The optimization of reparative processes after cesarean section (clinical-experimental research)

Full Text

Введение В последние годы одной из основных проблем акушерства является рост частоты кесарева сечения, что обусловлено увеличением числа первородящих старшего возраста, возрастанием сопутствующей тяжелой акушерской и экстрагенитальной патологии, широким внедрением вспомогательных репродуктивных технологий, выполнение большого количества операций в интересах плода. За последние 30 лет частота кесарева сечения в России увеличилась более, чем в 3 раза и сегодня составляет 24,1 %. Средняя частота абдоминального родоразрешения в перинатальных центрах и клиниках страны доходит до 25-30 %, а в отдельных родовспомогательных учреждениях, коллекторах экстрагенитальной и акушерской патологии, составляет от 30 до 50 %. Увеличение частоты кесарева сечения обусловливает появление отдельной проблемы в акушерстве - ведения беременности и родов у женщин с рубцом на матке, что сопряжено с высоким риском осложнений, возникающих как со стороны матери, так и плода. Основным и самым грозным из них, частота которого составляет 3,5-5 %, является разрыв матки [4, 17]. Несмотря на это, по данным разных авторов, роды у беременных с рубцом на матке через естественные родовые пути возможны в 30-80 % случаев [9, 12]. В связи с этим стремление к полноценной репарации миометрия после кесарева сечения является актуальным вопросом акушерства и обусловлено такими факторами, как техника операции, качество шовного материала, течение послеоперационного периода. Морфофункциональные особенности репаративных процессов сводятся к новообразованию соединительной ткани и включают в себя фагоцитоз поврежденных тканевых элементов, пролиферацию фибробластов, синтез коллагена и ангиогенез [13]. Течение репаративных процессов в матке после операции кесарева сечения определяет морфофункциональную состоятельность матки и ее нижнего сегмента при последующих беременностях и родах. В качестве предгравидарной диагностики в основном применяют УЗИ и МРТ органов малого таза, что позволяет исключить грубые анатомические дефекты маточной стенки [10]. В связи с тем, что полноценность репаративных процессов во многом обусловлена интенсивностью ангиогенеза, была доказана необходимость измерения толщины миометрия НМС в совокупности с доплерометрическми показателями, что позволяет наиболее точно оценить состоятельность рубца на матке после кесарева сечения [2, 6, 14]. Таким образом, разработка и внедрение новых материалов, влияющих на репаративные процессы в миометрии - актуальное направление современного акушерства. Одним из таких является биопластический материал нового поколения «Коллост», состоящий из нереконструированного коллагена I типа. Имплант способствует активации и оптимальной миграции фибробластов в рану, образованию новых коллагеновых волокон, стимулирует ангиогенез и исключает беспорядочный рост рубцовой ткани [5, 11]. Целью исследования явилось изучение влияния коллагенового материала «Коллост» на репаративные процессы миометрия после кесарева сечения. Материалы и методы исследования Для оценки формирования сосудов эндотелиальные клетки линии EA.Ну926 вносили в лунки 24-луночного планшета, содержащего коллагеновый гель «Коллост» или трехмерный матрикс Матригель с пониженным содержанием ростовых факторов, в среде DMEM/F12 с добавлением 2,5 % ЭТС в концентрации 150 000 клеток на лунку и инкубировали в течение 24 часов при 37 °С и 3,5 % СO2. В качестве положительного контроля использовали DMEM/F12 с добавлением 10 % ЭТС, а также среду DMEM/F12 с добавлением 2,5 % ЭТС и 10 нг/мл VEGF. Оценку образования капилляроподобных структур проводили через 2 часа и через 24 часа с использованием микроскопа AxioObserver.Z1 (Zeiss, Германия). Оценивали длину образованных клеточных тяжей в микрометрах и их количество. Эксперимент проводили на 24 самках кроликов породы «Шиншилла» («Oryctologys ciniculus») массой 3000-6000 г, полученных из питомника лабораторных животных «Рапполово» РАН). В первой серии опытов разрабатывали технику операции кесарева сечения без имплантации коллагеновой мембраны на 6 животных, которых выводили из эксперимента на 30, 45 и 60-й день после операции с целью определения сроков завершения репаративных процессов и выбора оптимального срока наступления повторной беременности. Во второй серии по разработанной нами оригинальной методике в хронических опытах на 30-й день беременности проводили кесарево сечение. Принимая во внимание наличие у самки кроликов двурогой матки и возможность течения беременности в обоих рогах, на один из маточных рогов после оперативного извлечения плодов в основной группе субсерозно фиксировали коллагеновую мембрану «Коллост». В группе сравнения коллагеновую мембрану не применяли. В дальнейшем, в третьей серии опытов, через 60 дней после повторного покрытия самок, животные были родоразрешены через естественные родовые пути. После завершения опытов с целью изучения послеоперационных рубцов проводилось гистологическое и иммуногистохимическое исследование. Гистологическое исследование материала проводили по стандартной гистологической методике, используя гематоксилин и эозин. Иммуногистохимическое исследование проводили на парафиновых срезах толщиной 5 мкм, которые помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-L-лизина (Sigma). В качестве системы визуализации использовали Dako Cytomation LSAB2 System-HRP («Dako», Дания). Для изучения экспрессии миозина с целью оценки развития мышечной ткани в области рубца использовали моноклональные антитела (Myosin, Smooth Muscle Clone 1G12, 1 : 400, Abcam), для изучения развития сосудистого компонента в области рубца использовали моноклональные антитела к VEGF-А (Сlon VG1, 1 : 50, Dako), для оценки степени развития базальной мембраны сосудов использовали антитела к коллагену I и III типа (Collagen I; Clon NB 600-450, 1 : 50; Novus Biological; Collagen III, Clon AF 5810, 1: 800, Novus Biological). Методика визуализации иммуногистохимической реакции выполнялась по стандартной схеме Петрова С. В. и Райхлина Н. Т., 2004. В клиническую часть исследования были включены 50 беременных женщин, родоразрешенных путем операции кесарева сечения в родильном отделении ФГБНУ «НИИ АГ и Р» имени Д. О. Отта в период с 2013 по 2015 гг. Основную группу составили 20 пациенток, которым проводили кесарево сечение с интраоперационным применением коллагеновой мембраны. В группу сравнения вошли 30 беременных женщин, которым абдоминальное родоразрешение выполняли по классической методике (интраперитонеальное кесарево сечение с поперечным разрезом в нижнем сегменте матки). Для оценки толщины миометрия и доплерометрических показателей в послеродовом периоде было обследовано 10 женщин, родоразрешенных через естественные родовые пути, составивших контрольную группу. Результаты По результатам сравнительного анализа образования эндотелиальных клеток на биологически активных коллагеновых матрицах «Коллост» и «Матригель» установлено, что культивирование эндотелиальных клеток (ЭК) в присутствии 10 нг/мл VEGF в течение 24 часов увеличивало длину клеточных тяжей по сравнению со спонтанным уровнем. Следует отметить, что по сравнению с препаратом «Матригель», на препарате «Коллост» хорошо сформированные клеточные тяжи образовывались уже через 2 часа инкубации как без добавления VEGF, так и в его присутствии. При культивировании ЭК линии ЕА.Ну926 в течение 2 часов в присутствии культуральной среды с добавлением 10 нг/мл VEGF на препарате «Коллост» наблюдали увеличение длины клеточного тяжа и уменьшение количества клеточных тяжей по сравнению с культивированием без добавления VEGF. Длина тяжей, образованных ЭК линии ЕА.Ну926 при их культивировании на препарате «Коллост» в течение 24 часов в присутствии 10 нг/мл VEGF, была выше по сравнению с культивированием без добавления фактора. Также установлено уменьшение количества клеточных тяжей при культивировании ЭК в течение 24 часов в присутствии культуральной среды с добавлением 10 нг/мл VEGF по сравнению с культивированием без добавления фактора. По разработанной нами оригинальной методике на 30-й день беременности в условиях асептики под тиопенталовым наркозом производили кесарево сечение беременным самкам кроликов. Через срединный разрез брюшной полости матку выводили в операционную рану. Маточные рога укладывали на салфетку и осматривали. В последующем проводили подсчет количества плодов в обоих рогах. Принимая во внимание наличие у самки кролика двурогой матки и течение беременности одновременно в двух рогах, выполняли продольный разрез на каждом из них, на 0,5 см выше места их бифуркации длиной 3 см. После извлечения плодов, рану на матке ушивали непрерывным однорядным викриловым швом 2/0. После чего на маточный рог, содержащий большее количество плодов, 4 отдельными узловыми швами субсерозно фиксировали коллагеновую мембрану «Коллост» 30 × 20 × 0,5 мм (рис. 1). В дальнейшем через 60 дней после кесарева сечения животных покрывали повторно с последующим их родоразрешением через естественные родовые пути. С целью макроскопической оценки рубца на матке животные были выведены из эксперимента. Обнаружено, что при использовании материала «Коллост» после спонтанных родов рубец на одном из маточных рогов макроскопически визуализировался как состоятельный (рис. 2). В одном случае после спонтанных родов при наличии рубца на матке без применения коллагеновой мембраны был выявлен разрыв по рубцу с пролабированием элементов плацентарной ткани в рану. В брюшной полости было обнаружено около 100 мл геморрагического выпота. По результатам гистологического исследования послеоперационных рубцов на матках кроликов установлено, что в миометрии после кесарева сечения с ушиванием послеоперационной раны хирургической мононитью «Викрил» непрерывным однорядным швом выявлена преимущественно умеренная степень образования фиброзной ткани в зоне рубца. В тоже время при исследовании рубцовой ткани после кесарева сечения с наложением коллагеновой мембраны фибропластических изменений зоны рубца не обнаружено, при этом в 100 % случаев отмечалось наличие рыхлой соединительной ткани с преимущественно слабой степенью выраженности. Разрастание мышечных волокон в зоне рубцовых изменений после кесарева сечения без применения «Коллоста» было выражено слабо (группа сравнения). В то же время в случаях применения коллагеновой мембраны отмечалась высокая степень разрастания мышечных волокон в зоне послеоперационного рубца (основная группа). При иммуногистохимическом исследовании площади экспрессии миозина в зоне послеоперационных рубцов отмечалось снижение экспрессии данного маркера в контрольной группе при сопоставлении с основной группой (11,6 ± 1,8 и 16,6 ± 2,0 соответственно, р < 0,05). В послеоперационных рубцах контрольной группы отмечалась низкая степень васкуляризации ткани, тогда как в основной группе преобладающей являлась выраженная степень разрастания сосудистого компонента (7,9 ± 1,2 и 11,2 ± 0,9 соответственно, р < 0,05). Результаты иммуногистохимического исследования площади экспрессии коллагена I и III типов в послеоперационных рубцах исследуемых групп выявили достоверное повышение площади экспрессии коллагена I типа в основной группе по сравнению с группой контроля (11,6 ± 1,2 и 9,2 ± 0,7 соответственно) и отсутствие достоверных отличий в площади экспрессии коллагена III типа в исследуемых группах (13,5 ± 1,2 и 11,9 ± 1,4 соответственно, р< 0,05). Результаты проведенного гистологического и иммуногистохимического исследования послеоперационных рубцов были подтверждены данными конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM - Confocal Laser Scanning Microscopy). КЛСМ позволяет получить объективную информацию о количестве и распределении изучаемых маркеров. Это дает возможность впоследствии провести построение 3D изображений рубца и проанализировать структуру мышечного и сосудистого компонента. Таким образом, результаты гистологического и иммуногистохимического исследования послеоперационных рубцов на матке самок кроликов показали достоверные отличия в экспрессии миозина, сосудистого эндотелиального фактора роста и коллагена I типа, свидетельствующие о более полноценном формировании мышечной стенки и сосудистого компонента в послеоперационной рубцовой ткани при применении коллагеновой мембраны. Результаты экспериментального исследования позволили обосновать использование коллагенновой мембраны в клинической практике у 20 пациенток при кесаревом сечении. Особенностью операции явилось наложение биопластической коллагеновой мембраны «Коллост» на область швов на матке до перитонизации. С целью полного закрытия послеоперационного шва использовали мембрану 100 × 20 × 0,5 мм, которую фиксировали 2 отдельными узловыми швами, что способствовало меньшей травматизации окружающих тканей и ишемии миометрия, а следовательно, лучшей репарации тканей (рис. 3). После фиксации коллагеновой мембраны проводили перитонизацию с использованием пузырно-маточной складки с дальнейшим послойным ушиванием передней брюшной стенки. Из рисунка 4 видно, что длительность операции с использованием коллагеновой мембраны (основная группа) и без нее (группа сравнения), достоверно - не различалась и составила 52,58 ± 3,14 и 51,87 ± 3,01мин при плановых операциях и 45,12 ± 4,08 и 36 ± 6,96 мин при экстренных операциях соответственно. С целью оценки послеоперационного ремоделирования ткани матки у женщин, а также оценки толщины миометрия в области послеоперационного рубца всем пациенткам выполнялось трансвагинальное ультразвуковое исследование с доплерометрическим контролем в радиальных артериях через 3-6 месяцев после перенесенного кесарева сечения. По результатам измерений было выявлено, что толщина миометрия у женщин в группе сравнения без применения коллагеновой мембраны в области послеоперационного рубца была достоверно ниже по сравнению с показателями у женщин основной (интраоперационное использование «Коллоста») и контрольной групп (женщины, родоразрешенные через ЕРП) и составила в среднем 6,25 ± 0,57 мм (рис. 5). При доплерометрическом исследовании кровотока в радиальных артериях получены следующие результаты: показатели кровотока в основной группе были достоверно ниже по сравнению с группой контроля (p < 0,001). Однако кровотока в группе сравнения ни в одном случае вообще обнаружено не было (рис. 6) Результаты МРТ органов малого таза показали, что в 50 % случаев в основной группе из числа обратившихся женщин получен состоятельный послеоперационный рубец без грубых анатомических дефектов маточной стенки по сравнению с 13,8 % в группе сравнения. В 34,5 % случаев толщина рубца была менее 5 мм с наличием дефектов и ниш в области послеоперационного рубца у женщин без имплантации коллагеновой мембраны во время операции кесарева сечения. Обсуждение В проведенном исследовании была создана биологическая модель изучения ангиогенеза, как основы репаративных процессов с использованием биологических матриц. Культивирование эндотелиальных клеток на поверхности биологически активных коллагеновых матриц «Коллост» и «Матригель» приводило к образованию капилляроподобных структур. Однако культивирование ЭК на поверхности коллагеновой матрицы «Коллост» не только увеличивает длину клеточных тяжей, образованных ЭК, но и уменьшает их количество в сравнении с их культивированием на «Матригеле». Сокращение времени формирования сосудов на биоматрице «Коллост» может иметь принципиальное значение, когда стоит вопрос о необходимости быстрого восстановления поврежденных органов и тканей. В первую очередь это касается полостных органов, в том числе таких как матка, что помимо быстрого восстановления полноценности органа уменьшает и риски развития гнойно-септических осложнений. При гистологическом исследовании рубцов с применением коллагеновой мембраны ни в одном случае не отмечено наличие воспалительной реакции, которая достоверно снижает полноценность репаративных процессов в миометрии и увеличивает риск формирования несостоятельного соединительнотканного рубца на матке, что соответствует данным других авторов [12]. Результаты иммуногистохимического исследования состояния мышечной ткани, сосудистого компонента в зоне рубца показали, что в группе, где применяли коллагеновую мембрану «Коллост» во время кесарева сечения в сравнении с группой без применения мембраны выявлялось достоверное повышение экспрессии маркеров миозина, VEGF-A и коллагена I типа. Проведенное экспериментальное исследование позволило использовать коллагеновую мембрану «Коллост» в клинической практике. При анализе длительности операции достоверных различий по группам не получено. Средняя продолжительность планового кесарева сечения с интраоперационным применением коллагеновой мембраны составила 52,6 мин., экстренного - 45,1 мин., без использования биоматериала во время кесарева сечения 51,8 мин и 36 мин. соответственно. Из полученных результатов можно сделать вывод, что наложение коллагеновой мембраны не оказывает влияния на длительность операции. Согласно результатам других исследователей длительное проведение кесарева сечения, более 1,5 часов, негативно сказывается на репаративных процессах миометрия, что связано с нарушением кровотока в матке, увеличением объема кровопотери, увеличением обсеменнености раневой поверхности [28]. В ходе проведенного исследования получено, что толщина миометрия в зоне рубца после кесарева сечения с интраоперационным применением коллагенового биоматериала составила 10,39 мм, что достоверно не отличалось от показателей контрольной группы - 11,29 мм. При этом в группе сравнения (без применения коллагеновой мембраны) данный показатель был снижен практически в 2 раза, что составило 6,25 мм. По данным литературы считается, что одним из благоприятных факторов репаративного процесса является повышенная васкуляризация как в зоне рубца, так и в прилегающих к нему участках. По полученным нами данным, в 100 % случаев с использованием коллагеновой мембраны «Коллост» во время операции кесарева сечения по результатам УЗИ малого таза с прицельным исследованием области рубца был обнаружен кровоток как в зоне рубца, так и в соседних областях. В группе сравнения, где не применяли коллагеновую мембрану во время оперативного родоразрешения, через 6 месяцев по ультразвуковой картине наблюдалось отсутствие кровотока в области рубца на матке. Заключение 1. Морфологические и иммуногистохимические характеристики репаративного процесса в зоне послеоперационного рубца на матке с интраоперационным применением коллагеновой мембраны характеризовались достоверным повышением экспрессии эндотелиального сосудистого фактора роста (VEGF-A) и миозина по сравнению с кесаревым сечением без имплантации материала «Коллост». 2. По сравнению с препаратом «Матригель», на препарате «Коллост» хорошо сформированные клеточные тяжи эндотелиальных клеток образовывались уже через 2 часа инкубации как без добавления VEGF, так и в его присутствии. Культивирование эндотелиальных клеток на поверхности коллагеновой матрицы «Коллост» в присутствии 10 нг/мл VEGF не только увеличивало длину клеточных тяжей, образованных ЭК, но и уменьшало их количество по сравнению со спонтанным уровнем, что свидетельствовало в пользу стимуляции неразвлетвляющего ангиогенеза. 3. Биометрические показатели миометрия в области рубца на матке через 3-6 месяцев после кесарева сечения с интраоперационным применением коллагеновой мембраны показали следующее: толщина миометрия в зоне рубца 10,39 ± 0,56 мм, интенсивность кровотока в данной области достоверно превышала показатели у женщин без использования материала «Коллост»: толщина миометрия в зоне рубца 6,25 ± 0,57 мм, отсутствие кровотока в данной области (р < 0,001). 4. По результатам магнитно-резонансной томографии органов малого таза с контрастированием было выявлено, что интраоперационное наложение коллагеновой мембраны «Коллост» способствовало формированию полноценного рубца у всех обследованных женщин (толщина 5 мм и более), что достоверно превышало таковую величину, которая составила менее 5 мм с наличием дефектов и ниш в группе сравнения (р < 0,0001).

About the authors

Edvard Karpovich Aylamazyan

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: iagmail@ott.ru
academician, professor, the chief

Victoriya Yuryevna Andreeva

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: v.y.andreeva@gmail.com
postgraduate, Delivery Department

Tatiana Ulyanovna Kuzminykh

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: iagmail@ott.ru
MD, Head of the Delivery Department

Dmitriy Igorevich Sokolov

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: falkojugger@yandex.ru
MD, senior staff scientist

Sergey Alekseevich Selkov

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: selkovsa@mail.ru
MD, Professor, laboratory of immunology

Tatyana Georgievna Tral´

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: TTG2008@bk.ru
MD, Pathologist, department of pathomorphology

Gulrukhsor Haybulloevna Tolibova

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: gulyatolibova@mail.ru
PhD, MD, senior scientist, department of pathomorphology

Anastasia Alexandrovna Yakovleva

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Researcher, Laboratory of physiology and pathology of the fetus

References

Supplementary files