Evaluation of significant bacteriuria in pregnant women using quantitative real-time PCR

Full Text

Введение

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) являются одними из самых распространенных инфекционных заболеваний во всем мире. В России распространенность ИМП составляет порядка 1000 случаев на 100 000 населения [1]. Ежегодно в США на ИМП приходится более 7 млн визитов к врачу и около 1 млн обращений в отделения неотложной помощи, которые заканчиваются госпитализацией более чем в 100 тыс. случаев в год [2].

Риск развития ИМП зависит от возраста, пола пациента, наличия сопутствующих заболеваний и патологии мочевыводящих путей. Женщины значительно чаще, чем мужчины, страдают от ИМП. В течение жизни до 60 % женщин сталкиваются хотя бы с одним эпизодом ИМП [3]. Пик заболеваемости клинически выраженными ИМП приходится на молодых сексуально активных женщин в возрасте от 18 до 24 лет [3, 4].

ИМП относятся к наиболее распространенным инфекционным заболеваниям в акушерстве и гинекологии. Развитие ИМП во время беременности и отсутствие своевременного лечения может приводить к появлению серьезных осложнений со стороны матери и плода, таких как анемия, артериальная гипертензия, преждевременные роды, рождение детей с низкой массой тела [5, 6].

Возбудителем ИМП в подавляющем большинстве случаев является Escherichia coli (70–80 %). Реже при ИМП выявляются другие представители бактерий семейства Enterobacteriaceae (Klebsiella spp., Proteus spp.), Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp. [7, 8].

Основной метод диагностики ИМП — культивирование средней порции мочи, собранной с максимальным соблюдением стерильности и доставленной в лабораторию в предельно короткие сроки. Бактериологический метод исследования мочи является трудоемким, длительным (48–72 часа), требующим особых условий культивирования и идентификации микроорганизмов. В настоящее время предлагаются альтернативные тесты для выявления бактериурии, такие как микроскопическое исследование мочи, а также нитритный тест и тест для определения эстеразы лейкоцитов, выпускаемые в виде тест-полосок. Эти тесты относительно быстры и удобны, однако, по сравнению с культуральным методом, их чувствительность и специфичность недостаточно высоки, особенно у беременных женщин [9–12].

В настоящее время использование молекулярно-биологических методов для выявления и идентификации микроорганизмов, их количественного определения в биологическом материале является эффективной и современной альтернативой традиционным бактериологическим исследованиям. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени обладает высокой чувствительностью и специфичностью, позволяет определять количественное содержание микроорганизмов в исследуемом материале. Разработка и внедрение новых методов на основе количественного анализа ДНК возбудителей ИМП в моче с помощью ПЦР позволит сократить сроки проведения исследования, повысить уровень стандартизации процедуры исследования и точности получаемых результатов.

Целью данного исследования являлась оценка методики на основе количественной ПЦР для определения значимой бактериурии у беременных женщин.

Материалы и методы

Было проведено ретроспективное исследование проб мочи, полученных от беременных женщин на разных сроках беременности, поступивших в отделения патологии беременности ФГБНУ «НИИАГиР им. Д.О. Отта». Клиническим материалом для исследования служила средняя порция утренней свободно выпущенной мочи, полученная после туалета половых органов. Бактериологическое исследование клинического материала проводилось количественным методом с использованием 5 % кровяного агара. Значимой бактериурией считали содержание бактерий не менее 105 КОЕ/мл. Идентификацию выделенных микроорганизмов проводили методом масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS, BRUKER Daltonics, Германия). До проведения ПЦР-исследования образцы средней порции мочи хранили при температуре –70 °С.

Образцы мочи анализировали методом количественной мультиплексной ПЦР в реальном времени с применением наборов реагентов «АмплиСенс» серии «ИМП» (ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии», Москва), предназначенных для оценки содержания в пробах мочи общей бактериальной ДНК, ДНК Enterobacteriaceae, E. coli, Klebsiella pneumoniae/oxytoca, Proteus spp., Staphylococcus saprophyticus, Pseudomonas aeru­ginosa, Staphylococcus spp., Streptococcus spp. и Enterococcus spp. Экстракцию ДНК проводили с помощью набора РИБО-преп (ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии», Москва). ПЦР проводили с помощью амплификатора Rotor-Gene 6000 в соответствии с инструкциями к наборам реагентов. Концентрацию ДНК бактерий рассчитывали в ГЭ (геномных эквивалентах) в 1 мл мочи.

Пороговые значения клинически значимой концентрации общей ДНК бактерий, ДНК Enterobacteriaceae и E. coli определяли путем ROC-анализа (ROC — receiver operating characteristic) по максимальной пропорции правильно классифицированных образцов. Чувствительность и специфичность метода количественной ПЦР оценивали по отношению к результатам культурального исследования. Для остальных маркеров в качестве клинически значимой концентрации использовали значение ≥ 2 × 105 копий ГЭ/мл. Статистический анализ результатов осуществляли с использованием статистического пакета NCSS11 (NCSS, LCC).

Результаты исследования

Всего было протестировано 896 проб мочи, из них значимая бактериурия была выявлена в 28 случаях. Общая распространенность значимой бактериурии составила 3 %. Частота выделения E. coli составила 50 % (в 14 пробах из 28), Enterococcus spp. — 25 % (7 из 28), Klebsiella spp. — 7 % (2 образца мочи), Proteus spp. и S. saprophyticus по 4 % (в 1 пробе мочи каждый), Streptococcus spp. — 14 % (4 образца мочи) (рис. 1). Совокупная доля представителей семейства Enterobacteriaceae составила 61 %. В одном исследуемом материале (4 %) были обнаружены Enterococcus spp.и Streptococcus spp. в клинически значимом количестве.

Пороговые значения концентрации общей ДНК бактерий, ДНК Enterobacteriaceae и E. coli, определенные методом ROC-анализа, составили ≥ 1,2 × 106, ≥ 4,6 × 105 и ≥ 3,1 × 105 ГЭ/мл соответственно. Определение содержания ДНК Enterobacteriaceae в моче методом ПЦР позволило выявить все 17 случаев значимой бактериурии, обусловленной энтеробактериями, и определить отсутствие значимой бактериурии в 873 из 879 отрицательных случаев. Таким образом, чувствительность данного критерия составила 100 %, специфичность 99 % (табл. 1). В отношении выявления других отдельных групп уропатогенов в целом были получены показатели чувствительности и специфичности, равные или приближающиеся к 100 %. Для одного случая выявленной культуральным методом значимой бактериурии, обусловленной стрептококками, методом ПЦР была выявлена ДНК Streptococcus spp. в концентрации 2,3 × 104 ГЭ/мл, что ниже установленного порога клинической значимости. Чувствительность выявления ДНК Streptococcus spp. составила 75 %. Чувствительность и специфичность методики в целом, т. е. выявление всех определяемых бактерий/групп бактерий с использованием установленных для них порогов, составили 96 и 98 % соответственно.

 

Содержание общей бактериальной ДНК используется в данной методике как вспомогательный критерий, тем не менее мы оценили диагностические характеристики этого критерия. Анализ содержания общей ДНК бактерий позволил выявить 27 из 28 случаев бактериурии, установленной при культуральном исследовании. В одном случае были выявлены энтерококки в клинически значимой концентрации как при культуральном исследовании, так и методом ПЦР, однако концентрация общей бактериальной ДНК была определена как 3,4 × 105 ГЭ/мл, что ниже установленного порога клинической значимости. Таким образом, чувствительность выявления бактериурии по критерию содержания общей ДНК бактерий составила 96 %. Из 868 проб, отрицательных в отношении значимой бактериурии при культуральном исследовании, для 764 проб методом ПЦР было определено содержание общей ДНК бактерий ниже порога значимости, таким образом, специфичность ПЦР-анализа по этому критерию составила 88 %.

Обсуждение

ИМП относят к числу самых распространенных инфекционных заболеваний, при этом особую опасность ИМП представляют для беременных женщин. Диагностика ИМП в настоящее время основывается на бактериологическом исследовании проб мочи с количественным выделением этиологического агента. В качестве бактериологического критерия ИМП используется понятие значимой бактериурии. В различных клинических ситуациях значимой бактериурией считают выявление уропатогенных микроорганизмов в количестве ≥ 103, ≥ 104 или ≥105 КОЕ/мл. Так, для определения бессимптомной бактериурии порогом клинической значимости является содержание бактерий ≥105 КОЕ/мл [13]. В нашем исследовании обследуемой популяцией были беременные женщины, в подавляющем большинстве случаев не имевшие симптомов ИМП, поэтому в качестве порога значимой бактериурии мы выбрали концентрацию бактерий ≥ 105 КОЕ/мл.

В нашем исследовании были проанализированы пробы мочи от 896 беременных женщин, значимая бактериурия была выявлена у 28 женщин (3 %). У половины всех женщин со значимой бактериурией выявлялись E. coli, за ними по частоте выявления следовали Enterococcus spp. (25 %), Streptococcus spp. (14 %), Klebsiella spp. (7 %), Proteus spp. и S.  saprophyticus (по 4 % каждый). Совокупная доля представителей семейства Enterobacteriaceae составила 61 %. Наши данные согласуются с результатами недавнего многоцентрового исследования ДАРМИС, проведенного в 2010–2011 годах с целью изучения этиологической структуры и чувствительности возбудителей ИМП в России. Наиболее частыми возбудителями ИМП являлись представители семейства Enterobacteriaceae. Их доля составила 85 %, при этом E. coli была возбудителем ИМП в 65 % случаев. Другие возбудители ИМП встречались с частотой, не превышающей 10 % [14].

Культуральный метод до сих пор остается «золотым стандартом» в диагностике ИМП. Однако нужно отметить его существенные недостатки — длительность и трудоемкость исследования. Альтернативные тесты, с помощью которых можно получить более быстрые результаты исследования, как правило, обладают низкими показателями чувствитель­ности и специфичности. Так, чувствительность микроскопического исследования осадка мочи составляет 83 %, специфичность — 59 %. Чувствительность нитритного теста, основанного на превращении нитратов в нитриты под действием грамотрицательных микроорганизмов, присутствующих в моче, составляет 35–85 % при высокой специфичности (92–100 %). Чувствительность теста для определения эстеразы лейкоцитов, выделяемой при разрушении лейкоцитов, составляет 72–97 % (при обследовании беременных женщин — всего около 50 %), специфичность — 64–82 % [9–12].

Методы молекулярной диагностики активно внедряются в диагностику инфекционных заболеваний, включая диагностику ИМП. Так, в недавнем исследовании с использованием полуколичественного ПЦР-анализа для обнаружения ДНК основных уропатогенов (E. coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp., Proteus mirabilis, Enterococcus faecalis и P. aeruginosa) чувствительность и специфичность ПЦР для выявления бактериурии составили 81 и 90 % соответственно [15]. В другом исследовании, также с применением полуколичественной ПЦР, в пробах мочи оценивали содержание общей бактериальной ДНК и одновременно определяли ДНК семи основных уропатогенов (E. coli, Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp. and Streptococcus spp.), используя в качестве мишени фрагмент гена 16S рРНК. Чувствительность и специфичность определения общей бактериальной ДНК в данном исследовании составили 97 и 80 % соответственно, а совпадение результатов ПЦР и бактериологического посева при идентификации основных уропатогенов составило 75–100 % [16].

В нашем исследовании для диагностики бактериурии мы использовали методику на основе количественной мультиплексной ПЦР в режиме реального времени для определения содержания ДНК основных групп уропатогенов (выполняемую с помощью наборов реагентов «АмплиСенс» серии ИМП). Показатели чувствительности и специфичности используемой методики для большинства выявляемых видов / групп возбудителей составляли от 99 до 100 %. В целом, с применением данной методики были правильно идентифицированы 27 из 28 случаев значимой бактериурии и 852 из 868 отрицательных случаев. В итоге чувствительность и специфичность оцениваемой методики на основе количественной ПЦР по отношению к бактериологическому ­методу составили 96 и 98 %, соответственно.

Отдельного внимания заслуживает вопрос о диагностической значимости выявления общей бактериальной ДНК. В используемой нами методике определение содержания общей бактериальной ДНК используется как вспомогательный критерий, при превышении порогового уровня которого рекомендуется повторное исследование нового образца мочи пациентки для подтверждения наличия бактериурии. Тем не менее чувствительность и специфичность данного критерия (96 и 88 % соответственно) позволяют рассматривать его в качестве скринингового теста на значимую бактериурию. Применительно к нашим данным, полученным при обследовании популяции с относительно низкой распространенностью значимой бактериурии, использование такого скрининга позволило бы сократить количество образцов мочи, которые нуждаются в дальнейшем исследовании (с применением молекулярного или культурального метода), на 85 %. Однако полноценная валидация данного критерия требует дальнейших исследований на популяциях пациентов с более высокой распространенностью бактериурии и при использовании других порогов значимости бактериурии.

Заключение

Распространенность значимой бактериурии с порогом ≥ 105 КОЕ/мл в обследованной группе беременных женщин составляет 3 %. В половине всех случаев значимой бактериурии у женщин в моче была выявлена E. coli. Показатели чувствительности и специфичности выявления значимой бактериурии с помощью методики на основе количественной ПЦР в реальном времени для большинства видов / групп бактерий составили от 99 до 100 %. Чувствительность и специфичность оцениваемой методики для выявления значимой бактериурии у беременных женщин составили 96 и 98 % соответственно.

About the authors

Tatyana A. Khusnutdinova

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Author for correspondence.
Email: iagmail@ott.ru
Researcher, Laboratory of Microbiology Russian Federation

Elena V Shipitsina

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: iagmail@ott.ru
PhD, Senior Researcher, Laboratory of Microbiology Russian Federation

Yulia A. Savochkina

Central Research Institute for Epidemiology

Email: aguschn@pcr.ru
PhD, Senior Researcher, Laboratory for Molecular Diagnostic and Epidemiology of Reproductive Tract Infections Russian Federation

Olga Yu. Timoshina

Central Research Institute for Epidemiology

Email: aguschn@pcr.ru
Reseach Assistant, Laboratory for Molecular Diagnostic and Epidemiology of Reproductive Tract Infections Russian Federation

Elena V. Rybina

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: iagmail@ott.ru
Bacteriologist, Laboratory of Microbiology Russian Federation

Alexander E. Gushchin

Central Research Institute for Epidemiology

Email: aguschn@pcr.ru
PhD, Head of the Laboratory for Molecular Diagnostic and Epidemiology of Reproductive Tract Infections Russian Federation

Alevtina M. Savicheva

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: savitcheva@mail.ru
MD, Professor, Head of Laboratory of Microbiology Russian Federation

References

Supplementary files