ПДРФ. Метод ПЦР-ПДРФ включает в себя три последовательных этапа: проведение ПЦР со специфичными праймерами для амплификации требуемого участка генома, гидролиз ПЦР-продуктов с помощью эндонуклеаз рестрикции и последующую визуализацию результатов гидролиза путем электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). 1. Проведение ПЦР Нуклеотидные последовательности искомых фрагментов генов получали из интернет-базы «Nucleotide» («NCBI», США). Праймеры, необходимые для амплификации этих фрагментов, подбирали с использованием программы «Oligo 6» (США). Реакционная смесь (25 мкл) содержала 67 мМ Трис-HCl (pH 8,6), 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01 % Тритон Х-100, 1,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ каждого из dNTP, 2,5 ед. акт. Taq-полимеразы и смесь оригинальных праймеров (табл. 3). Реакцию проводили в следующем режиме: денатурация при 95 0С (5 мин), далее 35 циклов амплификации по следующей схеме: 95 0С, 30 с; 60 0С, 30 с; 72 0С, 1 мин; далее 72 0С, 5 мин. 2. Рестрикционный анализ продуктов ПЦР фрагмента исследуемых генов Для анализа продуктов ПЦР (5 мкл) добавляли следующий состав реактивов: вода, соответствующая эндонуклеаза рестрикции («СибЭнзим», Россия/«Fermentas», Латвия), буфер, рекомендованный производителем для соответствующей рестриктазы («СибЭнзим», Россия/«Fermentas», Латвия). Инкубацию рестрикционной смеси с продуктами амплификации проводили в отдельных пробирках в термостате при температуре 37 °C в течение 12–16 часов. 3. Визуализация результатов в полиакриламидном геле Анализ длин рестрикционных продуктов CYP2J2, CYP4A11, PTGIS, СDH13, MTHFR, CDKN2BAS и rs11191548 T/C проводили путем электрофоретического разделения в 6 % ПААГ, приготовленном на трис-боратном буфере (ТБЕ). Результаты электрофоретического разделения фрагментов ДНК регистрировали при помощи трансиллюминатора Macrovue (LKB, Великобритания). Статистическая обработка результатов: Для сравнения исследуемых групп по частотам аллелей изучаемых генов и генотипов был использован стандартный метод χ 2 Пирсона (пакет программ «GraphPad InStat»). Критический уровень достоверности нулевой гипотезы (об отсутствии значимых различий) принимали, равным 0,05. Результаты и обсуждение В ходе выполнения работы нами были получены частоты генотипов и аллелей по генам CYP2J2, CYP4A11, PTGIS, СDH13, MTHFR, CDKN2BAS и rs11191548 T/C в группах детей с артериальной гипертензией (АГ-группа) и в контрольной группе детей (К-группа). Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей по генам CYP2J2, CYP4A11, PTGIS между АГ и К-группами не выявил статистически значимых различий (табл. 4). В нашей работе был проведен анализ однонуклеотидной замены G на T, которая находится в промоторной области гена CYP2J2. Функциональные исследования показали, что эта замена приводит к снижению экспрессии гена на 48 % (King et al., 2002). Белок CYP2J2 преобразовывает АК в сосудорасширяющие факторы — эпоксиэйкозатриеновые кислоты (EET-кислоты), поэтому наша гипотеза предполагала, что наличие аллели Т определяет риск развития АГ. Однако частота данного аллеля оказалась одинаковой для обеих исследуемых групп детей (p < 0,05). По данным литературы, сведения о значимости данной однонуклеотидной замены противоречивы. В исследовании, выполненном Полониковым с соавторами в 2008 году (Полоников, 2008), проводился анализ 33 генов, относящихся к группе ферментов биотрансформации ксенобиотиков, и 19 генов-кандидатов различных МФЗ, в том числе АГ. Замена –50G/T в гене CYP2J2 была отнесена авторами к значимым для риска развития АГ у женщин. Для мужчин такой ассоциации обнаружено не было. Ассоциация данной замены с ишемической болезнью сердца была показана в исследовании, проведенном в Германии в 2004 году (Spiecker, 2004). Работа, в которой исследовалась связь данного варианта гена CYP2J2 с инфарктом миокарда, не показала ассоциации замены с риском развития заболевания, но уровень значимости имел пограничное значение, и авторы указали на необходимость дальнейших исследований (Borgel et al., 2008). Анализ этого гена в китайской популяции не показал его ассоциации с ишемическим инсультом (Zhang et al., 2008). В то же время в исследовании Кинга были получены данные о протективном действии аллели T у афроамериканцев (King et al., 2005). Следовательно, роль и значимость замены –50G/T в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний может зависеть от этнических факторов. Также неоднозначность данных может быть связана с тем, что EET-кислоты, которые образуются под действием цитохрома 2J2, имеют разнонаправленное действие в зависимости от типа ткани, то есть они могут проявлять как сосудорасширяющее, так и сосудосуживающее действие (Alvarez et al., 2004). В нашей работе был исследована замена 8590 T на С в гене CYP4A11, в результате которой в белке CYP4A11 фенилаланин в 434 положении заменяется на серин. Функциональные исследования показали, что такое изменение больше, чем на половину уменьшает 20-HETE-синтетическую активность белка CYP4A11 (Ward et al., 2008). 20-НЕТЕ кислоты относятся к классу сосудосуживающих веществ, поэтому изначальное предположение строилось на том, что минорная аллель С должна быть протективной в отношении риска развития АГ. Однако в процессе изучение литературы, было обнаружено, что аллель С связывают с риском развития повышенного артериального давления (Gainer et al., 2005; Williams et al., 2011). В то же время при обследовании японской популяции, наоборот, было показано, что мажорная аллель T ассоциирована с риском развития АГ, а минорная аллель С являлась протективной (Fu et al., 2008; Sugimoto et al., 2008). В нашем исследовании не были обнаружены статистически значимые отличия в распределении генотипов и аллелей по гену CYP4A11, однако хотелось бы отметить, что в АГ-группе имеется тенденция к снижению частоты гетерозиготного носительства по сравнению с К-группой (16,5 ± 3,5 % и 27,3 ± 4,4 % соответственно), что может косвенно подтверждать протективную роль аллели С. Регуляция тонуса сосудов активными производными АК очень сложна, в ней участвует множество метаболитов, причем один и тот же метаболит может выполнять в зависимости от условий полярно разные функции. Возможно, поэтому вклад изменений в генах, участвующих в метаболизме АК, в развитие повышенного артериального давления установить не удалось. В ходе работы также были получены распределения частот генотипов и аллелей по генам, выявленных на основе метода GWAS в качестве значимых для риска развития АГ. Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей по генам СDH13, MTHFR, CDKN2BAS и rs11191548 T/C в АГ и К-группах не выявил статистически значимых различий (значение «p» во всех случаях >0,05) (табл. 5). Поиск генов предрасположенности методом GWAS проводится с 2005 года (Speicher et al., 2010). В настоящее время с помощью данного метода проанализировано более 230 МФЗ, что позволяет подвести некоторый итог этих исследований, оценить их вклад в понимание природы заболеваний. Прежде всего, данный метод позволил с высокой достоверностью идентифицировать множество новых локусов, ассоциированных с МФЗ. Однако обращает на себя внимание, что большинство таких ассоциаций (до 60 %) связаны с однонуклеотидными заменами, находящимися в межгенных участках генома, в интронных областях, в генах, кодирующих регуляторные РНК (Kathiresan et al., 2009). Такие ассоциации невозможно выявить традиционным методом анализа ассоциации с генами-кандидатами, который базируется на знаниях о предполагаемой функции белковых продуктов этих генов в изучаемом патологическом процессе (Zondervan et al., 2012). Непременным условием проведения GWAS-исследований является наличие больших выборок пациентов с точно установленным диагнозом и контрольной группы без заболевания, наличие контрольных образцов для многократного тестирования и контроль популяционной стратификации. В связи с этим в работе Пирсона было отмечено, что метод GWAS является довольно трудоемким из-за большого массива статистических данных, которые, в свою очередь, обладают огромным потенциалом для получения ложно-положительных результатов (Pearson, 2008). Серьезной критике подвергаются GWAS-исследования из-за того, что полученные результаты являются зачастую плохо воспроизводимыми и не подтверждаются последующими исследованиями (Zondervan et al., 2012). При этом локусы, идентифицированные с помощью GWAS, могут объяснить лишь небольшую часть (5–10 %) генетического риска развития заболевания (Аульченко, 2010; Speicher, 2010). По-видимому, именно этими обстоятельствами объясняется тот факт, что согласно полученным данным 4 полиморфных локуса, ранее найденных методом GWAS, не обнаружили достоверной ассоциации с развитием АГ в данной работе. Существенного вклада в развитие АГ у детей школьного возраста не вносят и варианты генов каскада АК (CYP2J2, CYP4A11, PTGIS).

About the authors

Mariya Dmitriyevna Kanayeva

Saint-Petersburg State University

Email: kanaeva.masha@yandex.ru
Student, Senior Researcher, Deptartament of Genetics and Selection

Andrey Sergeyevich Glotov

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, Russian Academy of Medical Sciences

Email: anglotov@mail.ru
candidate of biological scientist, senior scientist, lab. of prenatal diagnosis of congenital and inherited diseases

Yelena Sergeyevna Vashukova

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, Russian Academy of Medical Sciences

Email: vi_lena@list.ru
scientist, lab. of prenatal diagnosis of congenital and inherited diseases

Galina Igorevna Obraztsova

Federal heart, blood and endocrinology centre of ministry of health care

Email: galinaobraz@mail.ru
doctor of medical sciense

Vladislav Sergeyevich Baranov

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, Russian Academy of Medical Sciences

Email: baranov@vb2475.spb.edu
professor, corresponding member of Russian Academy of of Medical Sciences, head of the laboratory of prenatal diagnosis of congenital and inherited diseases

References

Supplementary files