Synthesis of the matrix metalloproteinases and its inhibitors by peripheral blood phagocytes of women with hypertansion disorders
- Authors: Panova I.A.1, Malyshkina A.I.1, Kudryashova A.V.1, Khlipunova D.A.1, Rockatanskaya E.A.1, Sytova L.A.1
-
Affiliations:
- Ivanovo research Institute of maternity and childhood
- Issue: Vol 64, No 3 (2015)
- Pages: 26-32
- Section: Articles
- URL: https://journals.eco-vector.com/jowd/article/view/1248
- DOI: https://doi.org/10.17816/JOWD64326-32
- ID: 1248
Cite item
Full Text
Abstract
Full Text
Введение Многие десятилетия гипертензивные расстройства у беременных остаются актуальной проблемой в акушерстве, поскольку являются одной из основных причин заболеваемости и смертности матери, плода и новорожденных. Несмотря на особое внимание к проблеме патофизиологии гипертензии беременных во всем мире, в настоящее время вопросы механизмов развития данной патологии остаются спорными. Результатами последних исследований доказано, что в развитии гипертензии у беременных существует несколько этиологических факторов: неполноценная инвазия трофобласта и трансформации спиральных артерий, плацентарная ишемия, оксидантный стресс, генетическая предрасположенность [1], а также иммунологическая дезадаптация к новому для организма физиологическому состоянию [6]. При беременности, осложнившейся преэклампсией, отмечается дисбаланс функциональной активности гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов, продукции про- и противовоспалительных цитокинов, активация системы комплемента [2, 3]. Эти изменения отражают формирование системного воспалительного ответа, частью которого при артериальной гипертензии у беременных является эндотелиальная дисфункция. Ее развитие сопровождается усилением сосудистой проницаемости, вследствие повышения экспрессии эндотелиоцитами молекул адгезии и усиленной продукции матриксных металлопротеиназ (ММР) [4]. Ранее нами было показано, что у женщин с гипертензивными нарушениями усиливаются адгезионные свойства циркулирующих нейтрофилов, определяющиеся повышенной экспрессией молекул CD49b, CD31 и CD56, и данные изменения наиболее выражены у беременных с преэклампсией [5, 7]. Исследование синтеза и продукции лейкоцитами ММР и их тканевых ингибиторов (TIMP) представляет особый интерес, так как именно эти молекулы обеспечивают протеолиз компонентов внеклеточного матрикса, облегчая миграцию клеток и их прохождение через базальную мембрану сосуда [19]. Повышение уровня MMP-9 в сыворотке крови у женщин с гипертензивными расстройствами при беременности отмечалось исследователями неоднократно [8, 9, 18]. Кроме того, повышенный уровень ММР-9 в плазме крови отмечался и у больных с эссенциальной гипертензией [9]. Наряду с этим, у женщин с гипертензивными расстройствами при беременности отмечался сниженный уровень TIMP-1 и TIMP-2 по сравнению с показателями женщин без акушерской патологии [8]. Особый интерес, по нашему мнению, представляет изучение продукции MMP и TIMP клетками врожденного иммунитета у беременных с гипертензией. В этом случае нам предоставляется возможность оценить протеолитическую активность моноцитов и нейтрофилов, способствующую их экстравазации с развитием локальной воспалительной реакции. Цель исследования: выявить особенности синтеза моноцитами и нейтрофилами матриксных металлопротеиназ (ММР-2, ММР-9) и их ингибиторов (TIMP-1, TIMP-2) у женщин с различными формами гипертензивных расстройств при беременности. Методика Обследовано 68 беременных женщин в 24-37 недель беременности. Из них: контрольная группа - 20 женщин с неосложненным течением гестации, первая группа - 22 беременные женщины с преэклампсией, вторая группа - 14 женщин с хронической артериальной гипертензией, третья группа - 12 беременных с хронической артериальной гипертензией и присоединившейся преэклампсией. Все группы обследованных были сопоставимы по паритету и социальному статусу. Средний возраст женщин с ХАГ (32,51 ± 0,61 лет) и с ХАГ с присоединившейся ПЭ (31,73 ± 0,72 лет) оказался достоверно выше, чем в группе женщин с ПЭ (28,82 ± 0,63 лет) и в контрольной группе (27,36 ± 0,60 лет) (р < 0,05 во всех случаях). Отягощенная наследственность по сердечно-сосудистым заболеваниям достоверно чаще отмечалась у всех беременных с гипертензивными нарушениями - у 30,1 % женщин в первой группе, у 70,2 % во второй группе, у 64,6 % в третьей группе, в контрольной группе - лишь у 12,5 % обследованных (р < 0,05 во всех случаях). Из экстрагенитальной патологии у беременных первой, второй и третьей групп по сравнению с группой контроля отмечена более высокая частота заболеваний мочевыводящих путей, желчевыводящих путей и ожирения (р < 0,05 во всех случаях). Заболевания щитовидной железы чаще имели женщины с ХАГ по сравнению с первой группой и группой контроля (р = 0,001 в обоих случаях). Нарушение менструальной функции в анамнезе также чаще отмечалось у женщин второй и третьей групп по сравнению с первой и контрольной группами (р < 0,05 во всех случаях). Среди осложнений настоящей беременности у всех женщин с гипертензивными расстройствами достоверно чаще относительно группы контроля отмечались острые или обострение хронических заболеваний мочевыводящих путей (р < 0,05 во всех случаях). Фетоплацентарная недостаточность диагностировалась у 86,8 % беременных первой и у 86,2 % второй групп, что было достоверно чаще, чем у женщин второй (42,4 %) и контрольной (8,1 %) групп (р < 0,05 во всех случаях). Частота преждевременных родов была наибольшей у обследованных с ПЭ и ПЭ на фоне ХАГ в сравнении с женщинами с ХАГ и контрольной группой (р < 0,05 во всех случаях). Средний гестационный срок на момент родоразрешения у женщин первой группы составил 33,16 ± 0,34 недели, у женщин второй группы - 37,45 ± 0,25 недели, у обследованных третьей группы - 33,14 ± 0,43 недели. У всех женщин контрольной группы роды были своевременными (в 39,02 ± 0,13 недели) (р < 0,05 во всех случаях). Новорожденные женщин первой и третьей групп по тяжести состояния при рождении чаще находились в отделении детской реанимации в отличие от женщин второй и контрольной групп и имели меньшие массо-ростовые показатели (р < 0,05 во всех случаях). Асфиксия, задержка внутриутробного развития и гипоксически-ишемические поражения центральной нервной системы так же чаще встречались у детей женщин первой и третей групп по сравнению со второй и контрольной группами (р < 0,05 во всех случаях). Материалом для исследования являлась периферическая венозная кровь. Выделение клеток осуществлялось в двойном градиенте плотности фиколл-урографина (d-1,078 и d-1,114). В интерфазе между фиколл-урографином плотностью d-1,078 и d-1,114 собирались нейтрофилы. В интерфазе среда 199 - фиколл-урографин d-1,078 собирали кольцо клеток, содержащее лимфоциты и моноциты. Чистую фракцию моноцитов отделяли методом позитивной магнитной сепарации с использованием Dynabeads CD14 (Invitrogen, Норвегия). Процедуру выделения тотальной РНК из моноцитов и нейтрофилов проводили стандартным гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформ методом с использованием набора реагентов «Онкоскрин» ООО «ГеноТехнология» (Россия). Количественное определение экспрессии мРНК MMP-2, MMP-9, TIMP-1 и TIMP-2 моноцитами и нейтрофилами периферической крови осуществляли методом полимеразной цепной реакции в масштабе реального времени (RT-PCR) с помощью коммерческих наборов ферментов, праймеров, зондов и стандартов производства ООО «Синтол» (Москва, Россия) на амплификаторе с оптической насадкой iCycler iQ (BIO-RAD Laboratories, США). Количество определенных копий пар нуклеотидов специфического гена делили на количество копий пар β2-микроглобулина для получения нормализованного значения экспрессии гена. Результаты представлены как нормализованное значение специфического гена ×103/мкл для всех изученных генов. Математическая обработка полученных результатов исследования проводилась по общепринятым методам вариационной статистики после проверки рядов данных на нормальность распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка. Достоверность различий между показателями независимых выборок оценивалась по t-критерию (Стьюдента) и непараметрическому критерию U (Манна-Уитни). Статистический анализ осуществляли в пакете прикладных лицензионных программ «Microsoft Office 2010» и «Statistica for Windows 6.0». Результаты исследования Проведенные нами исследования показали, что в контрольной группе практически отсутствовал синтез ММР-2 моноцитами, в то время как при всех формах гестационных гипертензивных расстройств отмечался невысокий уровень продукции ММР-2 моноцитами. Так у женщин первой группы уровень мРНК ММР-2 составил 0,09 ± 0,06 копий пар/мл ×104, второй группы - 2,28 ± 1,95 копий пар/мл ×104, третьей группы - 0,17 ± 0,12 копий пар/мл ×104. Уровень продукции ММР-2 нейтрофилами был сопоставим во всех сравниваемых группах и не имел достоверно значимых различий, однако при неосложненном течении беременности синтез ММР-2 нейтрофилами отмечался в 80 % случаев (2,99 ± 1,02 копий пар/мл ×104), при ПЭ - у 54 % (7,21 ± 4,80 копий пар/мл ×104), при ХАГ - у 50 % (2,30 ± 1,88 копий пар/мл ×104), при ХАГ с ПЭ - у 57 % обследованных (10,95 ± 10,83 копий пар/мл ×104) (р > 0,05 во всех случаях). Анализ изменений синтеза ММР-9 и ингибиторов матриксных протеиназ нейтрофилами в исследуемых группах женщин показал, что при ПЭ по сравнению с контрольной группой отсутствовали достоверные отличия в уровне синтеза мРНК ММР-9, TIMP-1 и TIMP-2 (р>0,05 во всех случаях), однако отмечена выраженная тенденция к усилению синтеза мРНК ММР-9 (рис. 1). В популяции моноцитов у женщин с ПЭ выявлено достоверное повышение экспрессии мРНК TIMP-1 и TIMP-2 в отличие от группы контроля (р = 0,03 и р = 0,01 соответственно), изменений в интенсивности синтеза мРНК ММР-9 при ПЭ нами не выявлено (р > 0,05) (рис. 2). Только при ХАГ по сравнению с показателем группы контроля отмечалось достоверное повышение уровня мРНК ММР-9 в популяции нейтрофилов (р = 0,04), а также повышение синтеза мРНК TIMP-1 и TIMP-2 в популяции моноцитов (р = 0,001, р = 0,01 соответственно) (рис. 1, рис. 2). Достоверных изменений в экспрессии мРНК TIMP-1 и TIMP-2 в популяции нейтрофилов и мРНК ММР-9 в популяции моноцитов у женщин с ХАГ нами выявлено не было (р > 0,05 во всех случаях). В группе женщин с ХАГ с присоединившейся ПЭ, так же как и у женщин первой группы, в популяции нейтрофилов достоверных отличий в уровне синтеза мРНК ММР-9, TIMP-1 и TIMP-2 по сравнению с группой контроля нам выявить не удалось (р > 0,05 во всех случаях) (рис. 1). В популяции моноцитов у данной группы женщин в отличие от контрольной группы выявлено достоверное повышение экспрессии мРНК TIMP-1 и TIMP-2 (р = 0,01 и р = 0,03 соответственно) при отсутствии достоверных изменений синтеза мРНК ММР-9 (р > 0,05) (рис. 2). Сравнение показателей в группах между собой показало, что у женщин с ПЭ относительно показателей женщин с ХАГ в популяции моноцитов был достоверно снижен уровень мРНК TIMP-2 (р = 0,01), а также имелись выраженные тенденции к снижению экспрессии мРНК TIMP-1 моноцитами и мРНК ММР-9 нейтрофилами (p > 0,05 в обоих случаях). Показатели экспрессии мРНК TIMP-1 и TIMP-2 нейтрофилами и мРНК ММР-9 моноцитами в группах женщин с ПЭ и женщин с ХАГ практически не различались (p > 0,05 во всех случаях). Исследуемые показатели в группе женщин с ХАГ с присоединившейся ПЭ отличались от соответствующих показателей в группе женщин с ПЭ только наличием выраженной тенденции к снижению уровня синтеза мРНК ММР-9 популяцией нейтрофилов (р > 0,05). Уровень синтеза мРНК TIMP-1, -2 нейтрофилами, а также мРНК ММР-9, TIMP-1, -2 моноцитами в данных группах значительно не различался (p > 0,05 во всех случаях). При ХАГ с присоединившейся ПЭ относительно показателей женщин с ХАГ были выявлены более низкий уровень мРНК ММР-9 в нейтрофилах (р = 0,03) и выраженная тенденция к снижению уровня мРНК TIMP-1 в популяции моноцитов (p > 0,05). Уровень экспрессии мРНК TIMP-1, -2 нейтрофилами, мРНК TIMP-2 и ММР-9 моноцитами у женщин с ХАГ и с ХАГ с ПЭ достоверно не различался (p > 0,05 во всех случаях). Обсуждение результатов Как показывает анализ данных литературы, в настоящее время нет единого мнения о значимости ММР и их ингибиторов в патогенезе гипертензивных расстройств при беременности. В ряде случаев при преэклампсии отмечалось усиление активности ММР-2 и ММР-9 [14, 16]. Другие исследователи отмечали высокие уровни про-ММР-9 и коэффициента про-ММР-9/TIMP-1, а также ассоциацию с полиморфизмом гена MMP-9 только у женщин с гестационной гипертензией, но не с преэклампсией [15]. Наряду с этим имеются работы, в которых достоверных различий в уровнях про-ММР-2 и ММР-2 между пациентами с гестационной гипертензией, с преэклампсией и беременными женщинами с нормальным артериальным давлением не отмечалось [11, 12]. Кроме того, некоторые исследования не показали статистической разницы в уровне TIMP-1 и TIMP-2 между женщинами с преэклампсией и без акушерской патологии [11]. Проведенное нами исследование не характеризует общий уровень активности ММР и их ингибиторов при гестационных гипертензивных расстройствах, но позволяет оценить протеолитическую активность основных участников воспалительной реакции - моноцитов и нейтрофилов. Как известно, пределы клеточной миграции во многом определяются плотностью структуры экстрацеллюлярного матрикса и способностью мигрирующих клеток к протеолизу его компонентов. Нами было установлено, что у женщин с различными формами гипертензивных расстройств при беременности отсутствовали достоверные различия в синтезе мРНК ММР-2, TIMP-1, TIMP-2 нейтрофилами по сравнению с показателями при неосложненной беременности, и только у беременных с ХАГ в периферической крови синтез ММР-9 нейтрофилами был повышен. Ранее проведенные нами исследования показали, что для нейтрофилов беременных с ХАГ, в отличие от женщин с преэклампсией, было характерно усиление экспрессии молекул, определяющих и ранние, и поздние этапы адгезии клеток к эндотелию [5, 7]. Подобное сочетание двух факторов, вероятно, способствует усилению трансмиграции нейтрофилов и последующему развитию воспалительной реакции в периваскулярном пространстве. При всех видах гипертензивных расстройств у беременных нами не было выявлено достоверных изменений в продукции ММР моноцитами. Более того, нами было установлено, что в данной популяции клеток усилен синтез их ингибиторов - TIMP-1 и TIMP-2. Однако в группах женщин с гипертензивными нарушениями отмечался слабый синтез ММР-2 моноцитами, который практически полностью отсутствовал в контрольной группе. В литературе имеются данные, что совместное культивирование моноцитов с клетками эндотелия в экспериментальных условиях вызывает усиление экспрессии ими ММР-2, -9, а так же TIMP-1, -2 с нарушением их баланса [13]. Возможно контактное взаимодействие, усиленное за счет экспрессии адгезионных молекул, определяет этот же механизм стимуляции синтеза ММР-2 моноцитами при гипертензии у беременных. Наряду с этим мы отмечали повышенный уровень продукции TIMP-1, следовательно, можно говорить о том, что при ХАГ и ПЭ существует строгий контроль над протеолитической активностью моноцитов. Суммируя эти данные с полученными нами ранее минимальными изменениями в экспрессии молекул адгезии моноцитами [3], можно предположить, что при беременности, осложненной ПЭ, активированные моноциты остаются циркулировать в кровяном русле, способствуя тем самым развитию системной воспалительной реакции. Полученные нами результаты свидетельствуют о важной роли ММР-9, продуцируемой нейтрофилами в развитии патологических реакций у беременных с ХАГ. Это хорошо согласуется с данными о его значимости в патогенезе эссенциальной гипертензии [9]. Как известно, участие ММР в развитии гипертензии обусловлено их влиянием на вазоактивные свойства и архитектонику стенок сосудов. Мощная протеолитическая активность ММР в отношении белков внеклеточного матрикса и способность ингибировать поступление Ca2+ из внеклеточного пространства внутрь клеток влияет на эндотелиоциты и миоциты сосудистой стенки, вызывая значительную вазодилятацию [17]. С другой стороны, являясь мембраносвязанным эндотелин-превращающим ферментом (ЕСЕ), MMP участвует в расщеплении большого эндотелина (Big-ЭТ) с образованием мощного вазоконстриктора эндотелина, а также в расщеплении моноцитарного хемотаксического белка-3, способствуя тем самым развитию вазоспазма [10]. Снижение активности вазорелаксирующих факторов объясняется расщеплением под действием ММР и инактивацией вазодилятирующих пептидов, связанных с геном кальцитонина [10]. Еще одним потенциальным механизмом формирования гипертензии может выступать непосредственное деструктивное воздействие ММР на белки компонентов внеклеточного матрикса и белки базальных мембран за счет разрушения коллагена-1, а также способность активировать хемотаксис лейкоцитов [8]. Все это способствует повышению сосудистой проницаемости и миграции активированных лейкоцитов в периваскулярное пространство, что еще больше усиливает явления эндотелиальной дисфункции и вазоспазма. В свою очередь, активированные нейтрофилы способствуют усилению продукцию ММР в эндотелиальных и гладкомышечных клетках сосудистой стенки, усугубляя тем самым механизмы развития гипертензии.About the authors
Irina Aleksandrovna Panova
Ivanovo research Institute of maternity and childhood
Email: ia_panova@mail.ru
MD, head of the department of obstrics and gynecology
Anna Ivanovna Malyshkina
Ivanovo research Institute of maternity and childhoodPh.D., Director
Anna Vladimirovna Kudryashova
Ivanovo research Institute of maternity and childhood
Email: niimid.immune@mail.ru
doctor of biological science, senior scientific worker department of clinical immunology
Daria Aleksandrovna Khlipunova
Ivanovo research Institute of maternity and childhood
Email: da_shutka_xa@mail.ru
graduate student
Elena Arkadyevna Rockatanskaya
Ivanovo research Institute of maternity and childhood
Email: rokotyanskaya.ea@mail.ru
cand. of medical sciences, scientific co-employees of the Department of obstetrics and gynecology
Lyudmila Alekseevna Sytova
Ivanovo research Institute of maternity and childhood
Email: niimid.immune@mail.ru
cand. of medical sciences, associate prof., Department of obstetrics and gynecology, neonatology, anesthesiology and critical care medicine
References
- Айламазян Э. К., Мозговая Е. В. Гестоз: теория и практика. М.: МЕДпресс-информ; 2008.
- Каспарова А. Э., Белоцерковцева Л. Д., Коваленко Л. В., Сус Л. А. Современные представления о патогенетических механизмах развития преэклампсии при беременности (обзор литературы). Вестник СурГУ. Медицина. 2011; 1 (7): 50-6.
- Кудряшова А. В., Панова И. А., Хлипунова Д. А., Смирнова Е. В. Продукция провоспалительных цитокинов и изменение экспрессии молекул адгезии у беременных с гипертензивными нарушениями. Цитокины и воспаление. 2014; 13 (1): 103.
- Лупач Н. М., Хлудеева Е. А., Потапов В. Н., Лукьянов П. А. Матриксные металлопротеиназы, оксидантный статус и дисфункция эндотелия у лиц с гиперхолестеринемией и у пациентов с различными формами ишемической болезни сердца. Тихоокеанский медицинский журнал. 2010; 4: 71-4.
- Панова И. А., Кудряшова А. В., Хлипунова Д. А., Смирнова Е. В., Рокотянская Е. А. Характеристика зрелости и адгезионной способности нейтрофилов при преэклампсии. Российский иммунологический журнал. 2014; 8 (17): 360-63.
- Посисеева Л. В., Сотникова Н. Ю., Панова И. А., Кудряшова А. В., Анциферова Ю. С., Кулида Л. В. Иммунные механизмы развития гестоза. Иваново; 2008.
- Хлипунова Д. А., Панова И. А., Кудряшова А. В. Попова И. Г. Экспрессия молекул межклеточной адгезии и эндотелиальная дисфункция у беременных женщин с гипертензивными нарушениями. Мать и Дитя в Кузбассе. 2014; 2: 123-26.
- Ab Hamid J., Mohtarrudin N., Osman M., Andi Asri A. A., Wan Hassan W. H., Aziz R. Matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitors of metalloproteinases 1 and 2 as potential biomarkers for gestational hypertension. Singapore Med Journal. 2012; 53 (10): 681-3.
- Derosa G., D'Angelo A., Ciccarelli L., Piccinni M. N., Pricolo F., Salvadeo S., Montagna L., Gravina A., Ferrari I., Galli S., Paniga S., Tinelli C., Cicero A. F. Matrix metalloproteinase-2, -9, and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in patients with hypertension. 2006; 13 (3): 227-31.
- Fernandez-Patron C., Radomski M. W., Davidge S. T. Vascular matrix metalloproteinase-2 cleaves big endothelin-1 yielding a novel vasoconstrictor. Circ Res. 1999; 85: 906-11.
- Galewska Z., Romanowicz L., Jaworski S., Bankowski E. Gelatinase matrix metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9 of the umbilical cord blood in preeclampsia. Clin Chem Lab Med. 2008; 46: 517-22.
- Lavee M., Goldman S., Daniel-Spiegel E., Shalev E. Matrix metalloproteinase-2 is elevated in midtrimester amniotic fluid prior to the development of preeclampsia. Reprod Biol Endocrinol. 2009; 7:85.
- Li Y. Q., Liu R., Xue J. H., Zhang Y., Gao D. F., Wu X. S., Wang C. X., Yang Y. B. Effects of monocyte-endothelium interactions on the expression of type IV collagenases in monocytes. Exp Ther Med. 2015; 9 (2): 527-32.
- Myers J. E., Merchant S. J., Macleod M., Mires G. J., Baker P. N., Davidge S. T. MMP-2 levels are elevated in the plasma of women who subsequently develop preeclampsia. Hypertens Pregnancy. 2005; 24: 103-15.
- Palei A. C., Sandrim V. C., Duarte G., Cavalli R. C., Gerlach R. F., Tanus-Santos J. E. Matrix metalloproteinase (MMP)-9 genotypes and haplotypes in preeclampsia and gestational hypertension. Clin Chim Acta. 2010; 411 (11-12): 874-7.
- Poon L. C., Nekrasova E., Anastassopoulos P., Livanos P., Nicolaides K. H. First-trimester maternal serum matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and adverse pregnancy outcome. Prenat Diagn. 2009; 29: 553-9.
- Raffetto J. D., Ross R. L., Khalil R. A. Matrix metalloproteinase-2 induced venous dilation via hyperpolarization and activation of K+ channels: Relevance to varicose vein formation. J. Vasc Surg. 2007; 45: 373-80.
- Tayebjee M. H., Karalis I., Nadar S. K., Beevers D. G., MacFadyen R. J., Lip G. Y. Circulating matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitors of metalloproteinases-1 and -2 levels in gestational hypertension. Journal of Hypertension. 2005; 18 (3): 325-9.
- Woodfin A., Voisin M. B. Recent developments and complexities in neutrophil transmigration. Nourshargh Curr Opin Hematol. 2010; 17 (1): 9-17.