Association of GSTM1 (del),GSTP1 (Ile105Val) genetic polymorphisms and smoking in the family with congenital malformations

Cover Page


Cite item

Full Text

Abstract

Background. The association of GSTM1 (del) and GSTP1 (Ile105Val) polymorphisms with congenital malformations (CMs) actively studied. However, the results of various studies are conflicting. This study aims to investigate the association of GSTM1 (del), GSTP1 (Ile105Val) genetic polymorphisms and smoking in the family with congenital malformations in the newborn. Method. We studied 94 newborn with CMs and 125 healthy newborn. Null genotype of GSTM1 was identified through multiplex real-time PCR, and GSTP1 gene (Ile105Val) polymorphism was determined through TaqMan-real-time PCR. Results. The study showed that polymorphic loci of GSTM1 (del) and GSTP1 (Ile105Val) genes were not associated with the risk of congenital malformations in the newborn (P = 0,46 and P = 0,47). When comparing the frequencies of genotypes the GSTP1 (Ile105Val) gene in newborn with CMs in the families of smokers with those of healthy newborn in non-smoking families statistically significant differences between them were found (P = 0,02). The genotype Ile/Val in children was associated with CMs (ORg + f = 2,59; 95 % CI: 1,05- 6,35), while the homozygous genotype Ile/Ile in newborn was associated with a protective effect to CMs (ORg + f = 0,30; 95 % CI: 0,12-0,72). Possibly, the association of the homozygous genotype Val/Val did not reach statistical significance due to a small number of children surveyed. Conclusion. The smoking in the family increases the risk of CMs in the newborn with genotypes of GSTP1 gene (Ile105Val) polymorphism.

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Известно, что более половины врожденных пороков развития (ВПР) возникают вследствие воздействия внешне-средовых и эндогенных факторов. Широкая распространенность курения среди населения, особенно среди женщин детородного возраста, не только отрицательно отражается на качестве собственного здоровья, но и на здоровье своего потомства. В организме человека продукты табачного дыма метаболизируются с помощью ферментной системы детоксикации ксенобиотиков, функциональная недостаточность которой способствует накоплению не выведенных из организма токсичных веществ, определяющих, в свою очередь, канцеро- или тератогенный эффект (Obolenskaya et al., 2004). Во время беременности ферментная система детоксикации ксенобиотиков приобретает трехуровневый характер, функционируя в материнско-плацентарно-плодовом компартменте. Наиболее «слабым звеном» является плод из-за отсутствия или низкой экспрессии у него большинства ферментов детоксикации (Сокова, 2008). Семейство ферментов глутатион-S-трансфераз (GST) отвечает за детоксикацию реактивных электрофильных метаболитов мутагенов и канцерогенов, образующихся в результате процессов окисления микросомальными ферментами цитохрома P450, и выведении этих комплексов из организма (Гуляева с соавт., 2000). Установлено, что в неонатальном периоде (начиная с 8-й недели гестации) из всех ферментов GST экспрессируются только ферменты GSTA, GSTM и GSTP1 (Сокова, 2008). Функциональная активность ферментов GST контролируется генами, для которых характерен генетический полиморфизм. У людей отсутствие функциональной активности ферментов GSTM1 связано с обширной делецией в соответствующем гене (генотип «0/0») (Hayesetal., 2005). Ген GSTP1 имеет несколько вариантов, но более функционально значимой является нуклеотидная замена A > G в 5-м экзоне гена, которая приводит к замене аминокислоты изолейцина на валин в 105-м кодоне (105 Ile Val). Эта мутация значительно снижает активность фермента GSTP1 (Ступко с соавт., 2011). Ассоциации полиморфизмов генов GSTM1 (del) и GSTP1 (Ile105Val) c ВПР активно изучаются, но обнаруженные результаты далеко неоднозначны. В связи с этим целью настоящего исследования стало изучение ассоциаций полиморфизмов генов GSTM1 (del), GSTP1 (Ile105Val) и курения в семье c ВПР у новорожденного ребенка. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Выборки. Обследованы образцы ДНК 219 детей, родившихся при сроке гестации 35 недель и более (доношенные и недоношенные I степени), с массой тела более 2000 г. Все обследуемые дети принадлежали к русской этнической группе. В основную группу были включены образцы ДНК 94 новорожденных детей с диагнозом врожденный порок развития (группа ВПР). Постановка клинического диагноза проводилась врачами-неонатологами в соответствии с МКБ-10 (Q00-Q99) (Международная классификация болезней…). Структура ВПР представлена в таблице 1. Критерием исключения являлись пороки, ассоциированные с хромосомными аномалиями (синдром Дауна и др.), установленными во время беременности. В группу сравнения (контроль) вошли образцы ДНК 125 новорожденных детей без ВПР. Одновременно проведено анкетирование матерей детей из обеих групп, анализ историй родов и историй развития новорожденных. Влияние фактора курения анализировали на основании имеющейся информации о курении в семье, которое оценивали как курение одного из родителей или обоих родителей. В группе ВПР курение в семье отмечалось в 63,8 % случаев, а в контрольной группе - 52,9 % случаев. Работу проводили с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с требованиями 9 федерального закона от 27.07.06 г. «О персональных данных» № 152-53. Генотипирование. Выделение ДНК из лимфоцитов пуповинной крови проводили с помощью метода фенол-хлороформной экстракции с последующим осаждением этанолом, образцы ДНК хранили при -20 °C. Типирование генов GSTM1 (del) проводили методом Real-timePCR с интеркалирующим флуоресцентным красителем SYBRGreenI и анализом кривых плавления. Каждый образец амплифицировали с использованием пары специфических праймеров для GSTM1: 5′GGTCAAGGACATCATAGACGAGAA3′ (прямой) и 5′CTCAGGAGAAACTGAAGCCAAA3′ (обратный) и внутреннего положительного контроля, в качестве которого использовали легкоплавкий A/T-богатый некодирующий фрагмент генома, условно обозначаемый как LTM (low temperаture melting): 5′TGGGTGCTAGAGGTATAATCG3′ (прямой) и 5′TTAGAGGAAGCTGGGTAAGAG3′ (обратный). Размеры амплифицируемых фрагментов GSTM1 - 229 пар оснований, LTM - 127 пар оснований, расчетная температура отжига всех праймеров составляла 64-66 °C, ожидаемая температура плавления продуктов амплификации - GSTM1 - 86,5 °C, LTM - 78,5 °C. Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл, смесь содержала: 40-100 нг ДНК; 65 mM Tris-HCl (pH8,9); 0,05 % Tween 20; 16 mM (NH4)2SO4; 2,4 mM MgCl2; 0,2 mM dNTP, 0,3 mkM растворы олигонуклеотидных праймеров; 0,8XSYBRGreenI; 0,5 ед. ак. термостабильной Taq-полимеразы. Отсутствие флуоресцентного сигнала указывало на гомозиготность индивидуума по делеции гена («0/0»), наличие - на носительство «положительного» генотипа («+»), несущего функциональный аллель в гомо- или гетерозиготном состоянии. Типирование нуклеотидной замены 1404A > G (Ile105Val) гена GSTP1 (rs1695) проводили методом Real-time ПЦР с использованием технологии конкурирующих TaqMan-зондов. Каждый образец амплифицировался с использованием пары специфических праймеров и двух зондов, (5’-GATGCTCACATAGTTGGTGTAG-3’ (прямой) и 5’- GGTGGACATGGTGAATGAC-3’ (обратный); 5’-FAM-CTGCAAATACАTCTCCCTCAT-BHQ-3’ и 5’-R6G-CGCAAATACGTCTCCCTCAT-BHQ-3’). Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл, смесь содержала 40-100 нг ДНК; 300 нМ каждого праймера; по 100-200 нМ Taqman-зондов, коньюгированных с FAM или R6G; 200 мкМ-ные dNTP, амплификационный буфер, термостабильную Taq-полимеразу - 0,5 ед. акт./реакц. Реакции амплификации проводили с помощью амплификатораCFX-96 (Bio-Rad, США). Статистическая обработка данных. Соответствие частот генотипов гена GSTP1 (Ile105Val)равновесию Харди-Вайнберга проверяли по критерию χ2. Вычисление проводили с помощью программы De Finetti на сайте Института генетики человека (Tests for deviation…) В этом случае и при использовании других критериев нулевую гипотезу отвергали при P ≤ 0,05. Попарное сравнение частот аллелей и генотипов GSTM1 (del) и GSTP1 (Ile105Val) проводили с помощью двустороннего точного теста Фишера и критерия χ2. Результаты обсуждали при наличии тенденции отличий между выборками при 0,05 ≤ P ≤ 0,1. Силу ассоциации анализируемых признаков определяли с помощью величины отношения шансов (OR). Для OR рассчитывали доверительный интервал (CI) при 95%-м уровне значимости. OR, рассчитанные сопоставлением частот генотипов GST в курящих семьях с ВПР у ребенка и в семьях с условно здоровым ребенком, или, наоборот, рассчитанные только, для некурящих семей с ВПР у ребенка и семей с условно здоровым ребенком, показывают влияние генотипа (ORg) на риск возникновения ВПР у ребенка, но в разных условиях окружающей среды. OR, рассчитанные путем сопоставления частот генотипов GSTв курящих семьях с ВПР у ребенка и в некурящих семьях с условно здоровым ребенком, учитывают взаимодействие генетического признака и внешнего фактора (ORg + f). Если влияние этих факторов однонаправлено, то величина ORg + f будет выше, чем ORg для некурящих. Если же влияние этих факторов разнонаправлено, то ORg + f будет ниже (Вавилин с соавт., 2000). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ При изучении распределения частот генотипов GSTM1 (del) у детей с ВПР и детей контрольной группы было обнаружено, что гомозиготный по делеции генотип «0/0» гена GSTM1 равновероятно встречался в обеих группах (51 и 53 % соответственно, P = 0,47). Данные представлены в таблице 2. Частота этого генотипа была сопоставима с таковой у их матерей (Gordeeva et al., 2013) и с данными литературы относительно его распределения у лиц европеоидного происхождения (Garte et al., 2001). Ранее выявлены ассоциации генотипа «0/0» гена GSTM1 с атрезией пищевода (Filonzi et al., 2010), с расщелиной неба (Shaw et al., 2003) и врожденными аномалиями ЦНС (Morales et al., 2009) у детей. Расхождение наших данных с данными литературы можно объяснить особенностями частот этих видов ВПР в нашей выборке детей, где лидировали такие виды, как ВПР ССС, МВПР и ВПР МВС, тогда как вышеуказанные пороки являлись относительно редкими (n < 10) и это обстоятельство не позволило нам провести сравнение. Изучение распределения частот аллелей и генотипов GSTP1 (Ile105Val) в исследуемых группах показало отсутствие отличий между наблюдаемыми и ожидаемыми частотами при равновесии Харди-Вайнберга (данные не показаны, P > 0,05). Сравнение частот аллелей и генотипов GSTP1 (Ile105Val) в группах детей с ВПР и условно здоровыми детьми (табл. 2) не выявило статистически значимых отличий между этими группами (P = 0,29 для аллелей и P = 0,46 для генотипов). В то же время их характер распределения был сопоставим с таковым у их матерей (Gordeeva et al., 2013) и c данными итальянских исследователей (Cresci et al., 2011), но отличался от результатов американских исследователей (Ramirez et al., 2007), что можно объяснить особенностями распределения частот генотипов гена GSTP1 (Ile105Val) у разных этносов. Кроме того, наши результаты согласуются с результатами других авторов, где также не подтверждены ассоциации полиморфизма GSTP1 (Ile105Val) с ВПР ССС и расщелиной губы и/или неба у детей (Cresci et al., 2013; Ramirez et al., 2007). Ранее выявлено, что курение в семье (одного или обоих родителей) может быть ассоциировано с аллергическими реакциями органов дыхания у детей - носителей делеционных генотипов GSTM1 и GSTT1 (Вавилин с соавт., 2000). Также обнаружено, что у детей с сочетанием «0/0» генотипов GSTM1 и GSTT1 риск развития ВПР ССС был значительно выше, когда оба родителя подвергались токсическому воздействию факторов окружающей среды (Cresci et al., 2011). В связи с этим мы предположили, что курение в семье и полиморфизмы генов GST локусов M1 и P1 могут быть ассоциированы с риском ВПР. Наше исследование показало, что совместно курение в семье и полиморфизм гена GSTM1 (del) у ребенка не ассоциированы с риском ВПР. Для генотипа GSTM1«0/0» величины ORg в группах курящих и некурящих семей значимо не отличались (табл. 3). Иная ситуация была найдена в отношении курения и полиморфизма GSTP1 (Ile105Val) у детей. В группе курящих семей частоты генотипов GSTP1 (Ile105Val) у детей с ВПР и условно здоровых детей статистически значимо не отличались друг от друга (P = 0,07). Однако у детей гетерозиготный генотип Ile/Val был ассоциирован с двукратным риском ВПР (ORg = 2,12; 95 %CI: 1,06-4,26). В группе некурящих семей частоты генотипов GSTP1 (Ile105Val) у детей с ВПР и условно здоровых детей были сопоставимыми (P = 0,05). Ассоциации этих генотипов с риском ВПР также отсутствовали. При сравнении частот генотипов гена GSTP1 (Ile105Val) у детей с ВПР в курящих семьях с таковыми у условно здоровых детей в некурящих семьях были выявлены статистически значимые различия между ними (P = 0,02). При этом генотип Ile/Val у детей был ассоциирован с риском ВПР (ORg+f = 2,59; 95 %CI: 1,05-6,35), тогда как гомозиготный генотип Ile/Ile у детей был ассоциирован с протективным эффектом к ВПР (ORg+f = 0,30; 95 %CI: 0,12-0,72). Возможно, что курение в семье может модифицировать рисковую значимость генотипов гена GSTP1 (Ile105Val) в формировании ВПР у ребенка. Ранее установлено, что из всех изоформ ферментов GST только ферменты GSTP1 имели функциональную активность в тканях эмбриона и плода (Raijmakers et al., 2001), поэтому выявленные ассоциации полиморфизма гена GSTP1 (Ile105Val) и курения в семье представляют особый интерес. Совместный эффект курения в семье и гетерозиготного генотипа Ile/Val гена GSTP1 (Ile105Val) на риск ВПР у ребенка мало понятен. Возможно, выявленная ассоциация может быть обусловлена небольшим количеством обследованных детей, в результате чего ассоциации гомозиготного генотипа Val/Val не достигали статистической значимости. Известно, что полиморфизм гена GSTP1 (Ile105Val) имеет неравновесие по сцеплению с другим полиморфизмом - GSTP1 (Ala114Val). В связи с этим описано 4 аллеля гена GSTP1: А - Ile105/Ala114, B - Val105/Ala114, C - Val105/Val114 и D - Ile105/Val114. Аллель А считается нормальным, а мутантные В, С и D кодируют функционально менее активные формы фермента (активность снижена в 3-4 раза) (Ступко с соавт., 2011). Возможно, дополнительное типирование полиморфизма GSTP1 (Ala114Val) с подсчетом гаплотипов позволит сделать более обоснованные выводы относительно совместного эффекта курения в семье и полиморфных вариантов гена GSTP1 на риск возникновения ВПР у ребенка. Таким образом, наше исследование показало, что сами полиморфизмы генов GSTM1 (del) и GSTP1 (Ile105Val) не ассоциированы с риском ВПР у новорожденного. Однако курение в семье может увеличивать рисковую значимость генотипов полиморфизма гена GSTP1 (Ile105Val) в формировании ВПР у ребенка. Для более полного понимания выявленных ассоциаций генотипов GSTP1 (Ile105Val) и курения в семье требуется продолжение исследования.
×

About the authors

Irina Viktorovna Shatalina

Institute of Human Ecology of the Siberian Branch of the RAS

Email: irina_ve@mail.ru
biological engineer. Lab. of immunogenetics

Yuliya Valerievna Gareeva

M. A. Podgorbunskiy municipal clinical hospital N 3

Email: gareeva.j@bk.ru
neonatologist

Lyudmila Aleksandrovna Gordeeva

Institute of Human Ecology of the Siberian Branch of the RAS

Email: gorsib@rambler.ru
candidate of biological sciences. Head of Laboratory immunogenetics

Elena Nikolaevna Voronina

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS

Email: voronina_l@inbox.ru
candidate of biological sciences, jounior researcher. Laboratory of pharmacogenomics

Irina Mikhaylovna Sutulina

Kemerover State Medical Academy (KemSMA)

Email: sutulinaim@rambler.ru
candidate of medical sciences. Dept. of Faculty Pediatrics

Maksim Leonidovich Filipenko

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS

Email: max@niboch.nsc.ru
candidate of biological sciences, Head of Laboratory pharmacogenomics

References

  1. Вавилин В. А., Часовникова О. Б, Ляхович В. В. с соавт. (2000) Генетический полиморфизм глутатион-S-трансферазыM1 и T1 у детей, больных бронхиальной астмой. Вопросы медицинской химии. № 4: C. 388-397.
  2. Гуляева Л. Ф., Вавилин В. А., Ляхович В. В. (2000) Ферменты биотрансформации ксенобиотиков в химическом канцерогенезе. Новосибирск: серия «Экология». 85 с.
  3. МКБ 10 - Международная классификация болезней 10-го пересмотра UIRL: http://mkb-10.com/.
  4. Сокова Е. А. (2008) Особенности системы биотрансформации лекарственных средств в фетоплацентарном комплексе. Биомедицина. № 1: С. 14-25.
  5. Ступко Е. Е., Шенин В. А., Колесникова Л. И. с соавт. (2011) Роль полиморфизмов генов детоксикации ксенобиотиков в развитии миомы матки и эндометриоза. Сибирский медицинский журнал. № 5: С. 5-8.
  6. Cresci M., Foffa I., Ait-Ali L. et al. (2011) Maternaland Paternal Environmental Risk Factors, Metabolizing GSTM1 and GSTT1 Polymorphisms, and Congenital Heart Disease. Am. J. Cardiol. V.108: P. 1625-1631.
  7. Cresci M., Foffa I., Ait-Ali L. et al. (2013) Maternal and Paternal Environmental Risk Factors, Metabolizing GSTM1 and GSTT1 Polymorphisms, and Congenital Heart Disease. Pediatr. Cardiol. V. 34 (2). P. 281-285.
  8. Filonzi L., Magnani C., de΄ Angelis G. L. et al. (2010)Evidence That Polymorphic Deletion of the Glutathione S-Transferase Gene, GSTM1, is Associated with Esophageal Atresia. Birth Defects Research (Part A). V. 88: P. 743-747.
  9. Garte S., Gaspari L., Alexandrie A.-K. et al. (2001)Metabolic Gene Polymorphism Frequencies in Control Populations. Cancer Epidemiol. Biomarkers, Prev. V. 10: P. 1239-1248.
  10. Gordeeva L. A., Voronina E. N., Sokolova E. A. et al. (2013) Association GSTT1, GSTM1 and GSTP1 (Ile105Val) genetic polymorphisms in mothers with risk of congenital malformations in their children in Western Siberia: a case-control study. Prenatal Diagnosis. V. 33 (11): P. 1095-101.
  11. Hayes J. D., Flanagan J. U., Jowsey I. R. (2005) Glutathione Transferases. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. V. 45: P. 51-88.
  12. Morales E., Sunyer J., Julvez J. et al. (2009) GSTM1 polymorphisms modify the effect of maternal smoking during pregnancy on cognitive functioning in preschoolers. Int. J. Epidemiol. V. 38 (3): P. 690-697.
  13. Obolenskaya M., Teplyuk N., Sasonova L. et al. (2004) Glutathionetransferase activity and PAH-DNA adducts in human placenta as a risk factor for newborn in radioactively contaminated regions. International Journal of Radiation Medicine. V. 6 (1-4): P.154-166.
  14. Raijmakers M. T., Steegers E. A., Peters W. H. (2001). Glutathione S-transferases and thiol concentrations in embryonic and early fetal tissues. Hum Rep. V. 16: P. 2445-2450.
  15. Ramirez D., Lammer E. J., Iovannisci D. M. et al. (2007) Maternal Smoking During Early Pregnancy, GSTP1 and EPHX1 Variants, and Risk of Isolated Orofacial Clefts. Cleft Palate-Craniofacial Journal. V. 44 (4): P. 366-373.
  16. Shaw G. M., Nelson V., Iovannisci D. M. et al. (2003) Maternal Occupational Chemical Exposures and Biotransformation Genotypes as Risk Factors for Selected Congenital Anomalies. Am. J. Epidemiol. V. 157: P. 475-484.
  17. Tests for deviation from Hardy-Weinberg equilibrium and tests for association. Cited 08.09.2014. URL: http://ihg.gsf.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2014 Shatalina I.V., Gareeva Y.V., Gordeeva L.A., Voronina E.N., Sutulina I.M., Filipenko M.L.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 65617 от 04.05.2016.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies