CYP21A2 gene mutationsin the women with recurrent miscarriage

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Невынашивание беременности (НБ) — интегральный ответ женского организма на неблагополучие в состоянии здоровья беременной, патологию плода, повреждающие факторы окружающей среды и другие экстремальные внешние и внутренние факторы [2]. ПНБ — наличие в анамнезе у женщины трех и более самопроизвольных прерываний беременностей [14]. Известно, что большой вклад в развитие ПН вносят гормональные нарушения у пациенток [8]. Одним из распространенных гормональных нарушений является гиперандрогения, при которой повышается уровень мужских гормонов в организме женщины. В соответствии с причинами возникновения различают несколько видов данной патологии, одним из которых является надпочечниковая форма, связанная с рядом патологических состояний организма женщины. В отдельных случаях избыток андрогенов является следствием неадекватной стимуляции адренокортикотропным гормоном при опухолях передней доли гипофиза (болезнь Иценга-Кушинга). Другой причиной надпочечниковой гиперандрогении могут быть нарушения процессов биосинтеза тех или иных гормонов в самих надпочечниках, например, при врожденной гиперплазии коры надпочечников. Это заболевание является ведущим фактором НБ у 30 % женщин с гиперандрогенией [1]. Под ВГКН (адреногенитальным синдромом — АГС) подразумевается группа заболеваний, главной особенностью которых при тяжелых формах является увеличение коры надпочечников. В 90–95 % случаях ВГКН обусловлена дефицитом фермента 21-гидроксилазы (P450c21), При этом типе ВГКН нарушается превращение прогестерона в 11-дезоксикортикостерон и 17-ОН-прогестерона в 11-дезоксикортизол [12]. Разная степень активности фермента соответствует трем клиническим формам ВГКН: сольтеряющая форма, простая вирильная форма и неклассическая форма. Две первые формы часто объединяют в одну классическую форму. Их частота составляет от 1:11800 до 1:21800 в зависимости от популяции [17]. Неклассическая форма ВГКН встречается с частотой 1:1000 [17]. Для больных с данной формой характерно преждевременное половое созревание и ускоренный рост [11; 15]. Для женщин наблюдаются: воспаления сальных желез (акне), андрогенетичсекая аллопеция, гирсутизм, аменорея и ановуляция [15; 21]. Существенной проблемой при неклассической форме ВГКН является НБ [10; 9; 16]. Чрезмерная продукция андрогенов в организме женщины способствует высокой частоте невынашивания у беременных с неклассической формой. Андрогены нарушают цикличность гонадотропина, негативно влияют на ароматазу в клетках гранулезы яичника, нарушая, таким образом, фолликулогенез. Также андрогены влияют на развитие эндометрия матки, снижая его имплантационную способность [10]. Фермент 21-гидроксилаза кодируется геном CYP21A2 (CYP21, CYP21B), который локализован на коротком плече шестой хромосомы в локусе 21.3 (6p21.3), внутри района генов, кодирующих белки главного комплекса гистосовместимости (HLA) [5]. На расстоянии в 30000 п. о. от гена CYP21A2 картирован псевдоген CYP21A1P (CYP21A, CYP21P). Каждый из генов имеет протяженность 3400 п. о. и включает 10 экзонов [13]. Они гомологичны друг другу на 98 % в экзонах и на 96 % в некодирующих последовательностях. К настоящему моменту описано более 250 различных мутаций, нарушающих структуру гена CYP21A2 (http://www.cypalleles.ki.se/cyp21.htm). Основными причинами нарушений в гене CYP21A2 являются два типа рекомбинаций гена CYP21A2 с псевдогеном CYP21A1P: неравный кроссинговер и конверсия. Причина этих процессов заключается в большой схожести в последовательностях гена и псевдогена. В результате конверсии мутации из псевдогена CYP21A1P переходят на ген CYP21A2, что приводит впоследствии к полной или частичной потере ферментной активности 21-гидроксилазы [20]. Целью работы — определить спектр и частоты мутаций в гене CYP21A2 у женщин с ПНБ и проанализировать их ассоциацию с данной патологией. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Работа была выполнена на образцах ДНК, выделенных из лейкоцитов периферической крови. Выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови проводили в соответствии с методикой, приведенной в руководстве Сэмбрука [18] с некоторыми модификациями. В основную группу вошли 112 пациенток с диагнозом ПНБ, проходящих лечение в СПбГПМА (Санкт-Петербург) и в отделении эндокринологии ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМН (Санкт-Петербург). В качестве группы сравнения была использована популяционная выборка, которую составили 103 женщины из Северо-Западного региона России. В данную группу вошли доноры отделения переливания крови ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМН и ГУЗ Городской Мариинской больницы. Мутации в гене 21-гидроксилазы (P30L, A/C655G, del8bp, I172N, V281L, Q318X, R356W, P453S, делеция гена CYP21A2 (delA2)) определяли с использованием метода ПЦР с последующим рестрикционным анализом. Cмесь для амплификации обьемом 25 мкл включала 15 нМ каждого праймера, 67 мМ трис-HCl, рН 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgCl2, 6,7 мкМ ЭДТА, 10 мМ меркаптоэтанола, 170 мкг BSA, 1,0 мМ каждого dNTP и 1U Taq-ДНК-полимеразы (производство «Бион», Москва). Амплификацию анализируемых фрагментов генов CYP21A2 и CYP21A1P проводили в два этапа [6; 7]. Полученные на первом этапе работы продукты ПЦР использовали в качестве матрицы на втором этапе амплификации. При этом применяли специальные модифицированные праймеры для создания специфичных сайтов рестрикции с целью детекции изучаемых мутаций [7]. Рестрикцию амплифицированных ДНК-фрагментов проводили согласно рекомендациям фирмы-изготовителя эндонуклеаз (ООО «Сибэнзим»). Последовательности олигонуклеотидов, условия реакций и эндонуклеазы рестрикции были описаны в более ранних работах [3]. Продукты амплификации и ферментативного гидролиза разделяли в 5–7,5%-м неденатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ). Гель окрашивали в водном растворе этидиум-бромида (0,5 мкг/мл). Результаты электрофоретического разделения фрагментов ДНК регистрировали в проходящем ультрафиолетовом свете (длина волны 380 нм) на трансиллюминатор Macrovue (LKB, Великобритания). Для определения значимости различий по исследуемым показателям между двумя группами использовались ряд критериев из статистического пакета Attestat, находящего в свободном доступе на сайте http://attestasoft.narod.ru. Для оценки распределения частот гетерозиготных носителей в группах сравнения использовался точный критерий Фишера. Для определения различий по уровню 17-ОН-прогестерона между подгруппами в группе женщин с привычным невынашиванием беременности применялся критерий Манна-Уитни. Относительный риск (OR) развития заболевания при определенном генотипе рассчитывали по стандартной формуле OR = a/b × d/c, где a и b количество больных, имеющих и не имеющих мутантный генотип, соответственно, и c и d количество человек в контрольной группе имеющих и не имеющих мутантный генотип соответственно. OR указан с 95 % доверительным интервалом. Границы доверительного интервала вычисляли по формулам ORmin = OR (1 – 1,96/√χ2) и ORmax = OR (1 + 1,96/√χ2) РЕЗУЛЬТАТЫ Были проанализированы частоты мутаций в гене 21-гидроксилазы, наиболее распространенных у населения Европейских популяций (P30L, A/C655G, del8bp, I172N, V281L, Q318X, R356W, P453S, делеция гена CYP21A2 (delA2)), в группе женщин с привычным невынашиванием беременности (ПНБ) и в популяционной выборке (табл. 1). Как следует из таблицы 1, мутации P30L, Del8bp, I172N, V236E в двух сравниваемых группах не выявлены. В группе женщин с ПН мутации V281L, Q318X A/C655G R356W P453S и делеция гена (delA2) идентифицированы с частотами 4,5 % (5/112), 3,6 % (4/112) и 0,9 % (1/112) 0,9 % (1/112) 0,9 % (1/112) и 3,6 % (4/112) соответственно. В популяционной выборке выявлены лишь 2 мутации — V281L и Q318X с частотой 1 % каждая. Таким образом, общая частота гетерозиготных носителей мутаций в гене CYP21A2 в группе женщин с ПНБ составила 14,4 %, тогда как в популяционной выборке данная величина не превышала 2 % (p = 0,001). Согласно коэффициенту соотношения шансов гетерозиготное носительство мутаций в гене CYP21A2 увеличивает риск привычного невынашивания беременности в 8 раз (OR = 8,4 (1,9–37,6)). Сравнительный анализ частот мутаций между двумя группами не выявил статистически значимых отличий по отдельным мутациям P30L, A/C655G, I172N, Del8bp, V236E, V281L, Q318X, R356W, P453S, delA2. Частота носительства «тяжелых» мутаций (A/C655G, Q318X, delA2), приводящих к снижению ферментативной активности 21-гидроксилазы практически до нуля, составила 8,9 % (10/112) в группе женщин с ПНБ, что существенно выше по сравнению с таковой в популяционной выборке — 1 % (1/103). Для исследования ассоциации уровня 17-ОН-прогестерона в периферической крови с гетерозиготным носительством мутаций в гене CYP21A2 группа женщин с ПНБ была разделена на две подгруппы: в первую (n = 96) — вошли женщины, не имеющие анализируемых мутаций в гене CYP21A2, а во вторую — женщины, гетерозиготные носители мутаций. Средняя концентрация 17-OH-прогестерона в крови у женщин из первой подгруппы составила 2,8 ± 0,7 нмоль/л, во второй подгруппе 2,4 ± 0,3 нмоль/л (табл. 2). Согласно полученным данным, средний уровень 17-OH-прогестерона достоверно не отличался в обеих подгруппах (p > 0,05). Можно предположить, что наличие «тяжелых» мутаций (A/C655G, Q318X, delA2) в большей степени сказывается на колебании уровня 17-ОН-прогестерона. Исходя из этого предположения, нами проанализированы уровни 17-ОН-прогестерона отдельно у женщин с мутациями, приводящими к нулевой активности 21-гидроксилазы (n = 8), и у женщин, не имеющих мутаций. Средний уровень 17-ОН-прогестерона в крови у женщин с тяжелыми мутациями составил 2,6 ± 0,5 нмоль/л, тогда как у женщин, не имеющих мутаций — 2,8 ± 0,7 нмоль/л (табл. 2). Полученные различия по данному показателю статистически не достоверны ОБСУЖДЕНИЕ Как показали исследования ПНБ при гиперандрогении влияние андрогенов на функционирование желтого тела может негативно отразиться на течении беременности. Мутации в гене CYP21A2, как «легкие», так и «тяжелые», в гетерозиготном состоянии могут способствовать снижению ферментативной активности 21-гидроксилазы, что, в свою очередь, приводит к повышению уровня андрогенов в организме матери [10]. Нами были определены частоты мутаций в гене CYP21A2 у женщин с ПНБ и у женщин из популяционной выборки. Согласно полученным нами данным частота мутаций в гене CYP21A2 в группе женщин с привычным невынашиванием была достоверно выше. Все мутации выявлены в гетерозиготном состоянии. Можно предполагать, что общая ферментная активность 21-гидроксилазы при гетерозиготном носительстве «тяжелых» мутаций (Q318X или делеция гена CYP21A2) а, возможно, и «легких» (V281L, P453S), существенно снижена. Тем не менее, ее вполне достаточно для предотвращения развития классических форм ВГКН, но не хватает для поддержания адекватного уровня андрогенов, который необходим для нормального развития беременности. Повышенная частота мутаций в гене CYP21A2 при ПНБ позволяет предполагать ассоциацию данной патологии с наличием мутаций в гене 21-гидроксилазы. В работах, посвященных исследованию нарушений функций фермента 21-гидроксилазы, дискутируется вопрос о возможности выявления носительства мутаций в гене CYP21A2 при помощи такого диагностического метода, как определение уровня 17-ОН-прогестерона в крови женщины. Известно, что при нарушении в гене CYP21A2 фермент 21-гидроксилаза не катализирует превращение 17-ОН-прогестерона в 11-дезоксикортизол, что ведет к его накоплению в организме [20]. По нашим данным, при сравнении среднего уровня 17-ОН-прогестерона у пациенток с мутациями в гене CYP21A2 и без них значимых различий выявлено не было. Также не было выявлено различий при сравнении уровня 17-ОН-прогестерона у женщин из подгруппы с «тяжелыми» мутациями и женщин из подгруппы без мутаций, что согласуется с данными зарубежных авторов. Так, при сравнении уровня 17-ОН-прогестерона у 11 словенских женщин с гиперандрогенией (ГПА) и с мутациями в гене CYP21A2 и 72 женщин с ГПА, но без мутаций в данном гене не выявлено статистически значимых различий [4]. Авторы работы пришли к выводу о низкой прогностической способности такой диагностики. В другом исследовании 21,9 % женщин с ГПА и гирсутизмом имели мутации в гетерозиготном состоянии, но у всех женщин был нормальной уровень 17-ОН-прогестерона. Следовательно, нормальный уровень 17-ОН-прогестерона не исключает носительства мутаций [19]. Таким образом, определение уровня 17-ОН-прогестерона не позволяет достоверно судить о наличии или отсутствии мутаций в гене CYP21A2, и на данный момент не существует четкого биохимического показателя, который отражал бы носительство мутаций в этом гене. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПНБ является мультифакторным заболеванием, развивающимся вследствие разных причин, среди которых доминируют гормональные нарушения. Одним из таких нарушений является гиперандрогения, вызванная ВГКН, которая, в подавляющем большинстве случаев обусловлена нарушениями в гене CYP21A2, кодирующим фермент 21-гидроксилазу. Результаты нашей работы показали, что у женщин с ПНБ выявлено достоверное повышение частоты мутаций в гене CYP21A2 по сравнению с женщинами из популяционной выборки. Наличие мутаций в гене CYP21A2 в гетерозиготном состоянии может способствовать повышению уровня андрогенов в организме беременных, что, в свою очередь, может негативно сказываться на течении беременности и быть причиной ПН. Таким образом, выявление мутаций в гене CYP21A2 может способствовать уточнению причин ПНБ и позволяет оптимизировать тактику ведения пациентов с ПН. В завершение следует отметить, что исследования ассоциации ПНБ с нарушениями в гене CYP21A2 только начинаются. Дальнейшая работа в этом направлении поможет более глубоко и объективно оценить вклад таких нарушений в развитие данной патологии.

About the authors

Natalya Sergeevna Osinovskaya

Laboratory of prenatal diagnostics of congenial and hereditary diseases

Email: natosinovskaya@mail.ru
PhD, senior research fellow

Iskender Yuryevich Sultanov

Laboratory of prenatal diagnostics of congenial and hereditary diseases

assistant

Tatyana Eduardovna Ivaschenko

Laboratory of prenatal diagnostics of congenial and hereditary diseases

Dr. Sci, Prof., Leading Researcher

Vladislav Sergeevich Baranov

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology NWB RAMS

Dr. Sci, Prof., Corresponding Member of RAMN, head of the laboratory of prenatal diagnostics of congenial and hereditary diseases

References

Supplementary files