Characteristic of p-glycoprotein as a drug peptide transporter

Abstract

Review characterizes the urgency of problem, chemical properties of P-glycoprotein substrates, structure, functions, localization of peptide transporter, factors influencing P-glycoprotein activity.

Full Text

Современная фармакотерапия большинства заболеваний включает многочисленные лекарственные средства синтетического и природного происхождения. Накопилось достаточно данных о возможности фармакокинетического взаимодействия между ними на этапе биотрансформации в организме [3]. Для прогнозирования фармакокинетического взаимодействия лекарственных препаратов в процессе всасывания, распределения и экскреции, также необходимо знать потенциальную возможность веществ влиять на транспортные системы организма, в том числе гликопротеин-Р (Pgp) и изменять его функциональную активность. Это позволит исключить неэффективность фармакотерапии и нежелательные реакции лекарственных средств, связанные с изменением их концентрации в плазме крови. Проблема становится особенно актуальной из-за полипрагмазии, столь характерной для рутинной клинической практики. Для того чтобы предотвращать сложные клинические ситуации, необходимо повысить информированность врачей, провизоров и пациентов по данному вопросу, а также наладить систему экспертизы применяемых и регистрируемых препаратов на предмет их воздействия на метаболические и транспортные системы. Транспортеры, принадлежащие к ABC (Adenosine triphosphat binding cassette)-суперсемейству поддерживают химический гомеостаз, опосредуя транспорт молекул через клеточные мембраны вне зависимости от концентрационного градиента. ABC-транспортеры кодируются 48 генами человеческого генома, которые объединены в семь подсемейств (ABCA – ABCG), исходя из сходства нуклеотидных последовательностей. Эти гены кодируют мембранные белки с широким диапазоном субстратной специфичности и субклеточной локализации. Среди данных генов наиболее изученным является ABCB1 (MDR1) [36], в связи с тем, что именно он кодирует Pgp [35]. Семейство MDR включает два гена человека (MDR1 и MDR2) и три гена грызунов (mdr1, mdr2, mdr3). В гене имеется две области промоторов. Один промотор функционирует в нормальных тканях, в то время как активность второго выявляется в ткани опухолей, устойчивых к лекарственной терапии [42]. Белки транспортеры, родственные Pgp, обнаружены также у ряда бактерий, например микобактерий туберкулеза [10], и грибов, например, Candida albicans [11], где они играют ключевую роль в формировании устойчивости к противотуберкулезной и противогрибковой терапии соответственно. Ген MDR1, кодирующий Pgp, обладает полиморфизмом. В настоящее время активно изучается клиническое значение четырех аллельных вариантов, представляющих замену в нуклеотидной последовательности ДНК одного нуклеотида на другой – так называемые полиморфизмы одного нуклеотида (single nucleotide polymorphism). Два из них (G2677T и G2677A в 21 экзоне) являются структурными полиморфизмами, т. е. приводят к изменениям в аминокислотной последовательности. Полиморфизмы C1236T (в 12 экзоне) и C3435T (в 26 экзоне) не приводят к аминокислотным заменам, однако вызывают изменение экспрессии данного гена [1]. Так, известно, что у лиц с генотипом TT отмечается низкая экспрессия гена MDR1, в результате чего у них снижено количество Pgp в кишечнике, печени, почках и эндотелии гематоэнцефалического барьера [13]. Если лекарственные средства, являющиеся субстратами Pgp, имеют малую широту терапевтического действия, то сниженная активность транспортера у лиц с генотипом 3435TT может иметь клинические последствия, проявляющиеся развитием нежелательных лекарственных реакций или высоким риском их возникновения. По данным научной литературы изменение экспрессии иРНК гена MDR1 не всегда коррелирует с изменением экспрессии самого белка-транспортера и может быть результатом различий в транскрипционных и трансляционных процессах [16]. Субстраты Pgp – вещества структурно разнородные, однако, у них есть схожие свойства. Pgp переносит преимущественно липофильные ароматические соединения с молекулярной массой 300 – 500 Д и вещества, имеющие аминогруппу [4] или атом азота, положительно заряженный при физиологических значениях pH, и водородные связи в молекуле [37]. Причем, чем липофильнее молекула и, чем больше в ней водородных связей, тем большим сродством к Pgp обладает соединение [21]. Абсолютное большинство ABC-транспортеров требует энергии в форме АТФ для транспортировки лигандов через клеточную мембрану. Для их функционирования необходимо наличие как минимум четырех доменов: два трансмембранных домена (ТМД), формирующих лиганд-связывающие сайты, и два нуклеотидсвязывющих домена (НСД), связывающих и гидролизующих АТФ для осуществления транслокации субстрата. Pgp включает все 4 домена в одинарной полипептидной цепи. Он состоит из 1280 аминокислотных остатков, сгруппированных в 2 гомологичные половины, каждая по 6 трансмембранных сегментов, а также цитозольный НСД. Некоторые спирали ТМД предположительно формируют связывающий сайт и, следовательно, являются каналами, через которые субстраты пересекают мембрану. С другой стороны НСД аккумулирует энергию связей АТФ для транспорта веществ [39]. Причем для транспортировки одной молекулы субстрата необходим гидролиз двух молекул АТФ. Исследования с неспецифическими ингибиторами АТФазы (ванадатом и негидролизуемым аналогом АТФ AdoPP(NH)P) показали, что молекула АТФ – это не простой аллостерический активатор, и ее гидролиз является необходимым условием для транспортировки субстратов Pgp [17]. Исследования, проведенные на клеточных клонах, устойчивых к винкристину, выявили, что N-гликозилирование на первой экстрацеллюлярной петле Pgp необходимо для соответствующей направленной ориентации в пространстве и стабильности молекулы транспортера, но не играет решающей роли в транспортировке субстратов [28]. Локализация Pgp изучена в эспериментах с использованием иммуногистохимического анализа, метода Western-blotting, полимеразно-цепной реакции (ПЦР), а также специфических ингибиторов Pgp. Высокие уровни белка-транспортера были обнаружены в эпителии тонкого и толстого кишечника [8, 31], в проксимальных канальцах нефронов почек, желчевыводящих протоках гепатоцитов, протоках поджелудочной железы [8, 15], в трофобластах плаценты, скелетной и сердечной мускулатуре [15], в дерме, протоках потовых желез, сосудах кожи [30]. В большинстве тканей Pgp локализован на поверхности апикальной мембраны клеток, что подтверждает его функционировании в качестве насоса для физиологических метаболитов и ксенобиотиков. Только в надпочечниках белок распределен диффузно, и, значит, способен секретировать вещества в интерстициальное пространство. Функцией Pgp в клетках надпочечников является, очевидно, защита клеточных мембран от высокой локальной концентрации стероидов [2]. Pgp также локализован в эндотелии капилляров, формирующих гематоэнцефалический барьер, в астроцитах [33], и в других гистогематических барьерах (гематоовариальном, гематотестикулярном и гематоплацентарном) [1, 15, 25]. Pgp обнаружен во всех гемопоэтических предшественниках с самым высоким уровнем экспрессии в плюрипотентных стволовых клетках [9], а также в зрелых лимфоцитах периферической крови, в T-клетках и натуральных киллерах [34]. Связь экспрессии Pgp с наиболее ранними кроветворными предшественниками может отражать специальную роль Pgp в их защите от токсических субстратов и, возможно, от различных регуляторных факторов, провоцирующих дифференцировку или пролиферацию стволовых клеток [2]. С помощью мышиных моноклональных антител MRK16 не было выявлено наличие Pgp в легких, желудке, слюнных железах, коре головного мозга, мозжечке, спинном мозге, яичниках, матке, коже и селезенке. Таким образом, Pgp – это эффлюксный транспортер, контролирующий фармакокинетику различных соединений в физиологических условиях. Pgp рассматривается как белок с полиспецифичностью, так как он способен распознавать широкий спектр субстратов. Известен целый ряд соединений, которые in vitro оказывают как индуцирующее, так и ингибирующее влияние на функциональную активность Pgp [3]. Однако, изменение активности Pgp возможно не только в результате лекарственного взаимодействия с транспортером. Линейное возрастание функциональной активности Pgp наблюдалось также в результате экстрацеллюлярного ацидоза, возникающего вследствие смоделированной интермиттирующей гипоксии (8% O2) или введения молочной кислоты в опухоль крыс [6]. Сходные результаты получены и при ацидификации культуры клеток опухоли предстательной железы крыс, а также при понижении pH путем интенсификации анаэробного метаболизма у крыс in vivo [5]. Двухнедельное воздействие на крыс интермиттирующей дыхательной гипоксии приводило к повышению степени экспрессии Pgp в сердце, а также к увеличению количества иРНК гена MDR1 в печени и сердце, что было выявлено методом Western blotting и ПЦР [22]. Сходные результаты с Pgp, локализованным в печени, были получены и другими авторами [7]. В эксперименте на культуре эпителиальных клеток, подвергавшихся гипоксическому воздействию, обнаружено увеличение содержания мРНК гена MDR1 и возрастание количества самого транспортера. В культуре интактных клеток T84 наблюдалось повышение активности Pgp, выявленное путем анализа изменений степени ингибирования эффлюкса дигоксина и родамина 123 верапамилом [20]. Показано, что 24-часовое воздействие на культуру опухолевых клеток гипоксии при нормальном значении pH не привело к существенному изменению активности и степени экспрессии Pgp, тогда как экстрацеллюлярный ацидоз (pH=6,6) усилил Pgp-опосредованный выброс даунорубицина, причем этот эффект был даже более выражен, чем при совместном действии на клеточную культуру ацидоза и гипоксии [32]. Индуцированная гипоксией экспрессия Pgp может частично объяснить устойчивые к лекарственной терапии кардиоваскулярные заболевания у пациентов с обструктивными приступами апноэ во сне [22]. Существенную роль в процессе активации экспрессии гена MDR1 в условиях гипоксии отводится HIF-1α [14]. По современным данным HIF-1α состоит из двух субъединиц: α-субъединица ответственна за проникновения димера в нуклеоплазму, а β-субъединица связывается с элементом, ответственным за гипоксию Abcb1-промотора и оказывает на него регуляторное воздействие [23]. Однако, имеются сведения о том, что приобретение опухолевыми клетками устойчивости к химиотерапии в условиях гипоксии объясняется задержкой клеточного цикла на стадии G1; при этом активации Pgp не происходит [19]. Тиреоидные расстройства также могут провоцировать существенные изменения степени экспрессии Pgp. Установлено, что у пациентов с болезнью Базедова-Грейвса с повышенным уровнем свободных Т3 и Т4, экспрессия Pgp уменьшалась при увеличении длительности заболевания. Авторы получили корреляционную связь между экспрессией гена MDR1, уровнем ТТГ в крови и размером щитовидной железы по данным УЗИ [18]. У больных с патологией щитовидной железы обнаружены аномалии в фармакокинетике различных лекарственных препаратов, в том числе и субстратов Pgp. При гипертиреозе клиренс субстрата Pgp дигоксина был существенно снижен, однако его биодоступность, объем распределения, период полувыведения и степень связи с белками плазмы крови оставались неизменными [36]. В ранее выполненном исследовании установлено, что концентрация дигоксина снижалась у пациентов с гипертиреозом по сравнению пациентами с нормальной функцией щитовидной железы [29]. Изучение влияния левотироксина на экспрессию Pgp в кишечнике выявило, что экспрессия мРНК гена MDR1 в двенадцатиперстной кишке пациентов увеличивалась недостоверно, существенных нарушений фармакокинетики субстрата Pgp талинолола не обнаружено [12]. У пациентов с гипотиреозом при восстановлении функции щитовидной железы наблюдалось возрастание количества мРНК гена MDR1- в 1,8 раза и интенсификация эффлюкса родамина из клеток CD56(+) на 26% [36]. Выявлено, что у крыс с гипертиреозом экспрессия Pgp существенно повышалась в печени и почках, умеренно в тощей и подвздошной кишке. На основании анализа полученных данных авторы считают, что тироксин тканеспецифично и концентрационно-зависимо индуцирует экспрессию белка-транспортера [27]. Учитывая, что механизм действия тироксина связан с активацией ядерных рецепторов, индукция экспрессии Pgp в почках у крыс с гипертиреозом опосредуется увеличением транскрипции мРНК гена mdr1a. Однако, в печени крыс с гипертиреозом обнаружено значительное снижение экспрессии мРНК гена mdr1b, при отсутствии влияния на экспрессию мРНК гена mdr1a [38]. В исследовании на клетках карциномы толстого кишечника человека (LS180 и Сасо-2) выявлено, что на активность Pgp можно воздействовать гормонами щитовидной железы по прегнан – х – рецептор (PXR)-независимому механизму [24]. На культуре клеток с повышенной экспрессией MDR1 доказано, что Т3 выводится из клеток Pgp [26]. Аналогичные данные получены для Pgp в гематоэнцефалическом барьере. Показано, что белок – транспортер обеспечивает транспорт Т4 между спинно-мозговой жидкостью, хориоидальными сплетениями и мозгом, регулируя проникновение Т4 в спинно-мозговую жидкость [41]. В других исследованиях было высказано предположение об отсутствии влияния Pgp на выведение Т3. Например, верапамил ингибировал эффлюкс Т3 из культуры клеток линии MDCKII, которые не экспрессировали MDR-1. Авторы предположили, что обнаружили новый белок, чувствительный к верапамилу и ответственный за выведение Т3 из клеток. Было установлено, что выделенный из мембраны белок отличается от Pgp своей массой [40]. Выполненный анализ научной литературы позволяет предположить, что эндокринные расстройства и хронические заболевания, сопровождающиеся гипоксией, способны влиять на функциональную активность Pgp, что требует дальнейших исследований с целью подтверждения данной гипотезы. Таким образом, существует продиктованная практикой постоянная потребность в анализе и систематизации данных о Pgp, его субстратах, лекарственных средствах и других факторах, способных изменять активность белка-транспортера. Оценка экспериментальных и клинических данных по изучению транспортеров лекарственных веществ позволит повысить эффективность и безопасность фармакотерапии, улучшить практику использования лекарственных средств.