Microspatial structure of population gene pool in the land snail Helicopsis striata (Pulmonata, Hygromiidae) in conditions of the Southern Mid-Russian Upland

Full Text

Введение Пространственная генетическая дифференциация является важным маркером состояния природных популяций в изменчивых условиях среды [21]. Так, с увеличением биотопического разнообразия в популяции формируются устойчивые в пространстве и времени внутрипопуляционные группировки (демы, или субпопуляции), каждая из которых адаптируется к локальным условиям [3, 4, 14]. Это значительно увеличивает жизнеспособность популяции и способствует ее дальнейшему выживанию. При этом ключевым моментом в формировании структуры можно считать появление генетической обособленности демов, что является прямым следствием нарушения панмиксии и приводит к временной стабилизации внутрипопуляционной структуры. Высокоагрегированный тип пространственной структуры и низкая миграционная активность делают наземных моллюсков хорошими модельными объектами при исследовании внутрипопуляционной структурированности [6]. В настоящее время известны исследования микропространственной генетической структуры на примере таких моллюсков, как Trochoidea geyeri (Soos, 1926) по RAPD-маркерам [23], Pomatias elegans (Müller, 1774) по изоферментам [22], Helix aspersa (Müller, 1774) по изоферментам и микросателлитам [16, 17, 24], Brephulopsis bidens (Krynicky, 1883) по изменчивости конхиологических признаков [5, 19] и др. Тем не менее многие вопросы генетической структурированности популяций наземных моллюсков остаются открытыми. В частности, одним из наиболее актуальных направлений является оценка дифференциации популяционных генофондов редких и уязвимых видов моллюсков, которая может стать важной частью работ по сохранению и восстановлению их популяций. В этом отношении особого внимания заслуживают популяции ксерофильного моллюска Helicopsis striata, обитающего в условиях пересеченного ландшафта юга Среднерусской возвышенности и охраняемого на территории Белгородской области России [13]. Цель исследования: провести анализ микропространственной дифференциации генетической структуры популяций H. striata, обитающих в гетерогенных условиях юга Среднерусской возвышенности. Материалы и методы Исследование внутрипопуляционной дифференциации генофонда H. striata проводили в осенние периоды 2011 и 2012 гг. Для этого на территории юга Среднерусской возвышенности было выбрано шесть модельных популяций (рис. 1), приуроченных к биотопам с разными ландшафтно-климатическими условиями (табл. 1). В каждой популяции H. striata на равном удалении через 150-200 м было заложено по пять экспериментальных площадок площадью 25 м2 каждая, в пределах которых осуществляли сбор особей. В связи с относительно большим расстоянием между точками сбора полагали, что каждая площадка соответствует отдельному дему. Таким образом, было исследовано 30 демов из 6 популяций H. striata. Экстракцию изоферментов проводили из ноги моллюска. Далее проводили диск-электрофорез изоферментов в 10 %-м полиакриламидном геле (камера VE-3, Helicon). Окрашивание блоков на выявление неспецифических эстераз осуществляли в субстратной смеси: трис-HCl (рH = 7,4), α-нафтилацетат, прочный красный TR; для выявления супероксиддисмутаз - калий-фосфатный буфер (рH = 7,8), НТС, ФМС. Необходимо отметить, что со времени первых публикаций по генетике H. striata [10, 12] нами были получены новые данные по изменчивости генофондов популяций этого моллюска и характере аллельного разнообразия локусов аллозимов. Так, в ранее используемом локусе EST5 (неспецифические эстеразы) нами обнаружен пятый аллель, который не имеет ферментативной активности (так называемый 0-аллель), в связи с чем гомозиготы по нему не проявляются на гелевом блоке, а гетерозиготы представлены лишь одной полосой по активному аллелю (рис. 2). Кроме того, 0-аллель (также пятый по счету) обнаружен и в локусе EST6. Причем зафиксирован он был только в популяции «Белая гора». В случае если в популяции по какому-либо локусу фиксировался 0-аллель, определение гетерозигот и гомозигот по проявляющемуся аллелю мы проводили по степени его активности относительно других особей. При этом мы исходили из принципа, что гомозиготы на электрофореграммах проявляются более интенсивно по сравнению с гетерозиготами, поскольку концентрация фермента у них более высокая. Таким образом, в качестве генетических маркеров популяционной структуры H. striata использовали четыре локуса неспецифических мономерных эстераз (EST5 с пятью аллелями, EST6 с пятью аллелями, EST7 с двумя аллелями, EST8 с тремя аллелями) и два локуса супероксиддисмутазы (SOD2-димер с двумя аллелями и SOD7-мономер с тремя аллелями) (рис. 3). Наследование всех аллелей осуществлялось по кодоминантному типу. Выделение ДНК проводили с использованием протеиназы К с дальнейшей очисткой смесью хлороформ - изопентанол [12, 20]. В качестве ДНК-маркеров задействованы ISSR-ампликоны по праймеру UBC811 (5’-[GA]8C-3’). Объем ПЦР-смеси составлял 20 мкл, содержащей 20 нг геномной ДНК, 10 мМ трис-HCl (pH = 8,3), 50 мМ KCl, 4 мМ MgCl2, 0,25 мМ dNTP, 0,5 мкМ праймера, 1 единицу Taq ДНК-полимеразы. Реакция проходила на амплификаторе MyCycler (BioRad, США) в следующих условиях: «горячий старт» - 2 мин/94 °C, 40 циклов (денатурация - 30 с/94 °C, отжиг праймера - 30 с/55 °C, синтез - 2 мин/72 °C), дополнительный синтез - 10 мин/72 °C. Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 2 %-м агарозном геле с использованием ТАЕ-буфера, 100 В - 45 мин. Блоки окрашивали бромистым этидием. По картинам электрофореза составляли бинарные матрицы, где присутствие полосы обозначалось как «1» (аллель p), отсутствие «0» (аллель q). Ранее у H. striata было выделено 17 локусов с использованием праймеров UBC811. Полученные ДНК-паттерны и их расшифровка приведены в публикации Э.А. Снегина [11]. Всего по аллозимам определены генотипы у 757 особей, а по ISSR-локусам - у 701 особи H. striata. Математическая обработка полученных данных проводилась с помощью пакета программ Excel (Microsoft Office), GenAlEx v.6.5 [21] и F-stat [18]. Полигоны Дебеца были построены в программе Statistica 6.0. Результаты и их обсуждение Полигоны Дебеца, построенные на основании частот аллелей исследованных изоферментных локусов, приведены на рис. 4. Исходя из полученных данных, для популяций «Осадчее» и «Губкин» в силу отсутствия изменчивости по всем исследованным локусам изоферментов не представляется возможным оценить уровень внутрипопуляционной структурированности. В остальных популяциях наблюдается разная степень генетической дифференциации демов по частотам аллелей. Например, в популяции «Белая гора» частота первого аллеля EST7-1 в первом деме составляет 0,731, а уже в пятом деме по нему наблюдается стопроцентная гомозиготность. По аллелю SOD2-2 отмечаются еще более выраженные изменения между демами этой популяции: в первой субпопуляции этот аллель не обнаружен, в то время как в пятом деме его частота составила 0,430. Столь значительные изменения частот аллелей в пределах одной популяции наблюдаются и по другим локусам, а также в других исследованных популяциях моллюска. При этом во многих локусах зафиксирована клинальная или синусоидальная (сначала плавно увеличивается/уменьшается, затем плавно уменьшается/увеличивается) изменчивость частот аллелей в популяциях (рис. 5). Полученные данные могут свидетельствовать о низком уровне потока генов в пределах локальных популяций. Доля полиморфных локусов (p) в демах популяций также оказалась не постоянной. Так, в популяции «Верхние Лубянки» p варьирует от 33,3 % (дем № 4) до 66,7 % (демы № 1 и 3). Как и по частотам аллелей, по показателям генетической изменчивости отдельных изоферментных локусов между демами наблюдаются значительные отличия. Однако по средним значениям остальных показателей генетической изменчивости (за исключением коэффициента инбридинга F), рассчитанных по всем локусам, достоверных отличий между демами в популяциях нами не обнаружено (табл. 2). То есть на протяжении своего ареала каждая из изученных популяций имеет сходный уровень генетического разнообразия, что указывает на пространственную стабильность популяционных генофондов H. striata. Полигоны Дебеца, построенные по частотам q-аллеля семнадцати ISSR-локусов в демах популяций H. striata, представлены на рис. 4. Полученные данные коррелируют с изменчивостью аллозимов. Так, наиболее богатыми генофондами обладают популяции H. striata из бассейна р. Северский Донец - «Белая гора» и «Беленихино», а наиболее бедными - «Осадчее» и «Губкин». Так же как и по аллозимам, даже между соседними демами в популяциях наблюдаются значительные различия частот ДНК-аллелей. В результате полигоны Дебеца, построенные по частотам q-аллеля, часто отличаются даже у соседних демов одной популяции. Тем не менее общая топография генетической изменчивости в разных участках ареала популяций остается схожей. Так, средние значения показателей генетической изменчивости, вычисленные на основе ISSR-локусов в пределах популяций между демами, достоверно не отличаются, что подтверждает данные, полученные по аллозимам, о пространственной стабильности внутрипопуляционной генетической изменчивости (табл. 3). Далее на основании анализа частот аллелей изоферментных локусов в исследованных популяциях нами проведен расчет коэффициентов инбридинга на разном уровне популяционной иерархии - Fis, Fit, Fst, а также показателя подразделенности Фst (метод AMOVA). Выяснилось, что исследованные изоферментные локусы вносят различный вклад в подразделенность популяций. Так, в популяции «Беленихино» Fst, отражающий уровень дифференциации популяции, по локусу SOD2 оказался равным 0,024, а по локусу EST5 - 0,204, т. е. почти в девять раз выше. Кроме того, одни и те же локусы вносят разный вклад в структурированность разных популяций. Например, Fst по локусу EST5 в разных популяциях принимает значения от 0,105 в популяции «Белая гора» до 0,260 в популяции «Верхние Лубянки». Вероятно, это объясняется разнонаправленностью векторов отбора и генетико-автоматических процессов как в разных локусах, так и в разных популяциях H. striata. Расчет средних значений индексов инбридинга Fst и Fit в большинстве популяций выявил дефицит гетерозигот по анализируемым локусам (табл. 4). Это может свидетельствовать в пользу низкого потока генов в популяциях H. striata и формирования в них оригинальных внутрипопуляционных группировок. А расчет среднего значения индексов Fst и Фst (табл. 5) подтверждает эти выводы. Исследованные популяции имеют разную степень генетической разобщенности между демами. Как оказалось, наибольшей генетической структурированностью обладают популяции «Верхние Лубянки» и «Засосна», обитающие в степной природной зоне. При этом степень фрагментации биотопа популяции «Засосна» значительно ниже, чем у генетически менее структурированной популяции «Беленихино», что говорит о разной степени миграционной активности особей (активной и пассивной) H. striata в разных популяциях. Значения индекса Фst, рассчитанного по ISSR-локусам (табл. 6), показывают, что наиболее подразделенным является генофонд популяции «Верхние Лубянки», а наименее - популяции «Белая гора»[1]. В целом по ISSR-локусам исследованные популяции имеют более низкое значение Фst, чем по аллозимам. Вероятно, это вызвано тем, что ISSR-локусы в основном характеризуют селективно нейтральную часть генома и в большей степени отражают генетико-автоматические процессы в исследованных популяциях. В данном аспекте стоит отметить уровень дифференциации генофонда популяции «Губкин», мономорфной по локусам изоферментов. Изменчивость этой популяции по ДНК-маркерам также оказалась сравнительно низкой (полиморфными являются всего 11,76 % локусов). Однако отмечаются достаточно существенные различия между демами (Фst = = 0,206) (см. табл. 6). Стоит также отметить, что уровень подразделенности отдельных популяций (Fst ≤ 0,245 ± 0,056) по сравнению с полученным нами ранее значением Fst для H. striata всего юга Среднерусской возвышенности как генеральной совокупности (Fst = 0,503 ± 0,101) предсказуемо ниже, поскольку генофонд отдельной популяции включает только часть генофонда всех популяций моллюска из района исследования. Тем не менее дифференциация генофондов локальных популяций H. striata выше, чем у многих других видов наземных улиток. Так, у мезофильного моллюска Bradybaena fruticum для всего юга Среднерусской возвышенности Fst составил 0,135 [9], а у ксерофильных видов Chondrula tridens и Cepaea vindobonensis - 0,164 и 0,173 соответственно [7, 8]. Таким образом, среди улиток, обитающих на юге Среднерусской возвышенности, H. striata характеризуется одним из самых низких уровней потока генов. Полагаем, что это связано с особенностями биологии данного вида. Так, H. striata является стенобионтным видом, распространенным по хорошо прогреваемым луговым или степным склоновым биотопам [10, 12, 13]. А фоновые виды моллюсков, взятые для соспоставления, являются эврибионтными мезофилами или факультативными ксерофилами, обитающими как в сухих, так и в увлажненных биотопах [12]. Известно, что улитки активны и способны совершать миграции только во влажные периоды времени [15]. А поскольку в сухих местообитаниях таких периодов значительно меньше, чем увлажненных, то и общее время для совершения миграций у H. striata меньше, чем у эврибионтных или мезофильных видов улиток. Кроме того, по сравнению с некоторыми другими видами ксерофилов во время засух H. striata закапывается в почву, в связи с чем становится практически недоступен для пассивного переноса [1]. Низкий поток генов, а также превышение его внутригрупповой компоненты над межгрупповой приводят к формированию оригинальных структурированных популяционных генофондов, каждый из которых адаптируется к локальным условиям среды [2]. Видимо, такая организация генетической структуры позволяет H. striata наиболее эффективно адаптироваться к условиям пересеченного ландшафта Среднерусской возвышенности с множеством разнообразных микроусловий. Однако чрезмерная специализация популяций сопровождается снижением их генетической изменчивости и может привести к потере адаптационной пластичности с последующим вымиранием в случае изменения условий среды. Что наиболее актуально для таких популяций моллюска, как «Осадчее» и «Губкин»? Особо стоит отметить, что значительная фрагментация ландшафта не является обязательным условием пространственной дифференциации популяционных генофондов на оригинальные генофонды демов. Так, популяция «Засосна» обитает в относительно однотипном биотопе без значимых физических барьеров (см. табл. 1). Тем не менее как по изоферментам, так и по ДНК она имеет высокие значения Фst. По-видимому, это связано с особенностями биологии моллюсков, в частности их малоподвижностью и приуроченностью к локальным микронишам, в связи с чем географическое расстояние само по себе является изолирующим фактором. Выводы Таким образом, на территории юга Среднерусской возвышенности H. striata характеризуется разной степенью пространственной дифференциации популяционных генофондов. При этом важную роль в формировании генетической структуры играет не столько уровень разнообразия условий среды, сколько степень миграционной активности особей, которая оказалась наиболее высокой в популяциях бассейна р. Северский Донец. В то же время популяции из степной зоны и Верхнего Поосколья с самым низким потоком генов имеют более изолированные генофонды и, вероятно, характеризуются более высокими темпами снижения генетического разнообразия вследствие большей активности случайных процессов. Полагаем, что хозяйственное использование местообитаний этих групп может вызвать дальнейшее обеднение их генофонда и, как следствие, вымирание. По сравнению с другими исследованными видами наземных моллюсков юга Среднерусской возвышенности H. striata отличается наиболее низким уровнем потока генов. Это объясняется стенобионтностью данного моллюска и его меньшей способностью к активной и пассивной миграциям. Кроме того, по нашим данным, для получения более объективной картины состояния популяционных генофондов, необходимо учитывать характер внутрипопуляционной пространственной дифференциации, поскольку в некоторых случаях выборки из отдельных демов высокодифференцированной популяции могут не отражать ее общего состояния.

About the authors

Anton A Sychev

Belgorod national research university

Email: syvuch20@yandex.ru
postgraduate, Department of Ecology, Physiology and Evolutionary Biology

Eduard A Snegin

Belgorod national research university

Email: snegin@bsu.edu.ru
Dr. Biol. Sci., senior lecturer, Department of Ecology, Physiology and Evolutionary Biology

References

Supplementary files