The genetic variation in pulmonate mollusk (Arianta arbustorum L.) in Leningrad Region

Full Text

Введение В широком смысле инвазии представляют собой частный случай расширения ареала вида в результате квазиестественных перемещений и антропогенных изменений абиотических факторов окружающей среды, повлекших за собой соответствующие изменения ареала [1]. Таким образом, от естественных процессов изменения границ видовых ареалов и расселения видов, к примеру в результате климатических и ландшафтных перестроек плейстоцена, инвазии отличаются лишь масштабом времени происходящих процессов. Именно эта отличительная особенность инвазий и позволяет рассматривать их как «эксперименты, поставленные самой природой», которые предоставляют уникальную возможность наблюдать экологические и эволюционные процессы в реальном времени [24, 28]. В настоящее время многие виды успешно вселяются в новые места обитания, способствуя трансформациям сообществ-реципиентов, в том числе частично занимая экологические ниши аборигенных видов [23], несмотря на то что они теоретически должны быть менее приспособлены к условиям новой среды, чем автохтонные виды. Поскольку инвазии представляют собой быстрые эволюционные события, данные по демографической истории (эффективный размер популяции) и генетической структуре популяции - основателя инвазивного вида очень важны для ответа на один из ключевых вопросов биологии инвазий: что стоит за успешностью инвазивного чужеродного вида? Одна из загадок экологической генетики инвазий - так называемый «генетический парадокс»: каким образом новые популяции инвазивного вида преодолевают низкое генетическое разнообразие, связанное с «эффектом основателя», и вследствие этого низкий эволюционный потенциал? Ведь низкое генетическое разнообразие обычно связывают с риском вымирания, а не с успешным распространением и быстрой эволюцией за пределами естественного ареала, как это происходит с инвазивными видами. Небольшие популяции - основатели интродуцированных видов, казалось бы, должны отличаться более низкой генетической изменчивостью в сравнении с популяциями в естественном ареале в результате так называемого «эффекта основателя». Исходя из опыта природоохранных генетических исследований, следовало бы ожидать, что такие инвазивные популяции будут подвергаться высокому риску инбридинга и вымирания [27]. Генетический дрейф вместе с «эффектом основателя» также должны ограничить в таких популяциях и способность к адаптации. Среди видов наземных экосистем один из примеров чрезвычайно успешной инвазии, происходящей в последние годы в Северо-Западном регионе России, - древесная улитка Arianta arbustorum (Linnæus, 1758). За первое десятилетие нынешнего века плотность поселения ариант в некоторых местах увеличилась до тысяч экземпляров на квадратный метр, они распространились практически по всей Ленинградской области. Исторический ареал древесной улитки сравнительно невелик и занимает преимущественно Северо-Западную и Центральную Европу, Восточные Пиренеи, Южную Европу, не заходя на Пиренейский полуостров, очень распространена она в Альпах, Карпатах [5]. На севере Европы A. arbustorum, по данным открытых источников [30], распространена до широты 66° N (прибрежные территории Южной Финляндии), тогда как восточная граница ареала указана как 27° Е. По данным Лихарева и Раммельмейера (1952), на северо-западе Европы вид встречен в Калининградской области, отдельные находки были сделаны в окрестностях Санкт-Петербурга, в Латвии и прибрежных районах Эстонии. Массовые поселения A. arbustorum регистрируются на территории Ленинградской области и в Санкт-Петербурге по многочисленным персональным сообщениям со второй половины 2000-х гг. Имеются также сведения о ее недавнем и также массовом обнаружении в Псковской и Тверской областях [4]. Флуктуации численности данного вида по типу экспансии в Северо-Западной Европе отмечаются с периодичностью в 50-60 лет с 1856 г. [30]. Для Северо-Западной и Центральной России быстрая экспансия A. arbustorum зарегистрирована впервые. Данные о расселении этого вида и в Европе и за ее пределами документированы фрагментарно, молекулярных исследований с целью установления происхождения (источников) и путей инвазий на этом объекте не проводилось. Задачи настоящей работы мы видим в исследовании генетической изменчивости инвазивных популяций древесной улитки в Ленинградской области и сравнении ее уровня с автохтонными популяциями из Западной Европы. Таким путем мы хотим выявить возможное географическое происхождение популяций, пути расселения и скрытые демографические параметры, а также наиболее вероятный сценарий инвазии. Для понимания успешности инвазии и вскрытия механизмов этого успеха необходимо в первую очередь выяснить, имеет ли место, и если есть, то каким образом преодолевается в данном случае «генетический парадокс». Данные по генетической изменчивости мы используем для тестирования следующих возможных сценариев: 1) имело место неоднократное расселение из разных источников с последующим перемешиванием, повышающее генетическое разнообразие; 2) инвазия идет постепенно по модели «с камешка на камешек» (step and stone), в этом случае мы будем наблюдать постепенное уменьшение генетического разнообразия по ходу расселения вследствие последовательных «эффектов основателя»; 3) инвазия протекает по сценарию «плацдарма» (bridgehead) - в таком случае мы ожидаем низкую генетическую изменчивость в инвазивной популяции, но с уникальной генетической структурой. Поскольку, как уже было подчеркнуто выше, инвазии являются частным примером расселения видов, мы воспользовались общепринятым арсеналом методов в рамках современного научного направления «филогеография», использующих по большей части в качестве молекулярного маркера митохондриальную ДНК животных. Материалы и методы Сбор образцов Сбор образцов проводили в период с мая по октябрь 2014 г. Все образцы хранились в 96 % этаноле при температуре 20 ˚С. Оригинальная выборка составила 250 образцов из 7 точек сбора в Курортном районе г. Санкт-Петербурга и в Ленинградской области по обоим берегам восточной части Финского залива (рис. 1), максимальное расстояние между которыми составило 80 км. Для каждой из них было произведено выделение ДНК не менее чем из 8 образцов. Список образцов, географические координаты точек сбора, шифры проб в генетическом анализе и их номера в Genbank приведены в табл. 1. Помимо оригинального материала в работе использовано 314 последовательностей COI A. arbustorum из Genbank. Выделение ДНК, амплификация, секвенирование ДНК выделяли из ножной мышцы улиток по стандартной методике СТАБ [11]. В качестве молекулярного маркера использовали традиционный в подобных исследованиях фрагмент митохондриального гена цитохромоксидазы I (COI). Амплификацию проводили с использованием универсальных праймеров, разработанных для получения фрагмента гена СOI беспозвоночных животных [13], по следующей программе: 2 мин начальная денатурация при 94 °С, 35 циклов: 95 °С - 30 с, 54 °С - 30 с, 72 °С - 1 мин, окончательная элонгация - 10 мин при 72 °С. Все серии ПЦР включали в себя отрицательный контроль, который содержал все компоненты реакции за исключением пробы ДНК. Визуальный контроль продуктов амплификации проводили в 1,5 %-м агарозном геле. Для подготовки образцов к секвенированию производили очистку с помощью раствора полиэтиленгликоля (PEG) 30/33 с последующим осаждением ДНК 70 % этанолом [3]. Автоматическое секвенирование проб проводили на секвенаторе ABI 3130 Avant с использованием ABI PRISM®BigDyeTM Terminator v. 3.1 в компании «Бигль» (http://www.biobeagle.com/). Филогенетический и популяционно-генетический анализы Выравнивание последовательностей проводили при помощи модуля ClustalW [22] в программном пакете BioEdit 7.0 [17] с последующей проверкой и редактированием вручную. Максимальная выборка последовательностей, использованных в анализе СОI, составила 361 образец (47 оригинальных последовательностей и 314 из Genbank) из 117 точек. Для построения филогенетического дерева использовали последовательности 156 уникальных гаплотипов. Реконструкции филогении на основе метода максимального правдоподобия (ML) предваряли определением оптимальной модели эволюции последовательности для каждой позиции кодона с помощью программы jModeltest 2.1.1 [9] с использованием информационных критериев Акаике (AIK) и Байеса (BIC). Частота замен и переходов определялась эмпирически. В качестве лучшей определена модель TPM3uf + I + G со значением gamma = = 0,2830. Филогенетический анализ проводили с учетом данной модели в программе PHYML. Поддержку клад оценивали с помощью бутстрэп - анализа на основе 500 псевдореплик. Взаимосвязь отдельных гаплотипов выявляли с использованием метода медианных сетей в программе NETWORK, v. 4.6.1.3. Расчет расстояний между гаплотипами проводили методом среднего присоединения (median joining). Для популяций, в которых количество особей было более 5, рассчитывали следующие параметры генетической изменчивости: количество гаплотипов, количество вариабельных и информативных сайтов, гаплотипическое и нуклеотидное разнообразие. Для проверки гипотезы отклонения наблюдаемой изменчивости ДНК от модели нейтральной эволюции использовали тесты F*, D*, D [14, 15, 29] в программе DNASP 5.10 [25]. Коэффициент D Таджимы учитывает разницу между ожидаемой величиной средних значений различий между последовательностями в выборке и количеством вариабельных сайтов и наблюдаемой величиной. Отрицательные значения коэффициентов D Таджимы указывают либо на недавний экспансивный рост популяции, либо на очищающий (purifying) отбор, снижающий вариабельность. Достоверные положительные значения могут указывать на недавнее прохождение популяцией через «горлышко бутылки», на резкое снижение численности или на балансирующий отбор по данному локусу в пользу конкретных гаплотипов. Статистические тесты D* of Fu и Li основаны на оценке разницы в количестве единичных замен и общем количестве замен (D*), тогда как коэффициент F* основан на различии между количеством единичных замен и средним значением попарных нуклеотидных различий между последовательностями. Так же как и в случае теста D Таджимы, позитивные значения этих коэффициентов говорят либо о снижении численности популяции после эффекта «горлышка бутылки», либо о балансирующем отборе [15]. Результаты и обсуждение Гаплотипическая и нуклеотидная изменчивость Длина окончательного выравнивания из 361 последовательности, включающего исследованные образцы и образцы, депонированные в Genbank ранее, составила 350 п. н., из них 145 вариабельных сайтов и 113 информативных. Общий набор последовательностей в выравнивании содержит 156 уникальных гаплотипов. В нашей выборке, включающей всех исследованных улиток по разным берегам Финского залива (выборка «Санкт-Петербург»), наблюдается крайне низкое нуклеотидное и гаплотипическое разнообразие (табл. 2). Низкие показатели гаплотипического разнообразия наблюдаются также и в выборке из Италии, но, в отличие от выборки «Санкт-Петербург», она характеризуется высоким нуклеотидным разнообразием. У всех исследованных популяций в Австрии наблюдается крайне высокое нуклеотидное разнообразие, для сравнения: на площади в 5 км2 в Альпах было обнаружено 119 гаплотипов [16], в то время как в нашем исследовании на площади почти в 100 км2 - только 4. Следовательно, для популяции из окрестностей Санкт-Петербурга характерен аномально низкий уровень генетической изменчивости. Следует также подчеркнуть, что гаплотипы, обнаруженные в районе Санкт-Петербурга, уникальны и в Западной Европе, по имеющимся на данный момент в Genbank данным, не встречаются. Это свидетельствует, скорее, в пользу модели инвазии по «эффекту плацдарма». Как правило, между периодом колонизации и экспансии наблюдается временная задержка, в течение которой инвазивные популяции вырабатывают определенные механизмы адаптации к новой среде, происходит так называемый «эволюционный сдвиг» (adaptive shift). Несмотря на то что концепция «плацдарма» достаточно новая в биологии инвазий, это потенциально очень широко распространенный феномен. Выявление таких популяций-плацдармов имеет большое практическое значение. При сценарии «плацдарма» «эволюционный сдвиг» происходит в одной популяции, когда источником инвазии является одна небольшая наиболее успешная популяция, которая довольно долго присутствовала в регионе [10]. Уникальные гаплотипы улиток из Ленинградской области как раз свидетельствуют о том, что они достаточно давно появились на данной территории, так что мутации смогли накопиться и зафиксироваться, но эффективная численность популяции все время была очень низкой и только в последнее время произошел экспансивный рост численности. О последнем свидетельствует очень низкое гаплотипическое и нуклеотидное разнообразие. В пользу такой модели говорят также и имеющиеся литературные данные, и наблюдения. Единичные находки этого вида отмечались в окрестностях Ленинграда в начале прошлого века, а также на островах и в прибрежных районах Эстонии, одна находка известна в Латвии [2], но экспансия этого вида на восток и на север Ленинградской области и в Карелию отмечена в самом конце ХХ в. и продолжается в настоящее время. Со сценарием инвазии по модели «плацдарма» хорошо согласуются и данные тестов на отклонение от модели нейтральности. Все коэффициенты тестов (табл. 2) для интересующей нас популяции из Ленинградской области имеют позитивные значения. Как правило, положительные коэффициенты теста Таджимы (D) принято трактовать в пользу либо балансирующего отбора, либо внезапного резкого сокращения численности («горлышко бутылки»). Другие тесты на нейтральность Fs, F* также показали не противоречащие тесту Таджимы положительные значения на пороге достоверности (см. табл. 2). Существенный недостаток этих тестов в том, что статистически нет критериев, позволяющих различить эффект отбора от демографических процессов при анализе только одного локуса. В нашем случае все имеющиеся наблюдения не поддерживают гипотезу резкого сокращения численности («горлышко бутылки»), а скорее говорят об обратном, в пользу экспансивного роста от небольшого числа основателей. Однако, согласно теоретическим расчетам, в случае экспансивного роста при условии нейтральной модели следует ожидать отрицательных значений тестов вследствие избытка редких гаплотипов [14, 15, 29]. Достоверные отрицательные значения тестов на нейтральность характерны для популяции из Австрии, что однозначно указывает на экспансивный рост популяции, в пользу такого объяснения свидетельствует и четко выраженная звездчатая структура медианной сети для этой популяции (рис. 3). Таким образом, несмотря на предварительный характер наших результатов и необходимость дальнейшего тестирования по другим локусам, они косвенно могут свидетельствовать в пользу адаптивного сдвига. Характер медианной сети гаплотипов (см. рис. 3) также скорее свидетельствует в пользу балансирующего отбора. Все вышеизложенные факты хорошо согласуются со сценарием инвазии по типу «плацдарма». Филогенетический анализ На дереве (рис. 2) выявляется 9 крупных клад, каждая из которых далее делится на более мелкие кластеры. Большая часть клад имеет статистическую поддержку (бутстреп-значения больше 65). В большинстве из них присутствуют гаплотипы из Австрии, что, с одной стороны, свидетельствует об очень сильном генетическом полиморфизме популяций в Австрии, с другой - о недостаточной изученности материала в остальных странах, из которых в Genbank представлены лишь единичные последовательности. Последовательности образцов из России образуют одну общую кладу, в которую также попадает и гаплотип из Дании. Достаточно близок к этой группе один из австрийских гаплотипов. Совместная клада России, Дании и Австрии на филогенетическом дереве может косвенно указывать на возможный путь заселения улиткой России с помощью водного транспорта через Данию. Прояснить эти вопросы помогут более подробные исследования, включая сбор и дальнейший анализ образцов из Дании и Прибалтики для уточнения путей и источников инвазии. Анализ сети гаплотипов На медианной сети (рис. 3, a), в отличие от филогенетического дерева, можно проследить взаиморасположение и количественное распределение гаплотипов. В этот анализ включен весь набор последовательностей (361). В Австрии можно выделить по меньшей мере три крупные самостоятельные группы гаплотипов, генетически сильно различающиеся (более 40 нуклеотидных замен), в состав каждой из которых входит несколько популяций. Две из этих групп имеют четкую звездообразную структуру. Образцы из Германии, входящие в состав одной популяции, оказываются в значительной степени удалены друг от друга на медианной сети. Ту же самую картину мы наблюдаем и для образцов из Франции и Нидерландов. Уже отмеченное крайне низкое генетическое разнообразие выборки из России подтверждается и графически, на сети она образует единую плотную группу. Рядом с этой группой располагается только гаплотип из Дании, а все остальные образцы находятся на значительном расстоянии, наглядно демонстрируя, что гаплотипы, обнаруженные в Ленинградской области, уникальны. Отдельно проанализировав выборку из России и построив сеть только для них (рис. 3, b), мы выявили разбиение четырех гаплотипов на две группы: H2 и H4, H1 и H3. Различие внутри групп при этом составляет одну нуклеотидную замену. Такой паттерн сети, так же как и тесты на нейтральность, говорит о балансирующем отборе. Одним из основных результатов молекулярно-генетических исследований источников и путей инвазии на примерах целого ряда видов стало понимание того, что множественные интродукции - самое обычное явление, и это в какой-то мере объясняет, каким образом популяции инвазивного чужеродного вида преодолевают описанный «генетический парадокс». В итоге такие инвазивные популяции по уровню генетической изменчивости могут оказаться сравнимыми или даже превышать таковой в исходных популяциях (подобные факты описаны для целого ряда видов растений и животных [7, 8, 18, 20, 21, 26]. Подобные исследования, проведенные на 29 инвазивных наземных и водных животных, показали, что в интродуцированных популяциях сохраняется и поддерживается в среднем до 80 % от генетической изменчивости, наблюдаемой в исходных условиях [6]. В случае древесной улитки, однако, феномен «генетического парадокса» проявляется очень явственно. В то же время, как было показано, даже в случае сильного «бутылочного горлышка», инвазии могут приводить к быстрым адаптивным изменениям [12, 19], примиряя наблюдаемую низкую генетическую изменчивость с феноменом высокой численности инвазивной популяции.

About the authors

Olga V Bondareva

ZIN RAS

Email: olga.v.bondareva@gmail.com
Trainee, Laboratory of molecular systematic

Marina I Orlova

ZIN RAS

Email: marina.orlova2012@gmail.com
Sc.D., Leading Researcher, Laboratory of Freshwater and Experimental Hydrobiology

Natalja I Abramson

ZIN RAS

Email: natalia_abr@mail.ru
Ph.d., head, Laboratory of molecular systematic. ZIN RAS. Leading researcher

References

Supplementary files