Associations of acrocentric chromosomes in small-for-date newborns from different ecological zones of Precarpathia

Full Text

В связи с увеличением техногенного загрязнения окружающей среды в цитогенетике человека все большее значение приобретает изучение хромосомных и геномных мутаций, возникновение которых связывают с влиянием радионуклидов и химических веществ [6]. Достигнутые успехи при изучении генома человека позволили расшифровать последовательность нуклеотидов ДНК, установить количество генов, их структуру. Вместе с тем остается актуальным вопрос определения механизмов реализации генетической информации, их регуляции [8]. Именно этому направлению функциональной геномики посвящены современные исследования состояния хроматина интерфазных ядер, ядрышкового аппарата и ядрышкообразующих районов акроцентрических хромосом [1, 4]. Классические работы по цитогенетике доказали, что короткие плечи акроцентрических хро мосом представлены гетерохроматиновыми районами [9]. Они образованы тремя участками: 1) коротким сегментом, прилегающим непосредственно к центромере; 2) нитью - вторичной перетяжкой короткого плеча; 3) маленьким компактным тельцем -спутником, который содержит теломер короткого плеча акроцентрической хромосомы. Ассоциации акроцентрических хромосом (ААХ) связанны с привлечением перетяжек (районов спутниковых нитей, формирующих ядрышко). Благодаря гомологическим локусам гетерохроматиновых районов этих хромосом происходит их конъюгация, которая предопределяет и стимулирует ассоциации акроцентриков. Учитывая, что в гетерохроматиновых районах локализируются ядрышковые организаторы с генами 28 s и 18 s рибосомной РНК, изменения ААХ могут коррелировать с активностью метаболизма клетки. 8 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №1, 2014 г. Исследованию закономерностей образования ассоциаций акроцентрических хромосом (ААХ) человека посвящено много работ [3, 5, 12-13]. Были изучены количество и групповая принадлежность ассоциированных хромосом, явления ассоциаций акроцентриков со специфическими районами других хромосом. Изменчивость частоты ААХ приводит к нарушению иммунологического статуса организма и коррелирует с частотой хромосомных аберраций. В современной перинатологии важнейшей проблемой является установление факторов риска и патогенетических механизмов гипоксии плода, пренатальной диагностики синдрома задержки внутриутробного развития (ЗВУР), которые обусловливают наиболее весомые перинатальные последствия заболевания [7]. Для оценки учета цитогенетических аномалий в формировании этих патологиче ских состояний, необходимо глубокое изучение индивидуальной и внутригрупповой изменчивости наследственного аппарата. Учитывая вышесказанное, целью работы было установление частоты ассоциаций акроцентрических хромосом у здоровых новорожденных и новорожденных со ЗВУР из разных экологических регионов Прикарпатья. Материалы и методы Распределение территорий Ивано-Франковской области на экологические зоны проводилось на основании экологического паспорта области, данных исследований экологического состояния Украины [11]. Материалом для исследования была пуповинная кровь 174 здоровых новорожденных и 152 новорожденных с задержкой внутриутробного развития из разных районов Ивано-Франковской области (табл. 1). Таблица 1 Распределение новорожденных Ивано-Франковской области в зависимости от экологических условий проживания Исследуемые группы Экологические зоны Экологического комфорта, n = 119 Химического загрязнения, n = 110 Радиационного загрязнения, n = 97 Здоровые новорожденные, n = 174 54 62 58 Новорожденные со ЗВУР, n =152 65 48 39 Проведение цитогенетического анализа новорожденных базировалось на исследовании кариотипа лимфоцитов пуповинной крови. Материал забирали стерильными шприцами с добавлением 0,01 мл гепарина, помещали в сумку-термос (t = 5-7 °С) и в течение 1-2 часов доставляли в аккредитованную генетическую лабораторию ГВУЗ «Ивано-Франковский национальный медицинский университет». Культивирование лимфоцитов и приготовления препаратов хромосом проводилось с помощью реактивов PB MAX фирмы Gibco по методическим рекомендациям, утвержденным МЗ Украины [2]. Окраску метафазных пластинок осуществляли GTG-методом. Исследование изготовленных препаратов проводили на оптикоэлектронном комплексе «Метаскан-2». Анализировали метафазные пластинки с хорошим разбросом хромосом. От каждого ребенка проанализированы не менее 30 метафазных пластинок, на которых идентифицировали количество ААХ. Учитывалась специфичность размещения акроцентричных хромосом в метафазе: отсутствие наложения хромосом, короткие плечи акроцентриков ориентированные друг к другу и расстояние между ними без учета спутников (сателлитов) не превышает размера длинного плеча хромосомы из группы G, большее расстояние принималось за ассоциацию, если акро-центрики были связаны видимыми нитями или лежали на одной хромосомной оси [10]. Вычисляли ассоциативный индекс как отношение количества клеток с ассоциациями к общему количеству про 9 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №1, 2014 г. анализированных клеток, в пересчете на 100 %. Также определили среднее число ААХ в одной клетке и среднее число хромосом в одной ассоциации. Статистический анализ различий по группам проводили используя t-критерий Стьюдента. Результаты и их обсуждение Ассоциации акроцентрических хромосом изучались как маркер адаптивных возможностей и иммуногенетического статуса организма. При отсутствии половых отличий отмечены вариации частоты ААХ во всех группах исследуемых в зависимости от места жительства матерей. Следует отметить, что в лимфоцитах пуповинной крови, стимулированных мито-геном фетгемаглютинином к пролиферации, определено неодинаковое количество ААХ. Средняя частота ассоциаций на клетку у здоровых новорожденных колебалась от 1,32 до 1,60. Этот показатель преобладал у здоровых новорожденных из зон химического и радиационного загрязнения соответственно в 1,16 и 1,21 раза по сравнению с таковыми из зоны экологического комфорта. При этом отмечено изменение количества ассоциированных акроцентриков в клетке, а также количества акроцентрических хромосом в ассоциации в зависимости от зоны проживания. Частота клеток с ААХ у здоровых новорожденных из зон химического и радиационного загрязнения превышала таковую у новорожденных из зоны экологического комфорта (р<0,05). Отмечена тенденция к увеличению ассоциативного индекса и количества хромосом в одной ассоциации у новорожденных из неблагоприятных экологических зон по сравнению с зоной комфорта. Число ассоциированных хромосом в одной клетке было большим у новорожденных из зон химического и радиационного загрязнения соответственно в 1,64 та 1,59 раза чем у здоровых новорожденных из зоны экологического комфорта (р<0,05). Анализ ассоциаций акроцентриче-ских хромосом в лимфоцитах пуповинной крови новорожденных с ЗВУР показал, что средняя частота ассоциаций на клетку колебалась от 1,42 до 1,66. Этот показатель преобладал у новорожденных с ЗВУР из зон химического и радиационного загрязнения соответственно в 1,14 и 1,16 раза по сравнению с таковыми из зоны экологического комфорта. Обнаружена тенденция к увеличению частоты клеток с ААХ у новорожденных из зон химического и радиационного загрязнения по сравнению из зоной комфорта (р<0,05). Ассоциативный индекс у новорожденных с ЗВУР из зон химического и радиационного загрязнения превышал таковой из зоны экологического комфорта в 1,28 и 1,35 раза соответственно (р<0,05). Количество хромосом в одной ассоциации у детей с ЗВУР из зоны экологического комфорта было меньше в 1,23 и 1,3 раза по сравнению с таковым у новорожденных из зон химического и радиационного загрязнения соответственно. Количество ассоциированных хромосом в одной клетке практически не отличалось у новорожденных с ЗВУР из неблагополучных зон, но в 1,5 раза превышало такое же из зоны экологического комфорта (р<0,05). Установлена тенденция к увеличению частоты клеток с ААХ у здоровых новорожденных и новорожденных с ЗВУР из зон с неблагоприятными экологическими условиями загрязнения по сравнению с детьми из зоны экологического комфорта. Частота ААХ у новорожденных с синдромом ЗВУР в исследуемых экологических зонах была выше чем у здоровых новорожденных в зоне экологического комфорта, химического и радиационного загрязнения на 3,91, 3,0 и 2,07 %, соответственно по сравнению с соответствующими группами здоровых новорожденных. Анализ среднего количества ААХ в одной клетке обнаружил тенденцию к увеличению данного показателя во всех исследуемых регионах у новорожденных с ЗВУР по сравнению с таковым у здоровых новорожденных. При этом отмечено изменение количества ассоциированных групп акроцентриков в клетке, а также количества акроцентрических хромосом в ассоциации (рис.). 10 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №1, 2014 г. . д Уь.'&ъг&Х rJ s* . h < ч# Ц Л Г * У ^ · 4 if " - £ ■«. t· w/ L ^ »t // V ß?. « Ή* ;ії , Ы і· г. ае , ' ,-vv %3 -а* 1 Ь>0 ’ ‘ J % *, fti r/х^ « ,-р äJ! М@\Г*Л А # М'§^ #%v · ... % '■ -Л ?·■'ίΛ В* % 7-і г . .4 -Щг. &з А Б Рис. Ассоциации акроцентрических хромосом (|) в метафазных пластинках пуповинной крови: А - здорового новорожденного ребенка М., Б - новорожденного с синдромом ЗВУР Н. из зоны с неблагополучными экологическими условиями. Окраска по Гимзе. Микрофотографии. Ув.: ок. 15х, об. 90х. Обозначения: (|)1 - ААХ между группами D и G; 2 - ААХ между хромосомами группы D; 3 - ААХ между хромосомами группы G Важным фактом является то, что общее количество ассоциированных хромосом в клетке характеризует их ассоциативную способность объективнее, чем другие показатели ААХ [10]. В некоторых метафазах акроцентрические хромосомы вступали в ассоциации не только между собой, но и с прицетромерными участками первой и второй хромосом, где размещена вторичная перетяжка. Подобную картину наблюдали другие авторы, выявляли наличие ассоциаций коротких плеч спутниковых хромосом со специфическими районами хромосом 1, 2, 9, 16 [10, 15]. Такая особенность может быть обусловлена функциями ДНК гетерохроматиновых районов и свидетельствовать в пользу конъюгационной гипотезы образования ААХ. Большие различия по этому признаку между гомологическими и негомологическими хромосомами обусловливают вариабельность ААХ. Хромосомы с длинной нитью спутника вступают в ассоциации с большей частотой, чем хромосомы с короткой спутниковой нитью. Хромосомы, имеющие короткие ядрышковые перетяжки, делецию корот кого плеча, не содержат вторичной перетяжки и редко участвуют в ассоциациях [5]. Из этого следует, что морфологические изменения спутниковой нити взаимосвязаны с активностью ядрышковых организаторов - количеством и активностью локализованных в нем рибосомных генов. Их делеция или инактивация сопровождаются снижением способности акроцентрических хромосом к ассоциации, что было подтверждено методом гибридизации in situ и методом серебрения [14]. Кроме того, эктопическая конъюгация гетерохроматиновых участков в метафазе, кроме ААХ, проявляется близким размещением гомологических хромосом, специфической группировкой некоторых негомологичных хромосом, ААХ с районами вторичных перетяжек хромосом 1, 2, 16, 9 и с теломерами других хромосом. Следующим этапом работы было исследование ассоциативной способности хромосом в зависимости от их групповой принадлежности. В каждой группе наибольшую способность к ассоциациям имели хромосомы 21 (22,11 %), 13 (21,62 її Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №1, 2014 г. %) и 14 (20,96 %), наименьшую - хромосомы 15 (18,04 %) и 22 (17,27 %). Стоит отметить, что количество ассоциированных хромосом группы D превышала таковую группы G. При анализе особенностей формирования парных ассоциаций среди хромосом группы D достоверных различий не выявлено. Среди хромосом групп DG преимущественно ассоциировали хромосомы 13 и 21. Другие хромосомы объединены с одинаковой частотой, хотя хромосома 21 чаще ассоциировала с хромосомами группы D, чем хромосома 22. Кроме того, в комбинациях хромосом группы G также отмечена большая тенденция к ассоциированию хромосомы 21 по сравнению с хромосомой 22. Последнее можно объяснить тем, что в интерфазном ядре формируются спутниковые ассоциации в течение длительного периода конъюгации гомологических локусов гетерохроматиновых районов спутниковых нитей, которые переносятся посредством митоза и регистрируются на мета-фазных пластинках [3]. Вероятно, гетерохроматиновые участки хромосомы 21 имеют больше гомологических локусов с хромосомами группы D, поэтому они чаще объединялись. Интересным оказался тот факт, что рост индекса D/G в группе новорожденных с ЗВУР происходил за счет увеличения ассоциативной способности хромосом группы D. Это можно объяснить только с позиций конъюгаци-онной гипотезы. Вероятнее, ААХ с хромосомами группы G в каждом следующем делении быстрее элиминировались. При 72-часовом культивировании на препаратах встречались метафазы, которые получены менее чем от двух делений, имеющие разное количество ААХ. Поэтому идеальный вариант изучения комбинаций различных хромосом в ААХ заключается в дифференцировании с помощью 5-бромдезоксиуридина клеток, находящихся в одном делении. Полученные результаты частоты ААХ коррелировали с показателями частоты ХА (г колебался от 0,68 до 0,84), что подтвердило негативное влияние экологических условий проживания на иммуногенетический статус и адаптивные возможности человека. Выводы 1. Частота ассоциаций акроцентрических хромосом у новорожденных с синдромом задержки внутриутробного развития в исследуемых экологических зонах была выше на 3,91, 3,0 и 2,07 %, чем у здоровых новорожденных в зоне экологического комфорта, химического и радиационного загрязнения соответственно. 2. Анализ среднего количества ассоциаций акроцентрических хромосом в одной клетке обнаружил тенденцию к увеличению данного показателя во всех исследуемых регионах у новорожденных с задержкой внутриутробного развития по сравнению с таковым у здоровых новорожденных.

References

Supplementary files