Transgenic plants as bioreactors for the production of substances of medicinal and veterinary importance

Full Text

Введение Биотехнология является одним из наиболее быстро развивающихся направлений современной биологии. Она позволяет конструировать организмы с заданными свойствами и использовать их в качестве биореакторов для производства гетерологичных белков. Наиболее перспективным направлением современной биотехнологии является получение организмов-продуцентов разнообразных белков человека и животных, имеющих медицинское и ветеринарное назначение. Создание лекарственных препаратов на основе этих белков открывает новые возможности в диагностике, профилактике и лечении различных заболеваний. Организация масштабного производства биологически активных соединений требует создания высокоэффективных организмов-продуцентов. В настоящее время для синтеза белков используются различные системы экспрессии на основе бактерий, дрожжей (Падкина с соавт., 2010), культур клеток насекомых и млекопитающих (Assenberg et al., 2013, Lambertz et al., 2014). Развиваются и такие направления, как наработка гетерологичного белка в молоке трансгенных животных и в бесклеточных системах (Bosze et al., 2008). Применение растительных систем в качестве продуцентов разнообразных веществ в фармацевтической промышленности является одним из актуальных направлений метаболической инженерии, направленной на реализацию трансгенной клеткой новых биохимических реакций (Дейнеко, 2012; Sharma, Sharma, 2009). Обладая богатым природным биохимическим потенциалом, растения могут быть великолепными источниками разнообразных веществ: сахаров, фенольных соединений, жирных кислот, стероидов, алкалоидов и других биологически активных веществ, многие из которых сами по себе представляют большую ценность для фармакологии и медицины (Рукавцова с соавт., 2006; Дейнеко, 2012). В настоящее время активно проводятся исследования по модулированию вторичного обмена растений, в т. ч. методами генной инженерии, что позволяет управлять биосинтезом ценных биологически активных веществ лекарственных растений, создавать «дизайнерские» препараты и значительно изменять вторичный метаболизм, привнося в растения способность синтезировать новые вещества, или, наоборот, понижать их ядовитость, выключая метаболические пути биосинтеза терпеноидов, алкалоидов и фенольных соединений (Oksman-Caldentey, Inze, 2004; Staniek et al., 2013). Преимущества растительных систем Растения как продуценты являются одним из наиболее привлекательных объектов в биотехнологии. Важнейшим преимуществом растений является их автотрофный способ питания. Основная масса систем гетерологичной экспрессии на основе бактерий, дрожжей и культур клеток животных требует дорогостоящих культиваторов и сред для выращивания. Применение трансгенных растений в качестве биореакторов позволяет получать большую биомассу на относительно небольших площадях при сравнительно небольших трудозатратах и капиталовложениях, что является важным преимуществом для агропромышленного производства. Себестоимость рекомбинантных белков, произведенных в растениях, даже с учётом 50 % потерь при выделении и очистке составляет 2-10 % от стоимости продукции гетерологичных белков в микроогранизамах и в 1000 раз дешевле, чем в животных (Sharma, Sharma, 2009). Целые растения можно выращивать в теплицах или климатических камерах, в почвенной культуре, гидропонике или на стерильных твердых средах. Более того, растительные продуценты гетерологичных белков могут культивироваться и в условиях in vitro, в виде каллусов, «бородатых корней» или суспензионных клеточных культур (Stiles, Liu, 2013). Последние способы позволяют выращивать растения-продуценты в контролируемых условиях, что важно в связи с неоднозначным отношением общественности и законодательными ограничениями по отношению к генетически-модифицированным организмам. Возможность нарабатывать большие растительные массы в биореакторах, стала значимым этапом развития биотехнологии растений, так как часто продуцентами важных лекарственных веществ являются редкие, занесенные в «Красную книгу» тропические и эндемические растения, которые недоступны для агротехнического производства в умеренных климатических зонах большинства развитых стран мира (Рукавцова с соавт., 2006). Важным аспектом растительной биотехнологии является относительная биобезопасность использования целевых соединений человеком, получаемых с помощью трансгенных растений. В отличие от культур клеток бактерий, дрожжей, насекомых и млекопитающих, синтез гетерологичных веществ в растениях исключает риск поражения вирусными патогенами, прионами и эндотоксинами, опасными для млекопитающих (Hellwig et al., 2004). С другой стороны, определенные проблемы могут возникнуть в связи с загрязнением целевого белка протеинами и токсичными вторичными метаболитами непосредственно самого растения. Эта проблема может быть решена путем очистки или модуляции вторичного обмена у растений-продуцентов (Staniek et al., 2013). Универсальность аппарата транскрипции и трансляции растений как эукариотов позволяет использовать их не только для накопления гомологичных соединений, синтезируемых данным видом растения, но и для синтеза гетерологичных соединений различного происхождения (Глеба, 1998). Это особенно актуально при создании продуцентов белков животного происхождения, для которых необходимы процессы созревания и правильной укладки. Уже в 1982 году более 95 используемых в медицине белков были разрешены к производству с использованием клеточных культур бактерий, дрожжей, насекомых и млекопитающих (Thomas et al., 2002). Однако подобные системы имеют ряд недостатков. Например, в клетках прокариот не происходит посттрансляционная модификация и правильная укладка полипептидных цепей многих эукариотических белков. Напротив, растения-продуценты, подобно животным клеткам способны вырабатывать активные формы сложных белков с соответствующей посттрансляционной модификацией, например, гликозилированием, и обеспечить укладкубелков, сходную с таковой в клетках млекопитающих (Thomas et al., 2002). Еще одним преимуществом при создании растений-биореакторов является наличие разнообразных относительно простых и отработанных методов генетической трансформации (Лутова, 2010). Гетерологичный ген может либо интегрироваться в геном растения-хозяина, либо находиться в составе вектора для временной (транзиентной) экспрессии (Obembe et al., 2011). Использование тканеспецифичных или индуцибельных промоторов позволяет аккумулировать целевой белок в определенных органах растения (семенах, плодах, клубнях, корнеплодах, листьях) и/или под действием индукторов, что облегчает сбор растительного материала. Присоединение к целевому белку сигналов внутриклеточной локализации обеспечивает требуемую компартментализацию и позволяет длительное время хранить и транспортировать продукт без выделения, консервации или заморозки. Наконец, для многих белков медицинского и ветеринарного назначения, способных оказывать эффект при пероральном введении, предложен вариант применения, при котором не требуются процедуры выделения и очистки. Для этого предполагается использовать съедобные растения-продуценты в пищу человека и/или животных в качестве пробиотических добавок. Подобные растения, синтезирующие гетерологичные белки-антигены или наиболее важные иммуногенные фрагменты антигенов возбудителей значимых заболеваний, называются «съедобными вакцинами» или «растениями-вакцинами». Аналогично можно создать «растения-адъюванты» и «растения-имуномодуляторы», вырабатывающие цитокины и другие иммуностимулирующие белки, «растения-гормоны» и т. п. (Desai et al., 2010; Obembe et al., 2011). Эти меры позволяют резко снизить стоимость наработанного в растениях рекомбинантного белка и упростить практику его применения. Растения-продуценты рекомбинантных белков С момента публикации в 1983 г. первых работ, посвященных получению трансгенных растений табака (Barton et al.,1983; Herrera-Estrella et al.,1983), генная инженерия растений прошла стремительный путь развития и в настоящее время трансгенные растения широко используются в фармацевтической промышленности. Попытки синтезировать животные белки в растительных системах увенчались успехом в 1986 г. Первым фармацевтически значимым белком, вырабатываемым растениями табака и подсолнечника, стал человеческий гормон роста (Barta et al., 1986). В растениях синтезируются более ста фармакологических соединений, а число генетически-модифицированных видов растений перевалило за 150, и с каждым годом этот список только увеличивается (Рукавцова с соавт., 2006; Дейнеко, 2012). Чаше всего, в качестве растений, на базе которых создаются продуценты фармакологически значимых белков, используют табак, томат, картофель, резуховидку, морковь, горох, сою, люцерну, клевер, салат, банан, кукурузу, пшеницу и рис (Рукавцова с соавт., 2006; Sharma, Sharma, 2009). В последнее время активно используют ряски (Lemna, Spirodela), мох Physcomitrella patens и одноклеточные водоросли (Chlamydomonas, Chorella, Odontella, Phaeodactylum и Tetraselmis) (Дейнеко, 2012; Sharma, Sharma, 2009). Из водорослей проще получать очищенные препараты рекомбинантных белков. Кроме того, гаплоидный набор хромосом Physcomitrella и водорослей позволяет относительно легко манипулировать геномом этих растений, нокаутируя гены, отвечающие за протеолиз и гликозилирование белков, или внедряя чужеродные гены, отвечающие за эти процессы. Так, наибольшие успехи в создании растений с гуманизированной системой гликозилирования достигнуты именно на Physcomitrella patens (Koprivova et al., 2004). С другой стороны, сельскохозяйственные растения активно применяются для создания съедобных растений-вакцин. Выбор растения для создания продуцента чрезвычайно важен. Это растение должно относительно легко трансформироваться, вводиться в культуру in vitro и регенерировать в целые растения. Желательно, чтобы на его основе можно было бы легко получать культуру клеток. Растение должно обладать высокой скоростью роста, достаточно большой биомассой, быть самоопыляемым (для семенных растений) и интенсивно размножаться вегетативным способом. Кроме того, желательно, чтобы оно было съедобным и имело относительно короткий (одно-двулетний) жизненный цикл. Важным критерием при выборе растения-кандидата служит наличие полностью секвенированного и аннотированного генома. Именно по этой причине такие растения как резуховидка, рис, Physcomitrella, Chlamydomonas и др. активно используются в качестве биореакторов. К сожалению, выполнение всех перечисленных условий не всегда возможно, а иногда и не целесообразно. Например, при создании съедобных продуцентов может возникнуть необходимость в трансформации конкретных видов растений, являющихся пищей для целевой группы животных или человека. Трансформация растений Основную массу цветковых растений-продуцентов в настоящее время получают с помощью агробактериальной трансформации (Глеба, 1998; Лутова, 2010). Для этих целей используют Agrobacterium tumefaciens, A. rhizogenes и родственные им формы, обладающие естественным механизмом трансформации. Этот метод применяется для стабильной трансформации ядерного генома большинства двудольных и ряда однодольных растений и обеспечивает, как правило, монокопийную интеграцию гетерологичного гена (Gao, Nielsen, 2013). Другой способ стабильной трансформации - биобаллистика, которая заключается в обстреле клеток микроскопическими частицами золота или вольфрама с нанесенной на них векторной ДНК. Это универсальный метод генной инженерии, который можно применять для генетической трансформации любого живого существа. Биобаллистический метод не зависит от видовой принадлежности растения, позволяет трансформировать как ядерный геном, так и геном органелл (хлоропластов и митохондрий). К недостаткам этого метода относится низкая частота трансформации и множественность вставки (Gao, Nielsen, 2013). Важным преимуществом стабильной трансформации ядерного генома является наследование трансгенной вставки в ряду поколений, что позволяет получать чистые линии и гибриды для массового использования. К основным недостаткам ядерной трансформации относится низкий уровень экспрессии трансгена, в результате чего содержание рекомбинантного белка часто не превышает 1 % от общего содержания белка клетки, и может уменьшаться при активации процесса сайленсинга (Савельева с соавт., 2009; Дейнеко, 2012). Более того, возможность свободной гибридизации трансгенного растения с культурными и дикорастущими родственниками несет опасность неконтролируемого распространения трансгена в природе. Альтернативой ядерной трансформации является внедрение трансгена в геном хлоропластов. Каждая клетка растений содержит около 100 пластид, в свою очередь, каждая пластида содержит до 100 копий пластидной ДНК. Поэтому транспластомные растения отличаются высоким уровнем экспрессии гетерологичной вставки и содержанием рекомбинантного белка, которое может достигать 70 % от общего белка клетки, они не подвержены эффекту сайленсинга (Дейнеко, 2012). Хлоропласты у высших растений передаются потомству только по материнской линии, поэтому выращивание транспластомных растений устраняет угрозу неконтролируемого распространения трансгена в полевых условиях. Синтез гетерологичного белка в пластидах может понижать его токсическое воздействие на клетку хозяина. Однако существенным недостатком данной системы экспрессии является невозможность направления рекомбинантного белка в секреторную систему клетки и, соответственно, проведения ряда посттрансляционных модификаций (Desai et al., 2010). Получение транспластомных растений представляет собой более сложную процедуру, нежели агробактериальная трансформация, и хорошо разработано пока только для табака (Дейнеко, 2012), хотя и сообщается об успешной трансформации пластома у томата, баклажана, хлопчатника, сои и салата (Obembe et al., 2011). Перспективной является технология транзиентной экспрессии, не предусматривающей встраивание гетерологичного гена в геном хозяйской клетки и обеспечивающей временную наработку рекомбинантного белка. Транзиентная экспрессия осуществляется путем агроинфильтрации, вирусной трансформации и магнифекции (Merle et al., 2002; Obembe et al., 2011). Метод агроинфильтрации заключается в обработке тканей растений агробактериями в присутствии повреждающих клетки агентов, или в вакууме, что вызывает массовое заражение клеток, появление в них множества копий Т-ДНК и наработку большого количества рекомбинантного белка. Трансформация с помощью модифицированных вирусов растений приводит к их массированному размножению, появлению множества копий гетерологичного гена и интенсивной наработке белка в растительной клетке. Метод магнифекции представляет собой гибридную технологию, когда вирусный вектор лишается белков, отвечающих за заражение хозяйской клетки, и вводится туда, находясь внутри агробактерий, что позволяет значительно увеличить выход целевого белка (Gleba et al., 2014). Векторы транзиентной экспрессии не наследуются при половом размножении растений, что устраняет угрозу бесконтрольного распространения трансгена. Транзиентная экспрессия требует выращивания растений в контролируемых условиях, для соблюдения режима стерильности. Недостатком этого метода является незначительное количество рекомбинантного белка, полученного в результате одного акта трансформации, и необходимость постоянной наработки векторной системы для следующих трансформаций. Транзиентная экспрессия, не требующая регенерации целого растения, может применяться для быстрого получения рекомбинантных белков, в первую очередь вакцин, в условиях ограниченного времени (Obembe et al., 2011; Gleba et al., 2014). Рекомбинантные белки, синтезируемые растениями-продуцентами Как уже указывалось выше, первым белком, произведенным в растениях-продуцентах, был человеческий гормон роста (Barta et al., 1986). В 1990 г. в растениях табака и картофеля синтезировали человеческий сывороточный альбумин (Sijmons et al., 1990). В дальнейшем, множество ценных белков человека и животных было наработано в растениях. В целом, их можно подразделить на несколько групп: структурные и транспортные белки, ферменты, ингибиторы, гормоны, иммуномодуляторы (цитокины), антитела, антигены (вакцины), а также ряд других белков (Рукавцова с соавт.,2006; Дейнеко, 2012; Sharma, Sharma, 2009; Obembe et al., 2011). Структурные и транспортные белки Помимо сывороточных альбуминов в растениях синтезировали ряд других структурных белков. Так, в 1997 году была получена трансгенная кукуруза, в семенах которой накапливался рекомбинантный авидин - биотин-связывающий гликопротеин из яичного белка земноводных, пресмыкающихся и птиц (Hood et al., 1997). Авидин используется в качестве коммерческого препарата в диагностических наборах для определения биотинилирования белков. В растениях табака были синтезированы коллаген (Ruggiero et al., 2000; Merle et al., 2002) и эластин (Scheller et al., 2004). Из пищевых белков в растениях вырабатывают белки молока, казеин (Chong et al., 1997) и лактальбумин (Terashima et al., 1999; Yu et al., 2001), а из транспортных - гемоглобин (Dieryck et al., 1997), аполипопротеин (Obembe et al., 2011) и лактоферрин (Daniel et al., 2000; Rance et al., 2002). Ферменты и ингибиторы Значительные успехи достигнуты в создании растений-продуцентов рекомбинантных ферментов. В растениях риса синтезируют лизоцим (Yang et al., 2003), кукурузы - трипсин (Woodard et al., 2003), а резуховидки - человеческий внутренний фактор (фактор Касла), активирующий витамин B12 (Keyet al., 2008). В ряде растений вырабатывают α-галактозидазу (Obembe et al., 2011), β-глюкуронидазу, пероксидазу, лакказу, целлюлазу, ксиланазу и другие ферменты, лизирующие клеточные стенки растений (Basaran, Rodrigues-Cerezo, 2008). Эти ферменты предполагают использовать для разрушения целлюлозы при производстве био-этанола (Obembe et al., 2011). β-глюкуронидаза широко применяется в диагностических целях. Отдельно следует остановиться на глюкоцереброзидазе (талиглуцеразе α, Cramer et al., 1996; Shaaltiel et al., 2007). Дефект в кодировании этого фермента у человека приводит к развитию тяжелого наследственного заболевания - глюкозилцерамидного липидоза (болезнь Гоше 1 типа). С использованием суспензионной культуры трансгенной моркови биотехнологическая компания Protalix Biotherapeutics (Израиль) производит препарат ELELYSO®. Он не только прошел все доклинические и клинические испытания, но уже одобрен Всемирной организацией здравоохранения и доступен на фармацевтическом рынке. Большинство других препаратов ещё проходят клинические испытания и только лишь приближаются к коммерческому использованию. Некоторые из них, такие как TrypZean™, Lacromin™ (человеческий трипсин и лактоферрин из кукурузы соответственно, производство Prodigene, США) и Lysobac™ (лизоцим из риса, производство Ventria Bioscience, США) пока доступны в качестве химических препаратов, не предназначенных для употребления внутрь. В трансгенных растениях экспрессируют также гетерологичные гены, кодирующие ингибиторы трипсина (α1-антитрипсин и апротинин; Zhong et al., 1999; Terashima et al., 1999; Trexler et al., 2002) и тромбина (гирудин; Parmenter et al., 1995). Регуляторные белки Из регуляторных белков, помимо уже упомянутого соматотропина, в растениях табака синтезировали энкефалины (Vandekerckhove et al., 1989), эпидермальный фактор роста (Higo et al., 1993), кальмодулин (Desai et al., 2002) и инсулиноподобный фактор роста (Daniell et al., 2009), причём последний - в транспластомных растениях. Получены трансгенные растения резуховидки, в семенах которой накапливается человеческий рекомбинантный инсулин (Nykiforuk et al., 2006). Отдельную группу регуляторных белков составляют цитокины - группа белковых медиаторов, участвующих в регуляции пролиферации, дифференцировки и клеточной подвижности. Цитокины являются важными компонентами иммунной системы, они также задействованы в эмбриогенезе, влияют на нервную систему и органы кроветворения. Эритропоэтин - сильно гликозилированный цитокин был одним из первых рекомбинантных цитокинов, полученных в клетках растений табака. Ген эритропоэтина экспрессировался под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) и кодировал секреторный сигнальный пептид на N-конце белка. Рекомбинантный эритропоэтин был гликозилирован, однако состав и длина полисахаридных цепочек отличались от таковых у млекопитающих, в результате чего белок не имел биологической активности in vivo (Matsumoto et al., 1995). Высокий уровень транзиентной экспрессии гена EPO был достигнут в протопластах мха Physcomitrella patens дикого типа и мутантных линий Δ-fuc-T Δ-xyl-T с измененной системой гликозилирования (Weise et al., 2007). Получены также целые растения-продуценты эритропоэтина на базе табака и резуховидки (Sirko et al., 2011; DaCunha et al., 2014). Кроме эритропоэтина на базе растений табака, томата, картофеля, резуховидки, салата, риса, сахарного тростника, ряски, Aloe vera и P. patens созданы биопродуценты, вырабатывающие разнообразные цитокины человека и животных: колониестимулирующие факторы, факторы некроза опухолей, фактор роста фибробластов, интерфероны (см. ниже) и интерлейкины (Рукавцова с соавт., 2006; Дейнеко, 2012; Sharma, Sharma, 2009; Sirko et al., 2011; DaCunha et al., 2014). Препараты рекомбинантных цитокинов различного происхождения активно применяются для профилактики и терапии иммунодефицитов, малокровия, острых и хронических вирусных и бактериальных инфекций, онкологических заболеваний (Рукавцова с соавт., 2006; Sirko et al., 2011; DaCunha et al., 2014). Перспективным является использование цитокинов в качестве адъювантов для усиления иммунного ответа при вакцинации. В случае с выработкой рекомбинантных ферментов и структурных белков, их всегда необходимо выделять из растений и очищать для дальнейшего использования. Растения, синтезирующие гетерологичные регуляторные белки (гормоны и цитокины), можно также подвергать переработке или непосредственно использовать в пищу человека или на корм животных, также как и растения-вакцины. Антитела (иммуноглобулины) Следующим направлением фитофармацевтики является создание растений-продуцентов антител. Антитела играют главную роль в гуморальном иммунитете. Типичные иммуноглобулины представляют собой тетрамеры из двух идентичных тяжелых и двух легких цепей. Кроме того, существуют и более сложные формы, например, секреторные антитела, представляющие собой димеры обычных антител и включающие две дополнительные полипептидные цепи. Все антитела гликозилированы. Впервые гетерологичная экспрессия антител была проведена в растениях табака (Hiatt et al., 1989). Данная работа стала доказательством того, что растения могут синтезировать не только простые гетерологичные пептиды, но и собирать сложные функциональные гликопротеины, состоящие из нескольких субъединиц. Были созданы линии трансгенных растений, синтезирующих отдельные тяжёлые или лёгкие γ- и κ-цепи иммуноглобулинов. Скрещивание между этими трансформантами дало потомство, способное к сборке антител в одной клетке. Такие антитела обладали иммуногенностью и накапливались в клетках в количестве до 1,3 % от суммарного растворимого белка (Рукавцова с соавт., 2006; Hiatt et al., 1989). Более того, моноклональные антитела человека, синтезированные растениями ряски, проявляли большую активность, чем их гомологи, синтезированные в клетках CHO-линии яичников китайских хомяков (Дейнеко, 2012). В качестве платформы для синтеза антител используются табак (Nicotiana tabacum и N. benthamiana), резуховидка, горох, соя, люцерна, ряска, рис и пшеница (Рукавцова с соавт., 2006; Sharma, Sharma, 2009; Obembe et al., 2011). Кроме полноразмерных иммуноглобулинов в растениях были успешно синтезированы их производные: антиген-связывающие Fab-фрагменты (fragment antigen binding), одноцепочечные вариабельные фрагменты (single-chain variable fragment, scFv), биспецифичные вариабельные фрагменты, вариабельные фрагменты тяжёлых цепей, секреторные антитела, химерные антитела, в которых легкая и тяжелая цепь слиты в единый полипептид, или сшиты с другими животными или растительными белками (McCormick et al., 1999; Ma et al., 2003). Полноразмерные антитела достаточно нестабильны в цитоплазме клеток растений-продуцентов, поэтому их принято направлять в секреторный путь или во внутриклеточные компартменты (Sharma, Sharma, 2009). Синтезированные растениями рекомбинантные антитела получили название «plantibodies» (De Jaeger et al., 2000). После выделения и очистки из растительных тканей подобные антитела могут использоваться в качестве лекарственных препаратов или диагностических средств. В самих растениях «растительные антитела» могут применяться для автоиммунизации против патогенов и ряда токсинов, включая гербициды (De Jaeger et al., 2000). Одним из первых продуктов на основе трансгенных растений табака, принятым в Европейском Союзе в качестве фармацевтического препарата, является CaroRx (Planet Biotechnology, США), представляющий собой секреторные антитела IgA против Streptococcus mutans - основного возбудителя кариеса (Sharma, Sharma, 2009). Эти антитела при нанесении их на зубы добровольцев оказались очень эффективными и предотвращали повторное заражение S. mutans на период до двух лет (Larrick et al., 2001). Еще один пример антител, прошедших фазу I клинических испытаний - scFv-антитела против неходжкинской лимфомы (McCormick et al., 1999). Другие моноклональные антитела, полученные из трансгенной сои - антитела против генитального герпеса, также могут быть внедрены в производство (Zeitlin et al., 1998). Эти антитела, несмотря на различие в гликозилировании, защищали мышей от вируса герпеса типа 2 так же хорошо, как и антитела, синтезированные в культуре клеток человека. Антигены (растения-вакцины) В настоящее время интенсивно разрабатывается концепция биосинтеза в растениях рекомбинантных антигенов возбудителей различных болезней и создание на их основе «растений-вакцин», чьи плоды, семена, листья или корни можно использовать в пищу. Применение «съедобных вакцин» делает ненужной дорогостоящую процедуру выделения и очистки антигенов, которая необходима при создании вакцин для парентерального введения. Впервые структурная идентичность и иммуногенность антигена, синтезированного в растениях, была подтверждена в 1992 г., когда были получены трансгенные растения табака, экспрессирующие ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg; Mason et al., 1992). В дальнейшем были получены растения картофеля, суспензионные культуры табака и сои, где количество антигена достигало 1,7 мг/г сухого веса (Richter et al., 2000; Smith et al., 2002). Выделенный из листьев табака HBsAg запускал иммунный ответ у мышей (Thanavala et al., 1995). Кроме того, этот антиген, синтезируемый растениями картофеля, был более иммуногенным, чем продуцируемый дрожжами (Kong et al., 2001). Проведены испытания «съедобной вакцины» против вируса гепатита В на основе трансгенного картофеля на добровольцах и показана её иммуногенность при оральном введении (Thanavala et al., 2005). В настоящее время имеются публикации, в которых описаны трансгенные растения, синтезирующие более 50 различных антигенов патогенов человека и животных, в том числе бактериальной и вирусной диареи, сибирской язвы, ящура, бешенства, папиломы, лимфомы, ОРВИ, кори, ВИЧ, дифтерии, коклюша, столбняка, туберкулеза, болезни Альцгеймера, малярии, гастроэнтерита, геморрагических лихорадок, козьей чумы, вирусной чумы крупного рогатого скота, цитомегаловирусной инфекции, парвовирусной инфекции собак, птичьего гриппа, болезни Ньюкасла и других (Sharma, Sharma, 2009). Растения-вакцины получают на основе рапса, резуховидки и табаков (требуется очистка), картофеля, томата, физалиса, люцерны, люпина, моркови, салата, шпината, ряски, банана и кукурузы (Рукавцова с соавт., 2006; Kim, Yang, 2010; Obembe et al., 2011). Различные субъединичные вакцины получены в трансгенных растениях и для многих из них показана иммуногенность при оральном введении людям и животным (Tacket et al., 1998; 2000; Kim, Yang, 2010; Obembe et al., 2011). Антигены, синтезирующиеся в растениях, защищены растительными клеточными стенками от протеолиза при прохождении пищеварительного тракта и могут быть легко доставлены к клеткам слизистой оболочки кишечника, где они стимулируют мукозную систему иммунитета, базирующуюся на антиген-представляющей способности макрофагов тонкого кишечника (Дейнеко, 2012). Две вакцины, синтезируемые в растениях картофеля, уже прошли стадию клинических испытаний - это субъединица B термолабильного токсина (LTB) патогенного штамма E. coli (ETEC) и капсидный белок вируса Норфолк (NVCP) (Tacket et al., 1998; 2000). Гены, выделенные из двух кишечных паразитов, были использованы при создании идеальных съедобных вакцин, поскольку кодируют белки, для которых характерна мультимерная структура и которые являются устойчивыми к перевариванию в кишечнике человека. Каждый из этих белков накапливался в больших количествах в клубнях картофеля и правильно собирался в олигомеры. Клинические испытания рекомбинантной вакцины LTB показали, что поедание добровольцами сырых клубней картофеля, содержащих 0,3-10 мг LTB, приводило к образованию мукозных и системных антител с высокими титрами (Tacket et al., 1998). Иногда антигены сшивают с другими белками для облегчения детекции, например, с геном β-глюкуронидазы (GUS). По GUS-активности можно легко определить уровень экспрессии гена, контролирующего синтез антигенов в трансформантах. При этом белки сохраняли свою иммуногенность (Дейнеко, 2012). В настоящее время более десятка растительных вакцин находятся на стадии доклинических и клинических испытаний и скоро будут доступны на рынке фармацевтических препаратов (Kim, Yang, 2010; Obembe et al., 2011). Нарабатываемые в табаке вакцины против кариеса и болезни птиц, вызываемой вирусом Ньюкасла, уже сертифицированы в Евросоюзе и США соответственно (Kim, Yang, 2010). Способы повышения эффективности растительных систем экспрессии Одной из основных проблем при получении растений-продуцентов является довольно низкий уровень вырабатываемого рекомбинантного белка, который часто не превышает 1 % от растворимых белков клетки. Продукция гетерологичного белка зависит от эффективности транскрипции, трансляции, корректного процессинга и устойчивости синтезированного белка к протеолизу. Уровень экспрессии гетерологичного гена зависит от того, в какую область ядерного хроматина он встроился. Многочисленные работы по трансформации продемонстрировали, что частота встраивания трансгена в область эухроматина значительно выше по сравнению с частотой встраивания этого же трансгена в гетерохроматиновый участок генома (Лутова, 2010). С другой стороны ещё одной проблемой является замолкание трансгена в результате явления сайлесинга, вероятность которого существенно возрастает при увеличении количества встраиваемых копий (Катохин с соавт., 2006). Синтезируемый в большом количестве белок может проявлять токсичность в цитоплазме клетки продуцента или, наоборот, быстро расщепляться протеолитическими ферментами. Некорректная сборка и характерная для растений система гликозилирования может приводить к низкой биологической активности гетерологичных белков и развитию аллергических реакций. Для решения перечисленных проблем разработан ряд подходов. Использование различных промоторов При создании большинства трансгенных растений применяют конститутивные промоторы. Чаще всего используются промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты и промотор убиквитина кукурузы или других растений. Рукавцовой Е. Б. с соавторами (2006) были получены растения табака, экспрессирующие рекомбинантный ген поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) под контролем одинарного и двойного промоторов 35S вируса мозаики цветной капусты. Использование двойного промотора 35S было более эффективным и обеспечивало синтез антигена до 0,05 % от суммарного растворимого белка. Стогер со авторами (Stoger et al., 2000) получили растения риса, трасформированные геном, кодирующим одноцепочечные вариабельные фрагменты рекомбинантного химерного антитела человека и мыши (scFvT84.66), под контролем промотора убиквитина кукурузы и усиленного p35SCaMV. В листьях уровень экспрессии трансгенов был одинаковым под контролем обоих промоторов, но целевой белок не накапливался в семенах при использовании 35S промотора. Значительно реже применяются другие конститутивные промоторы, к числу которых можно отнести полиубиквитиновый промотор сои, агробактериальные промоторы маннопин- и нопалинсинтаз, Mac промотор, который является гибридом маннопинсинтазного промотора и энхансера p35S, промотор актина из банана и др. (Sharma, Sharma, 2009). Основным преимуществом этих промоторов является конститутивная экспрессия целевого гена во всех органах растения. Однако зачастую конститутивные промоторы отличаются низким уровнем экспрессии и подвергаются сайленсингу. Один из способов увеличения уровня экспрессии трансгена заключается в применении тканеспецифичных промоторов. Эти промоторы обеспечивают накопление рекомбинантного продукта в определённых тканях и на определённых стадиях онтогенеза. Они позволяют синтезировать трансгенные продукты в таких органах растений, как семена, плоды, листья, запасающие органы (корнеплоды, корне- и стеблеклубни, корневища, клубнелуковицы или луковицы). Направленный синтез белка в определенных органах снижает его потенциальный негативный эффект в других тканях, а также уменьшает его влияние на рост и продуктивность растений. Промотор пататина из клубней картофеля был использован для направленного клубне-специфичного синтеза таких антигенов как CTB (холерный токсин B), LTB, HBsAg и др. (Richter et al., 2000; Sharma, Sharma, 2009). Трансгенные растения картофеля, экспрессирующие ген антигена HBsAg под контролем двойного 35S и пататинового промоторов, аккумулировали до 1 мкг целевого антигена на 1 г массы клубня картофеля именно при использовании 35S-промотора (Шульга с соавт., 2004). Возможна орган-специфичная экспрессия гетерологичных генов и в корнеплодах растений. Так, в последнее время появился ряд сообщений об успешном применении корне-специфичных промоторов из корнеклубневых крахмалоносных культур (батат, маниок, ямс) для экспрессии генов в корнеплодах моркови (Arango et al., 2010; Noh et al., 2012). Плоды и семена часто применяются для накопления растительных вакцин и антител, требующих минимальной очистки для последующего применения. Это достигается с помощью плодоспецифичного промотора томатов Е8. Из различных растений клонированы промоторы, позволяющие синтезировать чужеродные биоактивные молекулы исключительно в семенах. К их числу можно отнести промоторы глобулина-1, глобулина 7S и зеина из кукурузы, глютелина риса, P-конглиценина сои и арцелина фасоли (Sharma, Sharma, 2009). Экспрессия целевых генов в запасной ткани семян, где уровень биодеградации ниже, чем в обводнённых тканях (листья, плоды), способствует повышению продуктивности на 2-3 порядка. Кроме того, необходимо отметить, что семена могут быть отличным резервуаром для хранения белка. Известно, что в семенах гороха гетерологичные белки могут сохраняться до 6 месяцев (Дейнеко, 2012). Значительный прогресс достигнут в создании съедобных вакцин на основе семян кукурузы (Chikwamba et al., 2002). Субъединица LTB накапливалась в семенах на уровне до 0,1 % от сырого веса и обладала иммуногенными свойствами при поедании мышами. Ассоциация с крахмалом обеспечивает термостабильность антигена и его устойчивость к протеолитической деградации при попадании в желудочно-кишечный тракт. На основе семян кукурузы также создана вакцина, защищающая свиней от вирусного гастроэнтерита (Lamphear et al., 2004). Показано, что арцелиновый промотор позволяет экспрессировать гетерологичные гены с высокой эффективностью. Трансгенные растения фасоли аккумулировали одноцепочечные вариабельные фрагменты мышиных иммуноглобулинов (ScFv) до 36 % от растворимого белка под контролем arc5-1 промотора (DeJaeger et al., 2000). Применение индуцибельных промоторов позволяет аккумулировать рекомбинантный белок под контролем индуцирующих веществ или воздействий. Эти промоторы пока недостаточно охарактеризованы, однако их несомненным преимуществом является отсутствие сайленсинга. Кроме того, индуцибельная аккумуляция целевого продукта требует от растения-продуцента меньше энергозатрат и менее токсична, чем конститутивная. Индуцибельные промоторы часто применяются в суспензионной культуре клеток. Транскрипционная активность химически-регулируемых, промоторов модулируется этанолом, тетрациклином, стероидами (эстрадиолом, экдизоном и глюкокортикоидами) и дефицитом сахаров, тогда как промоторы, регулируемые физическими факторами, чувствительны к температуре, свету и т. п. Самый распространённый в биотехнологии растений индуцибельный промотор α-амилазы αAmy3 активируется в отсутствие сахарозы. С его помощью получены растения-продуценты ряда белков человека: γ-интерферона, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора и α1-антитрипсина (Terashima et al., 1999; Chen et al., 2004; Sharma, Sharma, 2009). Выход целевого белка в индуцибельных системах значительно выше, чем

About the authors

Natalia Vladimirovna Saveleva

Lab. UMR

Email: nata.saveljeva@gmail.com

Mikhail Sergeevich Burlakovskiy

St. Petersburg State University

Email: burmish@yandex.ru
Dept. Of Genetics and Biotechnology

Vladislav Vladimirovich Yemelyanov

St. Petersburg State University

Email: bootika@mail.ru
Dept. Of Genetics and Biotechnology

Lyudmila Alekseevna Lutova

St. Petersburg State University

Email: la.lutova@gmail.com
Dept. Of Genetics and Biotechnology

References

Supplementary files