STUDY OF COMPOSITION, PHYSICAL AND CHEMICAL PROPERTIES AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF POLYSACCHARIDE COMPLEX OF ARCTIUM LAPPA LEAVES

Full Text

Растущий интерес к фитотерапии стимулируется за счет внедрения в научную медицину растений народной медицины и разработки новых фитопрепаратов на их основе.

Экстракты и отвары корня лопуха большого (Arctium lappa L.) и лопуха войлочного (Arctium tomentosum Mill) применяют как потогонное средство, используют при заболеваниях печени и желчного пузыря, как противоопухолевое и улучшающее обмен веществ; наружно - при экземах, фурункулезе, заболеваниях кожи головы [1]. В официальной медицине применение нашли только корни растения, а надземная часть остается невостребованной, поэтому листья лопуха являются перспективным сырьем для получения полисахаридного комплекса, изучения его физико-химических свойств и биологической активности [2].

В корнях лопуха большого содержится полисахарид инулин (до 50%), эфирное бар-дановое масло (до 0,18%), протеин (около 12%), витамины, минеральные вещества, жирные масла, дубильные вещества, флаво-ноиды, ириоидные гликозиды, ситостерин, стигмастерин, алкалоиды. Надземная часть растения не исследована, полисахариды, содержащиеся в стеблях и листьях растений не выделены и не изучены [3].

Особое внимание вызывают растительные полисахариды, обладающие высокой биологической активностью, являющиеся источником получения новых фармакологически активных веществ [4].

Целью работы являлось выделение полисахаридного комплекса из листьев лопуха большого, определение его моносахаридного состава, изучение некоторых физико-химических свойств и определение биологической активности в эксперименте.

Материалы и методы

Растения лопуха большого были собраны в период массовой бутонизации. Из измельченных воздушно-сухих листьев растения лопуха большого предварительной экстракцией 60%-ным и 40%-ным этанолом удаляли экстрактивные вещества, свободные моносахариды, олигосахариды, органические кислоты, аминокислоты, дубильные вещества, эфирные масла. Очищенное и высушенное сырье использовали для выделения полисахаридного комплекса 1%-ным раствором оксалата аммония в соотношении 1:10 на кипящей водяной бане в течение 1,5 часов. Из полученного экстракта полисахарид осаждали трехкратным избытком 96%-го этанола. Полученный осадок полисахаридов последовательно очищали этанолом, ацетоном, хлороформом, высушивали в эксикаторе над концентрированной серной кислотой, после чего определяли его массу [5, 6].

Для исследования качественного и количественного состава проводилась экстракция 7 образцов лекарственного растительного сырья с последующей статистической обработкой результатов.

Моносахаридный состав полисахаридного комплекса исследовали после кислотного гидролиза в 1 М растворе серной кислоты, который проводили на кипящей водяной бане в течение 9 часов. Полученный гидролизат нейтрализовали карбонатом бария. Продукты гидролиза исследовали методом восходящей тонкослойной хроматографии и нисходящей бумажной в системе бутанол-1: уксусная кислота: вода (4:1:5) при температуре 25-27⁰С. Хроматограммы проявляли смесью анилина и фталевой кислоты, определяли качественный моносахаридный состав полисахаридного комплекса.

Уроновые кислоты количественно определяли гравиметрическим методом, осаждали полигалактуроновую кислоту из гидролизата полисахарида в виде пектата кальция.

Количественное определение свободных карбоксильных групп проводили методом алкалиметрии (титрант 0,01 М раствор гидроксида натрия), индикатор - фенолфталеин.

Определение золы проводилось в соответствии с фармакопейной статьей: точную навеску высушенного растительного сырья и полисахаридного комплекса помещали в фарфоровый тигель и сжигали в муфельной печи при постоянном повышении температуры до постоянной массы золы [7].

Во всех биологических исследованиях использовали 5%-й раствор полисахарида лопуха большого, приготовленного на физиологическом растворе.

Исследовали действие полисахарида лопуха большого на каталазную активность крови. Для этого в мерную колбу на 100 мл наливали 10 мл воды очищенной и прибавляли микропипеткой 0,1 мл крови здорового донора. Пипетку промывали несколько раз тем же раствором. Воду прибавляют в колбу до метки и получали основной раствор крови (1:1000), к которому добавляли раствор полисахарида лопуха большого в дозе 1:10^-4, перемешивали, наливали по 0,1 мл в стаканчики, приливали по 7 мл очищенной воды, в опытную пробу добавляли

2 мл 5%-го раствора полисахарида и 2 мл 1%-го перекиси водорода, в контрольную -5 мл 10%-го раствора серной кислоты. Затем приливали в опытную колбу 5 мл 10%-го раствора серной кислоты, а в контрольную - 2 мл 1%-го раствора перекиси водорода, содержимое титровали 0,1 М раствором перманганата калия [8].

Для определения влияния полисахарида на перекисную резистентность мембран эритроцитов, брали кровь здорового донора с добавлением к ней полисахарида лопуха большого (ПСЛ), из расчета дозы 1:10^-4 Полученный раствор выдерживали в термостате в течение часа, а затем в пробирку с фосфатным буфером (рН 7,4), приготовленном на физиологическом растворе добавляли по 0,1 мл крови с полисахаридом. В контрольные образцы добавляли 0,1 мл крови без полисахарида. Для стабилизации к 1,5 мл крови добавляли 2 капли гепарина.

Во все пробы приливали равные объемы раствора Фентона (сульфат железа (II) 0,01 м/мл и перекись водорода 0,2 мг/мл), а степень гемолиза определяли на фотоэлектроколориметре КФК-3 при длине волны 490 нм [9], время инкубации эритроцитов с раствором полисахарида составило 30 минут. Одновременно проводили контрольные исследования, чтобы исключить ошибку, связанную со спонтанным гемолизом во временном факторе. Действие полисахарида на мембраны эритроцитов оценивали в процентах по отношению к контролю.

Вычисляли процент гемолиза в каждой пробирке, сравнивая величины экстинкции надосадочной жидкости с экстинкцией, принятой за 100%, по формуле: Процент гемолиза=Ех*100 / Е₁, где Е₁ -экстинкция надосадочной жидкости в пробирке раствором Фентона; Е_Х - экстинкция исследуемой пробы.

Исследования на животных выполнялись в соответствии с Европейской конвенцией по защите и использованию позвоночных животных для экспериментов и других целей; Приказом № 267 от 19.06.2003 «Правила лабораторной практики в Российской Федерации»; а также Приказом № 742 от 13 ноября 1984 г. «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Действие полисахарида лопуха большого на физическую работоспособность животных оценивали на модели принудительного плавания. Для этого у 25 крыс Вистар обоего пола, содержащихся в стандартных условиях вивария, определяли массу тела и подопытным животным ежедневно вводили полисахарид «per os» в дозе 0,2 г/кг массы тела в одно и тоже время. Средняя масса экспериментальных животных составила 0,298±0,01 (0,280-0,315). Контрольные животные получали в те же сроки равный объем физиологического раствора.

Исследование физической работоспособности проводили на 1, 5, 10, 15, 20, 25 сутки введения полисахарида и на 10 день отмены для оценки последействия. В эти же сроки определяли среднюю массу тела животных. К задней конечности животного привязывали груз, массой 10% от массы тела крысы. Животного с грузом помещали в стеклянный цилиндр диаметром 30 см с высотой водного столба 80 см (температура воды поддерживалась в пределах 29-30⁰С) и отмечали время плавания животных на поверхности воды до признаков утомления.

Полученные результаты обрабатывали с помощью программы «StatSoft Statistica 7.0». Тип распределения данных оценивали по критерию Шапиро-Уилка. Полученные данные обрабатывали тестом ANOVA (так как данные были распределены нормально). Межгрупповые различия определяли по критерию Ньюмена-Кейсла. Данные в таблицах представлены в виде среднего арифметического±стандартное отклонение (M±SD).

Результаты и их обсуждение

Из 60 г сухого растительного сырья извлекли 7,5 г полисахаридного комплекса, представляющего собой аморфное вещество кремового цвета, выход которого составил 12,95%±0,57%. Выделенный полисахарид хорошо растворялся в воде очищенной и физиологическом растворе, образуя коллоидный раствор. В 5%-ном водном растворе полисахарида на лабораторном потенциометре определили величину рН, которая составила 4,87-4,88 при температуре 20⁰С.

Вязкость раствора полисахарида исследовали на вискозимере Оствальда с диаметром капилляра 0,54 см, в сравнении с водой очищенной при температуре 22-23⁰С. Абсолютная вязкость составила 10,46*10^- Па*с, что почти в 10 раз превышает вязкость воды при той же температуре. Рассчитанная зольность для сухого растения и полисахаридного комплекса составила 14,82%±0,5% и 24,20%±0,8% соответственно.

Состав и некоторые физико-химические свойства выделенного полисахаридного комплекса представлены в таблице 1. Установлено, что в состав полисахарида входят моносахариды: арабиноза, глюкоза, галактоза и два неидентифицированных моносахарида. Было установлено, что полисахарид листьев лопуха большого содержит следовые количества уроновых кислот (менее 0,05%), среднее содержание свободных карбоксильных групп составило 2,68%±0,13%.

 

Таблица 1. Состав и физико-химические свойства полисахаридного комплекса лопуха большого (в МиМуказано M±SD)

рН	Вязкость, Па*с	Моносахаридный состав	Уроновые кислоты, %	Свободные карбоксильные группы, %	Зольность, %
4,87 ±0,01	10,46 *10-3	Арабиноза Глюкоза Галактоза Неидентифици- рованные моносахариды	Следовые количества	2,68±0,13	24,20±0,12

 

Результаты исследования дают возможность отнести изучаемый полисахарид к группе гетерогликанов. Исследуемый нами полисахарид содержит этерифициро-ванные карбоксильные группы (табл. 2).

Полученные после гидролиза восстанавливающие моносахариды с пикриновой кислотой имеют максимум поглощения при 495 нм, окраска раствора устойчива в течение 30 минут. Спектры поглощения глюкозы и очищенного гидролизата полисахаридного комплекса листьев лопуха большого после проведения реакции с пикриновой кислотой совпадают, в разных образцах полисахаридного комплекса найдено 26% восстанавливающих моносахаридов в пересчете на глюкозу.

Низкое содержание уроновых кислот и свободных карбоксильных групп в составе полисахарида лопуха большого сильно отличает его от других пектиновых веществ лекарственных растений, в составе которых может содержаться до 65-85% уроновых кислот [3].

 

Таблица 2. Содержание свободных карбоксильных групп в полисахаридном комплексе лопуха большого (в МиМ указано M±SD)

 

 

Нами впервые установлено, что добавление полисахарида лопуха большого к крови здорового донора в дозе 1:10^-4 приводит к активации фермента каталазы. Каталазное число здорового человека колеблется в пределах 10-15 [9]. Каталазное число в контрольных исследованиях составило 12±1, а каталазное число крови, под действием полисахаридного комплекса лопуха большого составляет 20,4-21,2, что превышает контрольные показатели на 52-63% (p<0,05).

Добавление раствора ПСЛ к крови здорового донора снижает степень гемолиза эритроцитов, и, следовательно, повышает перекисную резистентность мембран этих клеток. Степень гемолиза в контрольных образцах составила 0,5438±0,0018 (p<0,01), а величина гемолиза под действием полисахарида уменьшается до 0,1640±0,0014 (p<0,01), что на 69,85% ниже контрольных показателей (p<0,01). Повышение перекисной резистентности при добавлении полисахарида, может быть связано с активацией каталазы, которая разрушает молекулы пероксида водорода, защищая мембраны эритроцитов. Возможно, полисахарид взаимодействует с белками или полисахаридами мембраны, образуя защитную пленку на ее поверхности, что также предотвращает разрушение мембран эритроцитов.

Полученные данные вполне согласуются с данными о влияние растительных полисахаридов на активность фермента каталазы и на изменение перекисной резистентности мембран клеток [5].

Нами установлено, что у крыс, получавших раствор полисахарида лопуха большого, время плавания до состояния утомления достоверно увеличивалось по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы животных (рис. 1).

 

Рис. 1. Влияние полисахарида лопуха большого на время плавания лабораторных животных

 

У опытной группы животных на 5-й день опыта время плавания снижается, незначительно по сравнению с первыми сутками эксперимента (p<0,05).

На 10-е сутки эксперимента время плавания подопытных крыс начинает возрастать, и статистически значимо превышает контрольные результаты на 23,6% (p<0,05).

На 15 -е и 20-е сутки опыта время плавания как у контрольных, так и у опытных крыс возрастает, что связано с некоторой «тренированностью» животных. У крыс, принимающих полисахарид, время плавания возрастает на 46% и 52,5% соответственно по сравнению с контрольными показателями на 15-е и 20-е сутки эксперимента (p<0,001).

На 25-й день опыта различия во времени плавания крыс опытной группы и контрольной снижаются (остаются статистически значимыми), но у животных, принимающие полисахарид время плавания на 32,9% дольше, чем у контрольных крыс.

На 10-й день после отмены полисахарида, различия времени плавания животных снижаются и показатели возвращаются к исходным значениям, но время плавания подопытных крыс превышает результаты контрольных животных (p<0,05). Данные приведены в таблице 3.

 

Таблица 3. Зависимость времени плавания крыс от дозы полисахарида лопуха большого (в МиМ указано M±SD)

День эксперимента	Время плавания, с
	Контроль	Эксперимент	Достоверность
1	47,69±0,47	52,68±8,06	p<0,05
5	38,88±5.29	50,17±7,19	p<0,005
10	50,47±9,29	66,01±7,98	p<0,05
15	51,72±9,81	95,4±15,70	p<0,001
20	60,84±10,02	98,76±16,10	p<0,001
25	56,84±7,29	84,92±12,40	p<0,005
10-й день отмены полисахарида	50,72±7,21	56±6,89	p<0,05

 

Установлено, что физическая работоспособность крыс под действием полисахарида лопуха большого, после 25-и дней приема превышает контрольное значение на 31% (p<0,05).

Повышение уровня физической работоспособности подопытных животных под воздействием полисахаридов возможно связано с активацией ферментных систем клеток, приводящей к повышению уровня обмена веществ. Растительные полисахариды при введении в организм животных, могут активировать процесс эритропоэза, увеличивать количество эритроцитов и гемоглобина крови, что усиливает процесс обмена веществ в тканях и влияет на повышение физической работоспособности.

Выводы

1. Из листьев лопуха большого впервые получен полисахаридный комплекс, обладающий биологической активностью, его состав характеризуется наличием арабинозы, глюкозы, галактозы и двух неиден-тифицированных моносахаридов.
2. Полисахарид листьев лопуха большого содержит следовые количества уроновых кислот, что дает возможность отнести изучаемый полисахарид к группе гетерогликанов.
3. Добавление полисахарида лопуха большого к донорской крови человека в концентрации 1:10^-4 повышает каталазную активность крови.
4. Полисахаридный комплекс лопуха большого в концентрации 1:10^-4 увеличивает перекисную резистентность мембран эритроцитов крови человека in vitro.
5. Полисахаридный комплекс лопуха большого в дозе 0,2 г/кг массы тела, применяемый в течение 25 дней повышает работоспособность крыс на протяжении всего периода наблюдения.

Конфликт интересов отсутствует.

About the authors

I A. Sychev

Ryazan State Medical University named after academician I.P. Pavlov

Author for correspondence.
Email: obschhim@mail.ru
Ph Russian Federation

D G. Kokina

Ryazan State Medical University named after academician I.P. Pavlov

Email: diana_kokina@rambler.ru
ст. преподаватель кафедры общей и фармацевтической химии Russian Federation

References

Supplementary files