ULTRASTRUCTURAL CHARACTERISTICS OF THE REMODELING VENTRICULAR ELECTRIC PATHWAYS BETWEEN CARDIOMYOCYTES AFTER THE INFLUENCE OF CHRONIC PRENATAL HYPOXIA IN EXPERIENCE

Full Text

Нарушение функционального состояния плода, которое развивается в ответ на снижение парциального давления кислорода в крови, в современной акушерской терминологии обозначается как «дистресс плода». Среди основных причин возникновения хронической внутриутробной гипоксии можно выделить экс-трагенитальную патологию матери (наличие заболеваний бронхо-легочной и сердечно-сосудистой систем, анемии, вредные привычки), нарушение структуры плаценты и процессов микроциркуляции в ней, а также постплацентарные факторы (патология пуповины, многоплодная беременность, гемолитическая болезнь плода и др). Воздействие гипоксии во время беременности влечет за собой значительные нарушения в развитии плода и отражается на состоянии сердечно-сосудистой системы. Известно, что в результате гипо-ксического повреждения миокарда могут возникать изменения электрического и механического сочленения кардиомиоцитов, что способствует развитию летальных аритмий [1, 2, 3, 5]. Собственно арит-могенез зависит от множества активных и пассивных факторов. Активные свойства включают в себя трансмембранные ионные потоки и кинетику каналов, а пассивные - внутри- и межклеточное сопротивление, распределение нексусов, степень фиброза и геометрию клетки [6]. Понимание механизмов, которые лежат в основе нарушения нормального распределения коммуникативных контактов в ответ на воздействие хронической пренатальной гипоксии, может стать основой для разработки новых терапевтических методов лечения и антенатальной профилактики состояний, связанных с нарушением электрической кооперации кардиомиоцитов желудочков сердца. Цель работы - определение влияния хронической пренатальной гипоксии на ремоделирование щелевых контактов кар-диомиоцитов в миокарде желудочков крысы на этапах постнатального онтогенеза. 7 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2014 г. Материалы и методы Во время экспериментально -морфологического анализа в качестве объекта исследования использовали сердца зрелых белых беспородных крыс-самок и их потомства. Моделирование хронической пренатальной гипоксии по смешанному типу у крыс экспериментальной группы (92 животных) проводили путем в/б введения 1%-ного водного раствора NaNO2 в расчете 50 мг/кг массы тела с 10-го по 21-й день беременности. В качестве контроля использовали интакт-ных здоровых крыс на соответствующих сроках постнатального онтогенеза (84 животных). Содержание животных в условиях вивария и проведение эксперимента соответствовало «Общим этическим принципам экспериментов на животных» (Киев, 2001) и Закону Украины «О защите животных от жестокого обращения» (от 15.12 2009 года № 1759-VI). Для морфологического исследования использовали интрамуральную зону миокарда правого и левого желудочков (ПЖ, ЛЖ). Анализ контактных структур типичных кардиомиоцитов (КМЦ) проводили дифференцированно в продольной и поперечной ориентациях клеток. Обработку полученного материала проводили согласно общепринятым правилам методов световой и электронной микроскопии [4]. Анализ ультраструктурных изменений кардиомиоцитов в норме и после воздействия пренатальной гипоксии осуществляли в лаборатории электронной и световой микроскопии кафедры гистологии (ГУ «ДМА МЗ Украины») с помощью трансмиссионного электронного микроскопа ПЭМ-100-01 («SELMI», Украина) при ускоряющем напряжении 75-85 кВ и первичных увеличениях от 1500 до 80000. Для количественной оценки проводили анализ динамики изменений удельной (%) и средней длины нексусов (мкм), их численной плотности (*10-2 мкм-1), удельного количества длинных (>3 мкм) нексусов (%), численной плотности кольцевых нексусов (х10-2 мкм-1). Последний показатель рассчитывали как количество кольцевых профилей нексусов, не контак тирующих с сарколеммой, на 100 мкм суб-сарколеммального пространства. Определение достоверности различий между выборками осуществляли с учетом парного t-критерия Стьюдента. В случае отсутствия нормального статистического распределения величин использовали непараметрический критерий Уилкоксона. Результаты и их обсуждение Во вставочных дисках интактного желудочкового миокарда определялись два вида щелевых контактов: малые дисковидные нексусы внутри складчатого сегмента вставочного диска наряду с пальцевидными отростками клеточной адгезии (fascia adhaerens), соединяющие клетки конец-в-конец, и длинные лентообразные нексусы (>3 мкм) - в межскладчатом участке вставочного диска, расположенные на латеральной границе складчатого сегмента и своим длинником ориентированные перпендикулярно оси волокна. Это соответствовало современным представлениям [7, 8] о том, что в интактном миокарде наблюдается анизотропное распределение длин профилей нексусов в поперечной и продольной ориентациях (рис. 1, 2). В результате воздействия хронической пренатальной гипоксии данная разнородность распределения нексусов подвергалась значительным изменениям. Морфометрический анализ динамики изменений удельной длины нексусов в поперечной и продольной ориентациях сократительных КМЦ ЛЖ крыс в ответ на воздействие хронической пренатальной гипоксии позволил установить наличие ряда статистически значимых отличий показателя (рис. 3). Начиная с 7-х суток постнатального онтогенеза значение параметра в поперечной ориентации КМЦ было достоверно ниже нормы (на 38,5%), а на 30-е сутки жизни уступало контрольным значениям на 31,2% (p<0,05). По мере усложнения геометрии вставочного диска статистически значимое отставание параметра от уровня нормы также отмечалось при анализе продольной ориентации КМЦ. Пик этой достоверной разницы наблюдался в начале третьей недели постна- 8 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2014 г. Рис. 1. Участок вставочного диска в миокарде желудочков крысы на 30-е сутки постнатального развития. Продольная ориентация КМЦ. А. ЛЖ, норма. Малые дисковидные нексусы в складчатом сегменте вставочного диска (черная стрелка) и длинные лентообразные нексусы в межскладчатом участке (белые стрелки). χ 15000. Б. ПЖ, гипоксия. Стрелкой обозначен профиль нексуса в межскладчатом сегменте вставочного диска. χ22000 Рис. 2. Поперечная ориентация КМЦ ЛЖ крысы на 14-е сутки постнатального развития. А. Норма. Стрелкой обозначен длинный лентообразный нексус. χ32000. Б. Гипоксия. Стрелкой обозначен короткий профиль нексуса. χ25000 9 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2014 г. тального развития и составлял -48,9%, что объяснялось более активными процессами торцевания нексусов в норме в сравнении с экспериментом. В зрелом возрасте уровень показателя в группе контроля преобладал в поперечной ориентации (на 32,8%; p<0,05) и достоверно не отличался от значений экспериментальной группы. Среди крыс, подвергавшихся воздействию хронической гипоксии, уровень показателя при сравнении обеих взаимно перпендикулярных ориентаций был на 29,4% (p<0,05) выше в поперечной плоскости. Рис. 3. Динамика изменений удельной длины нексусов (%) в поперечной и продольной плоскостях среза КМЦ ЛЖ крысы на этапах постнатального онтогенеза в норме и после действия хронической пренатальной гипоксии. * - достоверная разница (p<0,05) в сравнении продольной плоскостью среза КМЦ; ** - достоверная разница (p<0,05) в сравнении с показателями нормы Динамика изменений удельной длины нексусов в миокарде ПЖ была сходной, а уровень показателя не имел достоверных отличий при сопоставлении с ЛЖ (рис. 4). Динамика нарастания средней длины нексусов в постнатальном онтогенезе также характеризовалась наличием достоверных отличий величины показателя при анализе ортогональных ориентаций КМЦ ЛЖ в обеих исследуемых группах (рис. 5). В норме статистически значимое преобладание средней длины нексуса в поперечной плоскости в сравнении с продольной ориен тацией отмечалось с 7-х суток жизни и составляло 55,8% (p<0,05), а величина показателя в поперечной плоскости в эксперименте была ниже, чем в контроле на 31,3% (p<0,05). На последующих этапах исследования наблюдалось нарастание значения параметра с сохранением указанной тенденции. В зрелом возрасте уровень показателя в поперечной ориентации КМЦ был достоверно выше значений в продольной плоскости в обеих группах исследования. Изменения и уровень показателя в ПЖ был аналогичен таковым в ЛЖ (рис. 6). 10 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2014 г. 1 сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки 30 сутки Зрелые ПНорма (продольная) ^ Норма (поперечная) □ Гипоксия (продольная) □ Гипоксия (поперечная) Рис. 4. Динамика изменений удельной длины нексусов (%) в поперечной и продольной плоскостях среза КМЦ ПЖ крысы на этапах постнатального онтогенеза в норме и после действия хронической пренатальной гипоксии. * - достоверная разница (p<0,05) в сравнении продольной плоскостью среза КМЦ; ** - достоверная разница (p<0,05) в сравнении с показателями нормы 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки 30 сутки □ Норма (продольная) ΞНорма (поперечная) □ Гипоксия (продольная) □ Гипоксия (поперечная) Зрелые Рис. 5. Динамика изменений средней длины нексусов (мкм) в поперечной и продольной плоскостях КМЦ ЛЖ крысы на этапах постнатального онтогенеза в норме и после действия хронической пренатальной гипоксии. * - достоверная разница (p<0,05) в сравнении с продольной плоскостью среза КМЦ; ** - достоверная разница (p<0,05) в сравнении с показателями нормы 11 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2014 г. Рис. 6. Динамика изменений средней длины нексусов (мкм) в поперечной и продольной плоскостях КМЦ ПЖ крысы на этапах постнатального онтогенеза в норме и после действия хронической пренатальной гипоксии. * - достоверная разница (p<0,05) в сравнении с продольной плоскостью среза КМЦ; ** - достоверная разница (p<0,05) в сравнении с показателями нормы Изучение динамики изменений численной плотности нексусов в миокарде ЛЖ и ПЖ выявило существенное снижение уровня показателя в экспериментальной группе крыс в сравнении с нормой, начиная с 14-х суток постнатального развития (рис. 7, 8). При этом достоверной разницы величин параметра при сопоставлении двух ортогональных плоскостей не выявлялось в обеих группах исследования. На 30-е сутки онтогенеза значение исследуемого показателя в продольной плоскости КМЦ ЛЖ уступало норме на 30,1% (p<0,05), а в поперечной - на 27,6% (p<0,05). В ПЖ величина параметра на указанном сроке была на 28,3% и 23,1% (p<0,05) ниже контроля в продольной и поперечной плоскостях соответственно. В зрелом желудочковом миокарде отставание уровня показателя в эксперименте не имело статистически значимого уровня в обеих анализируемых ориентациях. Морфометрический анализ численной плотности кольцевых нексусов в миокарде ЛЖ выявил статистически значимую интенсификацию (активацию) процессов интернализации соединительной мембраны щелевых контактов и образование эндоцитозных транспортных форм со второй недели постнатальной жизни (рис. 9). На 7-е сутки значение показателя превышало уровень нормы на 42,3% (p<0,05) и составляло 10,12±1,52 на 100 мкм субсарколеммальной зоны и являлось пиковым для данной экспериментальной группы. На 30-е сутки величина параметра преобладала над значениями контрольной группы на 69,7% (p<0,05). В ПЖ увеличение численной плотности кольцевых нексусов опережало ЛЖ и отмечалось с 3-х суток постнатальной жизни, что было связано, на наш взгляд, с выраженными изменениями гемодинами-ческих условий, обусловленных включением внешнего дыхания. При этом значение показателя на данном сроке было достоверно выше, чем в ЛЖ (на 54,5% в контрольной и на 81,6% в экспериментальной группе). Преобладание уровня параметра в группе животных, перенесших воздействие пренатальной гипоксии, над значениями нормы наблюдалось с 7-х по 30-е сутки постнатальной жизни и варьировало от 59,6% до 80,8% (p<0,05). В зрелом возрасте статистически значимой разницы значений показателя в обеих исследуемых группах выявлено не было. 12 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2014 г. Рис. 7. Динамика изменений численной плотности нексусов (*10‘2 мкм-1) в поперечной и продольной плоскостях среза КМЦ ЛЖ крысы на этапах постнатального онтогенеза в норме и после действия хронической пренатальной гипоксии. * - достоверная разница (p<0,05) в сравнении с показателями нормы 1 сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки 30 сутки Зрелые И Норма (продольная) ^ Норма (поперечная) О Гипоксия (продольная) □ Гипоксия (поперечная) Рис. 8. Динамика изменений численной плотности нексусов (*10‘2 мкм-1) в поперечной и продольной плоскостях среза КМЦ ПЖ крысы на этапах постнатального онтогенеза в норме и после действия хронической пренатальной гипоксии. * - достоверная разница (p<0,05) в сравнении с показателями нормы 13 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2014 г. 14 12 10 8 6 4 2 1 сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки 30 сутки Зрелые □ ЛЖ (норма) ^ПЖ (норма) 0ЛЖ (гипоксия) □ ПЖ (гипоксия) 0 Рис. 9. Динамика изменений численной плотности кольцевых нексусов (*10-2 мкм-1) в миокарде ЛЖ и ПЖ крысы на этапах постнатального онтогенеза в норме и после действия хронической пренатальной гипоксии. * - достоверная разница (p<0,05) в сравнении с показателями нормы; ** - достоверная разница (p<0,05) в сравнении с ЛЖ В результате воздействия хронической пренатальной гипоксии отмечалось сокращение функционально активной порции нексусов, что, начиная с 7-х суток постнатального онтогенеза, проявлялось достоверным снижением показателей удельной и средней профильной длины нексусов на 31,2% и 23,6% (p<0,05) соответственно в ЛЖ и на 34,4% и 26,2% (p<0,05) в ПЖ. Подобная тенденция сохранялась вплоть до 30-х суток жизни. При анализе изучаемых показателей дифференцированно в двух ортогональных плоскостях миокарда выявлялась различная динамика изменений параметров в ответ на воздействие экспериментального фактора. Так, в норме наибольшая удельная и средняя длина нексусов обнаруживалась в поперечной плоскости среза в сравнении с продольной за счет подгруппы длинных нексусов. В экспериментальной группе с 7-х по 30-е сутки жизни значения параметров были статистически неотличимыми в поперечной и продольной плоскостях в результате выраженного сокращения их величины в поперечной ориентации. Подобная потеря анизотропности распределения щелевых контактов была связана с нарушением и уязвимостью длинных нексусов, которые практически отсутствовали. При сопоставлении продольных плоскостей в обеих группах исследования значительной разницы обнаружено не было: средняя длина нексусов статистически значимо не изменялась в результате воздействия пренатальной гипоксии. Это объясняется тем, что короткие оси лентообразных щелевых контактов имели длину менее 1 мкм и избирательное их разрушение в условиях эксперимента не приводило к уменьшению средней длины нексуса, но отражалось на удельной длине и численной плотности нексусов. Также к 30-м суткам постнатального онтогенеза отмечалось снижение численной плотности нексусов относительно уровня нормы на 27,8% (p<0,05) в ЛЖ и на 25,6% (p<0,05) в ПЖ, что было обусловлено нарушением формирования преимущественно длинных нексусов. Так, удельное их количество на 30-е сутки нормального постнатального онтогенеза составляло 9,32±0,67% в ЛЖ и 14 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №3, 2014 г. 8,17±1,02% в ПЖ. В свою очередь, в экспериментальной группе значение показателя достигало значительно меньшего уровня - 1,86±0,22% и 1,47±0,19% в левом и правом отделах желудочкового миокарда соответственно. В зрелом возрасте отставание от нормы исследуемых показателей не имело статистически значимой степени в обеих анализируемых ориентациях среди животных экспериментальной группы. Подобное избирательное разрушение длинных нексусов, зачастую локализованных на периферии вставочного диска и с одной стороны контактирующих с интактной несоединительной сарколеммой, объясняется большей, чем короткие нексусы, подверженностью механическим силам, ассоциированным с аккумуляцией интерстициальной ткани. Таким образом, уменьшение удельной и средней длины, численной плотности нексусов в желудочковом миокарде крысы, а также их пространственное перераспределение (латерализация), о котором мы упоминали в нашей прошлой работе [3], может приводить к формированию выраженной гетерогенности (неоднородности) потенциала покоя и потенциала действия, скорости и продолжительности проведения импульса, изменению рефрактерного периода, а также к асинхронному сокращению кардиомиоцитов и слабой силе желудочков, что в своей совокупности является основой для возникновения очагов с аритмогенной активностью. Механизмы, лежащие в основе редукции плотности распределения нексусов и, как следствие, нарушения проводимости, в результате внутриутробной гипоксии, вероятно, связаны со снижением уровня экспрессии Сх43 и повышением деградации и/или миграции его в области, которые не участвуют в межклеточной коммуникации («внеконтактные зоны»). Выводы Начиная с 7-х суток постнатального онтогенеза в экспериментальной группе животных отмечается сокращение удельной и средней длины нексусов в миокарде обоих желудочков в сравнении с нормой, что к 30-м суткам также проявляется снижением численной плотности нексусов вставочного диска относительно уровня контроля на 27,8% (p<0,05) в ЛЖ и на 25,6% (p<0,05) в ПЖ. Подобное сокращение функционально активной порции нексусов в ответ на воздействие хронической пренатальной гипоксии обусловлено преимущественным нарушением формирования длинных нексусов, удельное количество которых на 30-е сутки онтогенеза составляет 9,32±0,67% в ЛЖ и 8,17±1,02% в ПЖ в норме, а в экспериментальной группе - 1,86±0,22% и 1,47±0,19% в левом и правом отделах желудочкового миокарда соответственно. Это приводит к нарушению анизотропности распределения нексусов в желудочковом миокарде крыс.

References

Supplementary files