Array-based comparative genomic hybridization (ARRAY-CGH) in analysis of chromosomalaberrations and CNV in blighted ovum pregnancies

Full Text

Введение Проблема потери беременности на ранних сроках остается одной из ключевых в репродуктивной биологии и медицине. В среднем 15–20 % клинически распознаваемых беременностей спонтанно прерывается в течение первого триместра, при этом основной вклад в нарушение начальных этапов внутриутробного развития человека вносят геномные мутации в виде числовых нарушений хромосом — анеуплоидии и полиплоидии [3]. Частота мутаций, выявляемых в материале спонтанных абортов, обычно составляет 50–60 %. В то же время значительное число случаев ранних репродуктивных потерь с наличием у внутриутробно погибшего зародыша нормального кариотипа не может быть объяснено с цитогенетических позиций. Именно такие случаи представляют особую проблему в плане медико-генетического консультирования супружеских пар с невынашиванием беременности неясной этиологии. Принимая во внимание несомненную многофакторную природу спонтанного прерывания беременности, тем не менее имеются веские основания полагать, что некоторая часть хромосомных мутаций остается не выявленной при цитогенетическом обследовании абортивного материала. Три основные методические проблемы стандартного кариотипирования клеток спонтанных абортусов, а именно низкая пролиферативная активность клеточных культур, контаминация культур клетками материнского организма и ограниченная разрешающая возможность световой микроскопии в идентификации микроструктурных аберраций хромосом, оказывают заметное влияние на эффективность и достоверность цитогенетического анализа при установлении причин невынашивания беременности. Прошедшее десятилетие ознаменовалось внедрением молекулярно-цитогенетических технологий в решение проблем репродуктивной генетики. Применение методов флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) и сравнительной геномной гибридизации (CGH) позволило описать новые мутации в клетках спонтанных абортусов, в частности моносомии по ряду аутосом набора, двойные и тройные анеуплоидии, а также продемонстрировало высокий уровень хромосомного мозаицизма [13, 17, 21]. Накопленные знания явились основой наблюдаемого прогресса в пренатальной и преимплантационной цитогенетической диагностике хромосомных болезней. Следует отметить, что принципиальным моментом при проведении подобных молекулярно-цитогенетических исследований явилась возможность частичного (FISH) или даже полного (CGH) анализа кариотипа на предмет числовых и несбалансированных хромосомных аберраций без непосредственного приготовления препаратов метафазных хромосом. Совершенствование технологии сравнительной геномной гибридизации в направлении использования ДНК-микрочипов (array-CGH, aCGH) открыло новые перспективы для так называемого молекулярного или виртуального кариотипирования эмбриональных клеток. Основной целью такого анализа является, прежде всего, идентификация микроструктурных аберраций хромосом (микроделеций и микродупликаций, не выявляемых при стандартном кариотипировании), а также вариаций по числу копий крупных блоков повторов ДНК (Copy Number Variation, CNV), изменчивость которых может быть ассоциирована с нарушением внутриутробного развития. Анализ генного состава участков хромосом, затронутых микроструктурными аномалиями или CNV-полиморфизмом, позволяет приблизиться к идентификации генов, дисбаланс по числу копий которых может оказаться критичным для успешного прохождения ранних этапов эмбрионального развития человека. Заметное в последнее время смещение фокуса в цитогенетических исследованиях от хромосомы к гену, а также ожидаемое внедрение высокопроизводительных технологий полногеномного секвенирования позволяет констатировать появление нового направления в репродуктивной биологии и медицине — репродуктивной цитогеномики. К настоящему времени уже опубликованы результаты 13 исследований спонтанных абортусов, проведенных с использованием технологии aCGH [6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 19, 20]. Однако полученные данные характеризуются заметной вариабельностью как в плане изученных групп (спонтанные абортусы с нормальным кариотипом или эмбрионы без предварительного цитогенетического анализа вследствие низкой пролиферативной активности клеток, спонтанные абортусы от пар с привычным невынашиванием беременности), объемов обследованных выборок (от 6 до 103 абортусов), использованных диагностических платформ (ДНК-микрочипы низкой плотности на основе BAC-библиотек или высокоразрешающие ДНК-микрочипы на основе олигонуклеотидных последовательностей), так и собственно полученных результатов (частота выявленных субмикроскопических хромосомных аномалий в изученных выборках варьирует в широких пределах — от 0 до 55 %) [5]. Целью настоящего исследования явился aCGH-анализ случаев анэмбрионии — наиболее тяжелой формы патологии эмбрионального развития, связанной с нарушениями самых ранних этапов дифференцировки внутренней клеточной массы зародыша. Как правило, вклад хромосомных аномалий в формирование пустого плодного мешка оказывается самым заметным в ряду от анэмбрионии к неразвивающейся (замершей) беременности и собственно спонтанному аборту. В отмеченных выше молекулярно-цитогенетических исследованиях внутриутробно погибших эмбрионов, проведенных с использованием aCGH, только в двух работах было сообщено об анализе в общей сложности 14 случаев анэмбрионии [15, 19]. Таким образом, данная форма патологии на фоне нарастающего объема информации об исследованиях спонтанных абортусов остается практически неизученной с применением современных высокоразрешающих методов анализа кариотипа. Материалы и методы Обследовано 10 спонтанных абортусов, полученных от женщин с диагнозом анэмбриония. Критериями для постановки диагноза при ультразвуковом обследовании беременных женщин являлись отсутствие сформированного эмбриона в полости плодного мешка и несоответствие размеров плодного мешка ожидаемым размерам на текущем сроке беременности. Срок беременности, определенный по дате последней менструации, варьировал от 6 до 12,5 недели (среднее значение 9,0 ± 1,9 нед.), а по результатам ультразвукового обследования — от 3,5 до 11 недель (среднее значение 5,6 ± 2,2 нед). Возраст матерей варьировал от 23 до 37 лет (среднее значение 29,8 ± 4,7 лет). Возраст отцов находился в диапазоне от 26 до 43 лет (среднее значение 33,9 ± 6,0 лет). Кариотип спонтанных абортусов был установлен с использованием стандартного метода длительного культивирования тканей плодных оболочек. В случае неудачного культивирования по причине низкой пролиферативной активности клеток in vitro препараты метафазных хромосом были получены «прямым» методом из некультивированных ворсин хориона [3]. Все спонтанные абортусы, включенные в настоящее исследование, имели нормальный кариотип — 46, ХХ (7 случаев) или 46, XY (3 случая). ДНК для молекулярно-цитогенетического анализа выделяли из ворсин хориона с использованием стандартного протокола фенол-хлороформной экстракции. В качестве контрольного образца для проведения конкурентной сравнительной геномной гибридизации использовалась ДНК из лимфоцитов периферической крови здорового донора мужского пола. Мечение обеих геномных ДНК-библиотек (анализируемой и контрольной) проводилось с использованием набора SureTag Complete DNA Labeling Kit в соответствии с протоколом производителя (Agilent Technologies, США). Гибридизацию проводили на ДНК-микрочипах высокого разрешения SurePrint G3 Human Genome CGH+SNP Microarray Kit, 4 × 180K также в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем (Agilent Technologies, США). В структуру микрочипа входит 110 712 олигонуклеотидных ДНК-мишеней и 59 647 однонуклеотидных полиморфизмов (SNP). Средняя разрешающая возможность микрочипа составляет 25,3 т. п. н. Детекция гибридизационных сигналов была проведена на сканере SureScan Microarray Scanner (Agilent Technologies, США). Сканированные изображения были обработаны с помощью программы Feature Extraction, версия 10.7.3.1 (Agilent Technologies, США). Анализ данных проводился с использованием программного обеспечения CytoGenomics v. 2.5.7.0 (Agilent Technologies, США). Для исключения доброкачественных полиморфных CNV использовали Базу данных геномных вариантов (Database of Genomic Variants, DGV) [2]. Информация о функциях генов и их связях с наследственными заболеваниями человека была получена из web-ресурсов Gene [1] и OMIM [4]. Результаты исследования Использование ДНК-микрочипов высокого разрешения позволило идентифицировать в кариотипе 10 спонтанных абортусов с предварительно установленным нормальным кариотипом от 3 до 18 регионов делеций или амплификаций. Общее число выявленных аберраций составило 95. В общей сложности они захватывали 422 гена. С целью идентификации потенциальных патогенетически значимых хромосомных аберраций и затрагиваемых ими генов нами был проведен анализ наличия выявленных в настоящем исследовании аномалий в Базе данных геномных вариантов (DGV), аккумулирующей информацию о CNV-полиморфизме у здоровых индивидов. В результате из дальнейшего исследования было исключено 43 варианта, присутствующих в DGV. При этом список генов сократился до 284. Далее из анализа были также исключены хромосомные регионы с микроделециями и микродупликациями, не содержащие генных последовательностей. После проведенной фильтрации у 9 из 10 обследованных спонтанных абортусов были выявлены несбалансированные хромосомные аберрации, заслуживающие внимания с точки зрения их возможного влияния на процессы внутриутробного развития (табл. 1). Случай № 1. Выявлено 4 микроделеции и 1 микродупликация, не зарегистрированные в DGV. Микроделеция 2p21 размером 726 п. н. затрагивала только один ген SIX3, продукт которого принадлежит к семейству гомеобоксных транскрипционных факторов и играет роль в формировании глаза. Мутации в данном гене ранее были описаны при голопрозенцефалии 2 типа. Делеция 3q13.31-q13.32 затрагивала ген LSAMP, продуктом которого является поверхностный нейрональный гликопротеин, действующий как селективная адгезивная молекула и принимающий участие в формировании специфической межнейрональной сети. Микродупликация 5p35.3 затрагивала 10 генов, 5 из которых принадлежат семейству транскрипционных факторов «цинковые пальцы» — ZNF354A, ZNF354B, ZNF879, ZNF354 и ZNF454. Микроделеция 11q13.2 захватывала 10 генов, среди которых привлекает внимание TBX10. Продуктом гена является транскрипционный фактор семейства T-box. Эти транскрипционные факторы играют важную роль в регуляции различных процессов развития, включая раннюю дифференцировку эмбриональных клеток и органогенез. Следует отметить, что микродупликация данного хромосомного субсегмента, в отличие от выявленной нами микроделеции, присутствует в DGV. Наконец, еще одна микроделеция — del20p13.32, затрагивала ген STX16 (вовлечен в формирование специфичных синаптических взаимодействий) и ген аминопептидазы NPEPL1, а также импринтированный ген GNAS и антисмысловой РНК-транскрипт GNASAS1. Кроме того, в данном регионе локализованы последовательности двух микро-РНК — has-mir-296 и has-mir-298, причем первая из них является регулятором известного транскрипционного фактора NANOG, вовлеченного в поддержание плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток. Случай № 2. Выявлено 5 микроделеций, при этом две из них — del2p21 и del20q13.32 по размеру и локализации совпали с описанными выше аберрациями у зародыша № 1. Еще одна микроделеция del10q21.3 размером 1,387 м. п. н. была также зарегистрирована у зародыша № 5. Данная микроделеция затрагивала единственный ген — CTNNA3, продуктом которого является α3-катенин, ассоциированный с семейством белков кадхеринов, вовлеченных в формирование межклеточных взаимодействий. Случай № 3. Выявлена микроделеция 18q12.2-q12.3 размером 1,143 м. п. н. В пределах данного хромосомного участка локализована некодирующая последовательность длинной межгенной РНК 669 (LOC647946), а также микро-РНК has-mir-924 с неизвестной функцией. Случай № 4. Идентифицирована микроделеция 7p22.2 размером 53 т. п. н, затрагивающая единственный ген — SDK1. Продуктом данного гена является поверхностный адгезионный белок, связь которого с нарушением внутриутробного развития неочевидна. В литературе имеются данные о вовлеченности этого гена в патогенез гломерулосклероза и ВИЧ-ассоциированной нефропатии, а также об ассоциации его полиморфных вариантов с гипертензией. Случай № 5. Выявлено 6 микроделеций, 5 из которых являются достаточно протяженными с размером от 1,3 до 2,1 м. п. н. Делеция 4p12 затрагивает 5 генов, причем 4 из них (GABRG1, GABRA2, GABRA4 и GABRB1) принадлежат к семейству рецепторов гамма-аминомасляной кислоты — основного ингибиторного нейротрансмиттера в центральной нервной системе. Продуктом еще одного гена (СOX7B2) является субъединица митохондриальной цитохром С-оксидазы. Делеция 4q13.1-q13.2 затрагивает 4 гена, среди которых привлекает внимание EPHA5. Продуктом геном является белок субсемейства рецепторов эфрина с тирозин-киназными свойствами. Данный белок вовлечен в обеспечение процессов развития, особенно нервной системы. В регуляцию развития центральной нервной системы и головного мозга вовлечены по меньшей мере еще два гена — семафорин 3D (SEMA3D) и CA10, затрагиваемые микроделециями 7q21.11 и 17q21.33-q22 соответственно. В целом, обращает на себя внимание тот факт, что большинство отмеченных генов вовлечены в формирование мозга и центральной нервной системы. Второй момент — это наличие множества относительно протяженных делеций. В связи с этим встает вопрос о родительском происхождении данных аберраций. Обследование кариотипа супругов в данной семье на предмет носительства обнаруженных микроструктурных хромосомных аномалий представляется также весьма актуальным вследствие наличия в анамнезе ребенка с пороками развития. Случай № 6. Выявлена крупная делеция 4p16.3-p15.2 размером 26,7 м. п. н. (рис. 1а), соответствующая региону микроделеционного синдрома Вольф-Хиршхорна. Делеция затрагивает 191 ген. Еще одна делеция на хромосоме 4 (del4q22) затрагивает единственный ген — GRID2, продуктом которого является рецептор глутамата в головном мозгу млекопитающих. Наконец, аберрация — dup11p15.1 затрагивает 4 гена, среди которых имеется PIK3C2A. Продуктом данного гена является протеинкиназа, вовлеченная в сигнальные пути, регулирующие клеточную пролиферацию, миграцию и внутриклеточный транспорт белков. Важно отметить, что в данной семье было отмечено 3 случая анэмбрионии, включая настоящий, при отсутствии живорожденных детей. Наличие делеций на хромосоме 4 и отягощенного акушерского анамнеза позволяет предполагать существование структурной аберрации в кариотипе супругов и требует проведения дополнительного цитогенетического обследования. Случай № 7. Выявлена микродупликация 2q23.1, затрагивающая единственный ген семейства метилцитозин-связывающих белков (MBD5), участвующих в регуляции эпигенетической организации хроматина и экспрессии генов. Интересно, что делеция 2q23.1 соответствует одноименному микроделеционному синдрому, сопровождающемуся умственной отсталостью и рядом дисморфических признаков (номер в Каталоге наследственных болезней МакКьюсика — 156 200) [4]. Важно отметить, что, по данным ультразвукового обследования, развитие эмбриона в обследованном нами случае прекратилось на очень ранних сроках (3,5 недели). Кроме того, предыдущая беременность в данной семье закончилась мертворождением. Случай № 8. Выявлены 3 микроделеции, причем две из них (del4q13.1-q13.2 и del17q21.33-q22) перекрывались с аберрациями, выявленными у эмбриона № 5. Еще одна микроделеция 8p22 затрагивала единственный ген — TUSC3, являющийся кандидатным опухолесупрессорным геном, экспрессирующимся в легком, печени, толстом кишечнике, простате. Гомозиготные делеции, затрагивающие данный ген, описаны при метастатическом раке простаты. Случай № 9. Выявлено 2 делеции. Одна из них — del6p25.3 — затрагивала два гена — DUSP22 и IRF4. Продуктом первого является регулятор рецептора эстрогена, а второго — транскрипционный фактор, регулятор интерферон-зависимых генов. Крупная делеция 18p11.32-p11.31 (рис. 1б) размером 5,153 м. п. н. захватывала 30 генов. Среди них привлекают внимание ген THOC1, мутации которого приводят к остановке развития в период имплантации, и ADCYAP1 — продукт которого вовлечен в регуляцию имплантации бластоцисты, контроль физиологических функций плаценты в период беременности и регуляцию роста плода. Обсуждение Полученные результаты молекулярно-цитогенетического обследования случаев ранней эмбриональной гибели с использованием технологии aCGH представляют интерес с нескольких позиций. Прежде всего, обращает на себя внимание высокая частота микроделеций и микродупликаций хромосомных регионов, выявленных практически в каждом обследованном случае. Даже после исключения вариантов, зарегистрированных в DGV, эта частота оказывается весьма заметной — у 9 из 10 обследованных спонтанных абортусов (т. е. в 90 % случаев) выявлены микроструктурные аберрации хромосом. Это превышает опубликованные в литературе данные, где аналогичный показатель находится в диапазоне от 0 до 55 %. Несколько факторов могут, на наш взгляд, объяснить наблюдаемое явление. Во-первых, это специфика обследованной группы — анэмбрионии с очень ранней остановкой развития зародыша. Вклад хромосомных аномалий в этиологию анэмбрионий, как правило, заметно выше по сравнению с неразвивающимися беременностями и собственно спонтанными абортами. В большинстве опубликованных работ, проведенных с использованием aCGH, акцента на морфологической характеристике обследованного абортивного материала не делалось. Только в двух исследованиях такой анализ был проведен, и было отмечено наличие в выборках в общей сложности 14 случаев анэмбрионий [15, 19]. В одной работе при изучении 11 случаев анэмбрионии с помощью aCGH были выявлены исключительно числовые нарушения хромосом — два случая трисомии 16, трисомия 15, мозаичный кариотип 45, X/46, XY и триплоидия 69, XXX [15]. В другом исследовании среди трех обследованных абортусов один имел de novo микродупликацию 10p15.3 размером 199 т. п. н. Аберрация затрагивала 4 гена, среди которых привлекает внимание WDR37. Продукт данного гена вовлечен в широкий спектр эссенциальных биологических процессов, таких как трансдукция сигналов, регуляция транскрипции, апоптоза, клеточного цикла и везикулярного транспорта. Второй абортус имел микроделецию 1q25.3 (48 т. п. н.) материнского происхождения и микродупликацию Xq28 (171 т. п. н.), наследованную от отца. Из затрагиваемых генов интересны STX6 и ZNF185, поскольку представители данных генных семейств были затронуты микроструктурными аберрациями и в нашем исследовании. Наконец, еще в одном случае анэмбрионии хромосомных нарушений выявлено не было [19]. Необходимо также принимать во внимание использование в проведенном нами исследовании ДНК-микрочипов высокого разрешения (180K), позволяющих выявлять большее количество микроструктурных перестроек, по сравнению с микрочипами на основе BAC-клонов. В то же время в литературе есть работы с использованием чипов большей плотности (244K), не продемонстрировавших, однако, заметного увеличения частоты регистрируемых аберраций кариотипа на фоне других исследований. Кроме того, нельзя исключить и того факта, что выявленные в нашей работе некоторые аберрации могут оказаться популяционно-специфичными CNV-полиморфизмами. Исследования с использованием технологии aCGH только начинают проводиться в отечественных лабораториях. Неудивительно, что информация о CNV-полиморфизме в различных российских популяциях пока отсутствует в DGV. В связи с этим остро встают вопросы о накоплении национальных популяционно-специфичных данных об этом типе изменчивости генома человека и об их интеграции в мировые базы данных, что чрезвычайно важно для корректной интерпретации результатов научных и диагностических исследований. Очевидно, что полученные нами на весьма ограниченной выборке результаты требуют валидации в дополнительных исследованиях. Вместе с тем представляет интерес сопоставление обнаруженных аберраций с опубликованными данными других исследований. В настоящее время в мире с помощью aCGH обследовано 596 спонтанных абортусов [5]. Среди выявленных аберраций обращает на себя внимание микродупликация 18p11.31 размером 502 т. п. н. [18]. В нашем исследовании была зарегистрирована протяженная делеция 18p11.32-p11.31 (случай № 10), также затрагивающая данный субсегмент хромосомы 18. Еще одна интересная мутация — микроделеция 10q21.3, выявленная дважды в нашем исследовании и в работе Rajcan-Separovic с коллегами [20]. В обоих наших случаях размер делеции составил 1,387 м. п. н., тогда как в другом исследовании — только 72 т. п. н., причем делеция была унаследована от матери. Интересно, что все делеции затрагивали единственный ген — CTNNA3, который является импринтированным и экспрессируется в плаценте только с хромосомы материнского происхождения [20]. Еще один момент связан с наличием одинаковых аберраций у нескольких абортусов даже в пределах одного нашего исследования. Следует отметить, что все они были представлены микроделециями, а не микродупликациями, в том числе и в не кодирующих областях (таблица). Очевидно, что необходимо расширение выборок для анализа патогенетической значимости выявленного хромосомного дисбаланса, а также для исключения популяционно-специфичного CNV-полиморфизма. Представляет интерес для дальнейшего исследования и спектр генов, затрагиваемых микроструктурными аберрациями хромосом. Любопытно, что большинство отмеченных нами таких генов оказались вовлеченными в формирование головного мозга и в обеспечение функций центральной нервной системы. Отражает ли это сложность генетического контроля развития мозга или указывает на плейотропные эффекты генов, пока остается неясным. Следующей по частоте встречаемости оказалась группа генов, принадлежащих к различным семействам транскрипционных факторов. Несомненно, что становится актуальным анализ функциональной и онтогенетической значимости CNV как потенциального объекта естественного отбора. Небезынтересно также исследование аберраций в участках, не содержащих известных кодирующих последовательностей, но которые вполне могут оказаться важными регуляторными элементами генома. Перспектива таких фундаментальных исследований просматривается с использованием высокопроизводительных технологий секвенирования нового поколения. С практической точки зрения представляется актуальным анализ происхождения микроструктурных хромосомных аберраций. И если мутации de novo не вызывают особых проблем с интерпретацией их фенотипических эффектов, то доказательство наследования микроструктурной аберрации от родителей поднимает ряд серьезных дискуссионных теоретических и практических вопросов, на которые пока нет однозначных ответов. Являются ли такие мутации действительной причиной ранней эмбриональной гибели, если они присутствуют в кариотипе взрослых индивидов? Насколько стабильны они при прохождении через мейоз и не приводят ли к появлению дополнительных микроструктурных изменений хромосом? Не оказывают ли влияния на фенотипическое проявление таких мутаций эффекты геномного импринтинга? Так или иначе в настоящее время мы находимся в периоде накопления данных о роли новой формы изменчивости генома человека (CNV) в этиологии ранних репродуктивных потерь и невынашивания беременности. Исследования в этом направлении представляются чрезвычайно актуальными и позволяют надеяться на получение новых знаний об особенностях организации и функционирования генома в ходе онтогенеза. Настоящее исследование выполнено при поддержке грантов ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009–2013 гг.» № 8276 и 8720.

About the authors

Igor Nikolayevich Lebedev

Institute of Medical Genetics SB RAMS

Email: igor.lebedev@medgenetics.ru
Doctor of Biological Sciences, Head of Laboratory of Cytogenetics

Anna Aleksandrovna Kashevarova

Institute of Medical Genetics SB RAMS

Email: anna.kashevarova@medgenetics.ru
PhD, researcher of Laboratory of Cytogenetics

Nikolay Alekseyevich Skryabin

Institute of Medical Genetics SB RAMS

Email: skryabinn@mail.ru
PhD, researcher of Laboratory of Cytogenetics

Tatyana Vladimirovna Nikitina

Institute of Medical Genetics SB RAMS

Email: tatyana.nikitina@medgenetics.ru
PhD, researcher of Laboratory of Cytogenetics

Mariya Yevgenyevna Lopatkina

Institute of Medical Genetics SB RAMS

PhD, researcher of Laboratory of Cytogenetics

Aleksandr Aleksandrovich Melnikov

Institute of Medical Genetics SB RAMS

Email: genetic87@sibmail.com
PhD, researcher of Laboratory of Cytogenetics

Yelena Aleksandrovna Sazhenova

Institute of Medical Genetics SB RAMS

Email: elena.sazhenova@medgenetics.ru
PhD, researcher of Laboratory of Cytogenetics

Tatyana Vasilyevna Ivanova

Siberian State Medical University

Email: itv7@yandex.ru
PhD, Associate professor of Chair of Obstetrics and Gynecology

Irina Dmitriyevna Yevtushenko

Siberian State Medical University

Email: evtushenko_id@mail.ru
MD, Professor, Head of Chair of Obstetrics and Gynecology

References

Supplementary files