Endometrial dysfunction: an algorithm for histological and immunohistochemical studies

Full Text

Эндометрий является единственной морфофункциональной структурой в организме, которая в среднем в течение 28-30 дней под воздействием сложных молекулярных и нейроиммуноэндокринных механизмов претерпевает ряд циклических биохимических и морфологических структурных изменений. Адекватные изменения эндометрия на тканевом, клеточном, молекулярном уровне позволяют осуществлять основную его функцию - обеспечение успешной имплантации оплодотворенной яйцеклетки, развития хориона и эмбриона. Нарушение рецептивности эндометрия в период окна имплантации (19-22 д. ц. при 28-дневном менструальном цикле) или десинхронизация его взаимодействия с оплодотворенной яйцеклеткой являются причиной бесплодия, невынашивания беременности, неэффективных циклов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и других методов вспомогательных репродуктивных технологий, поскольку лишь 1/3 неудач ЭКО происходит из-за качества эмбриона и 2/3 неудачных попыток ЭКО связана с патологическими изменениями в эндометрии [10, 21, 23, 32]. В последние десятилетия получены данные о том, что эндометриальная дисфункция связана с патологическими изменениями экспрессии многочисленных факторов, и в связи с внедрением новых молекулярных методов исследования активно изучается роль цитокинов, факторов роста (лейкемия-ингибирующий фактор - LIF; интерлейкины - IL-1, IL-6; гранулоцитарно-макрофагальный фактор роста - GM-CSF; сосудисто-эндотелиальный фактор роста - VEGF; трансформирующий фактор роста бета1 - TGF- β1; гепаринсвязывающий фактор роста - HB-EGF; инсулиноподобный фактор роста-1 - IGF1; трансформирующий ростовой фактор бета - TGF-β), экспрессии рецепторов эстрогена (ER) и прогестерона (PR) как маркеров рецептивности эндометрия [1, 9, 10, 13, 19, 34]. Кроме того, многочисленными исследователями доказана ведущая роль хронического эндометрита (ХЭ) в генезе эндометриальной дисфункции, сопровождающейся нарушением рецептивности эндометрия и патологией репродуктивной функции [2, 3, 6, 10, 13, 17, 22, 24, 25, 28, 33]. Несмотря на большое количество исследований в области неопухолевой патологии эндометрия, отсутствует единый алгоритм иммуногистохимической диагностики эндометриальной дисфункции. Результаты наших многолетних клинико-морфологических исследований на основании большого количества материала с использованием гистологического, иммуногистохимического, иммуноцитохимического исследования биоптатов эндометрия, а также применение конфокальной лазерной микроскопии позволили разработать алгоритм гистологического и иммуногистохимического исследования при эндометриальной дисфункции. Несомненно, стандартизация гистологического и иммуногистохимического исследований с оценкой экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона, а также выбора антител для диагностики эндометриальной дисфункции позволит избежать искажения полученных результатов, упростит их интерпретацию и будет способствовать оптимизации выбора лечения. Термин «эндометриальная дисфункция» наилучшим образом отражает суть патологических изменений в эндометрии. При своевременной диагностике и полном объеме лечебных мероприятий возможно восстановление физиологического состояния эндометрия. В клинической практике морфологическое исследование эндометрия остается одним из важных звеньев в диагностике эндометриальной дисфункции. Основными показаниями для осуществления морфологического исследования эндометрия являются: клинические проявления дисфункции эндометрия (невынашивание, бесплодие, неудачные протоколы ЭКО в анамнезе), изменение эхографических характеристик эндометрия (визуализация нарушений эхоструктуры, подозрение на железистый полип или субмукозный узел миомы). Стандартом в гинекологической практике является гистологическое исследование эндометрия. Принципы гистологического исследования не претерпели существенного изменения за последние десятилетия. Следует отметить, что при использовании новых молекулярных методов исследования может сложиться впечатление, что в настоящее время метод рутинной гистологии уже не столь актуален, однако это впечатление является не верным! Половина успеха заключительного диагноза о наличии патологического процесса, помимо полноценности предоставленных клинических и анамнестических данных, зависит от первичного подготовительного комплекса: правильного забора материала с последующей адекватной фиксацией и его макроскопического исследования. Нарушение правил преаналитического этапа ведет к трудностям оценки материала на морфологическом уровне и, как следствие, неполноценной, а иногда даже ошибочной, интерпретации результатов патологом. Основные способы взятия эндометрия из полости матки - биопсия эндометрия, аспирация эндометрия и соскоб из полости матки. Для комплексного морфологического исследования целесообразна пайпель-биопсия эндометрия или соскоб из полости матки. На сегодняшний день мнения исследователей о сроках биопсии эндометрия для проведения гистологического и иммуногистохимического исследования с целью диагностики состояния рецепторного статуса и верификации хронического эндометрита разноречивы. Следует отметить, что при хроническом эндометрите основной проблемой является нарушение рецепторного профиля эндометрия, поскольку воспалительный процесс служит ко-фактором и приводит к снижению экспрессии рецепторов за счет нарушения кровоснабжения ткани, фиброза в стромальном компоненте [15, 18, 19]. Исследование эндометрия в период «окна имплантации» с оценкой рецептивности эндометрия, воспалительных маркеров и эндометриальных факторов позволит дать комплексное заключение о составляющих эндометриальной дисфункции. Многие авторы для диагностики хронического эндометрита предлагают выполнять биопсию в первую фазу цикла (на 8-11 день), когда в строме эндометрия отмечается наименьшее количество иммунокомпетентных клеток [15, 18, 19]. Однако в первой фазе цикла диагностическая оценка рецептивности эндометрия не целесообразна, поскольку нормальное течение первой фазы не является гарантией полноценности второй фазы цикла, а проводить повторную биопсию эндометрия дважды за цикл неприемлемо. В зависимости от длительности цикла и клинической картины оптимальным сроком для биопсии эндометрия является: 19-22 д. м. ц. при 28-дневном, в том числе индуцированном цикле; 23-26 день при 35-дневном цикле; 4-6 месяцев после протокола ЭКО. Особого внимания заслуживает обсуждение оптимального времени биопсии эндометрия после неудачной попытки ЭКО. По нашим данным, оптимальным для выполнения биопсии является период через 4-6 месяцев после протокола ЭКО. Данный временной промежуток обусловлен тем, что после неудачи ЭКО несколько менструальных циклов протекают с нарушениями в эндометрии как по типу гиперпластических процессов без признаков атипии, «лечебного патоморфоза», так и гипопластических изменений вплоть до функционально неактивного (индифферентного) эндометрия. Для гистологического исследования состояния эндометрия объем исследуемого материала должен быть не менее 1,0 см3 и содержать функциональный и базальный слои эндометрия. Необходимость такого количества материала сводится не только к адекватному гистологическому заключению о наличии патологического процесса на основании достаточного объема материала, но и зачастую необходимостью дальнейших, в том числе иммуногистохимических, исследований. Материал категорически запрещается делить по разным лабораториям. Если лаборатория не имеет возможности проведения иммуногистохимического анализа, проводится гистологическое исследование и потом готовый блок отправляется в лабораторию, где возможно проведение иммуногистохимического исследования. После забора материал помещается в 10 % нейтральный (забуференный) формалин в соотношении материал/фиксирующий раствор - 1 : 10. Необходимость применения 10%-го раствора формалина обусловлена его оптимальными равномерными фиксирующими способностями по отношению к поверхностным и глубоким слоям материала. Более высокие концентрации фиксирующего раствора обладают дубящими свойствами в отношении поверхностных слоев биоптатов и недостаточному его проникновению в глубокие отделы. Концентрация формалина менее 10 % не обеспечивает достаточной фиксации и приводит к гнилостным процессам в материале. Транспортная емкость подлежит обязательной маркировке с указанием ФИО пациента. При отправке материала на исследование заполняется бланк, где, помимо паспортной части, обязательно указываются данные гинекологического анамнеза: дата последней менструации, длительность цикла, день цикла и особенности менструального цикла. Необходимым условием при заполнении направления являются данные о приеме гормональных препаратов за последние 6 месяцев, с указанием названия, дозы и длительности приема (включая комбинированные оральные контрацептивы). Столь подробное изложение краткого гинекологического анамнеза крайне важно для правильной оценки гистологического строения эндометрия и является необходимым для интерпретации результатов иммуногистохимического исследования как рецепторного профиля, так и воспалительного процесса в эндометрии. Разработанный нами бланк представлен на рисунке 1. Время фиксации материала перед проведением гистологического исследования составляет от 24 до 48 часов. Сроки хранения архивного материала в фиксирующем растворе не ограничены, способ хранения - комнатная температура. После фиксации эндометрий подвергается проводке в гистологическом процессоре с обезвоживанием в спиртах возрастающей концентрации (70-95 %), с дальнейшим помещением в ксилол и пропитыванием парафином. После извлечения проведенный материал заливается в парафин и получаются готовые для порезки парафиновые блоки. Для гистологического исследования эндометрия делается 2-3 микротомных среза, тогда как для иммуногистохимического исследования количество срезов составляет от 6 и более в зависимости от набора антител. Для обзорной окраски препарата используется гематоксилин и эозин, при необходимости дополнительные гистологические срезы окрашиваются другими красителями (Ван-Гизон и т. д.). В зависимости от оснащенности лаборатории современной техникой для приготовления гистологических препаратов срок исследования с учетом гистологического заключения может составлять от 2 до 5 дней. С основными характеристиками эндометрия в разные фазы менструального цикла можно познакомиться в классических работах по морфологии. При просмотре препаратов эндометрия врачом-морфологом с помощью световой микроскопии оценивается адекватность и достаточность объема взятого материала, описывается состояние желез, стромального и сосудистого компонента эндометрия с наличием или отсутствием гистологических признаков воспалительных и патологических изменений. Завершается исследование заключением о соответствии строения эндометрия дню менструального цикла. При этом надо помнить о том, что даже в случае соответствия морфологической структуры эндометрия фазе менструального цикла, возможно нарушение его функциональных свойств, необходимых для процессов имплантации. Совокупность иммунокомпетентных клеток (лимфоцитов) эндометрия представляет собой составляющую единой системно-ассоциированной со слизистыми оболочками лимфоидной (лимфатической) ткани (MALT - mucosa associated lymphatic tissue) [4]. Морфологическим субстратом хронического эндометрита являются лимфоидные инфильтраты в строме эндометрия, состоящие из лимфоцитов и плазмоцитов. Длительное течение воспалительного процесса в слизистой оболочке тела матки приводит к значительной перестройке не только стромального, но и железистого компонента. При этом отмечается пролиферация фибробластических клеток с формированием муфт вокруг эндометриальных желез [15, 17]. Следует отметить, что в последнее время многими исследователями констатируется бессимптомное, волнообразно-прогрессирующее течение хронического воспалительного процесса, что связано с широким использованием противомикробной, противовоспалительной, противопротозойной и противогрибковой терапии. В подобной ситуации классические признаки хронического эндометрита при гистологическом исследовании могут не выявляться, что требует проведения дополнительных методов диагностики [12, 14, 15, 18, 19]. Иммуногистохимическое исследование представляет собой метод выявления искомых веществ при маркировке специфическими антителами. Иммуногистохимическое исследование можно разделить на ряд важных этапов: преаналитический (взятие биологического материала, приготовление микропрепарата); аналитический (протокол окрашивания, депарафинизация, демаскировка антигенов, блокирование эндогенного биотина, инкубация с первичными и вторичными антителами, хромогеном, докрашивание гематоксилином и т. д.); постаналитический (интерпретация результатов реакции патоморфологом). Существуют два метода иммуногистохимического исследования: прямой, основанный на непосредственном связывании маркированных антител с веществом, и непрямой метод - немаркированные первичные антитела связываются с антигеном, а введение вторичных антител служит для выявления первичных антител, связанных с веществом, когда первичные антитела становятся антигенами. Непрямой метод иммуногистохимического исследования является более чувствительным и чаще используется для диагностики. Наиболее часто используют пероксидазно-анти-пероксидазный (PAP-method, ПАП-метод) и метод авидин-биотинового комплекса (ABC-method, АВС-метод). В настоящее время для проведения иммуногистохимического исследования применяют ручной и автоматизированный способы постановки. Подробная методика проведения иммуногистохимической реакции представлена в работах Петрова С. В., Райхлин Н. Т., 2004. В иммуногистохимическое исследование эндометриальной дисфункции целесообразно включать оценку экспрессии: рецепторов эстрогена, прогестерона (ER, PR); маркеров хронического эндометрита - цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+), Т-хелперов (CD4+), В-лимфоцитов (CD20+), плазмоцитов (CD138+) в период предполагаемого окна имплантации. Выбор именно данных воспалительных маркеров обусловлен тем, что количество цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+) в поздней стадии фазы пролиферации, ранней и средней стадии фазы секреции не имеет существенных различий по сравнению с первой половиной фазы пролиферации. По мнению других исследователей, в эндометрии секреторной фазы цикла количество CD8+-клеток низкое, поскольку их число находится в обратной зависимости от концентрации прогестерона и эстрогена в крови, при этом количество В-лимфоцитов (CD20+) и плазмоцитов (CD138+) в эндометрии незначительно изменяется в течение менструального цикла [20, 26, 27, 29, 31, 35]. Выбор комплекса антител для иммуногистохимического исследования эндометрия зависит от гистологического заключения, анамнестических и клинических данных. Для диагностической оценки течения гиперпластических, пролиферативных процессов и канцерогенеза в эндометрии целесообразно применять маркер пролиферации Ki67, проапоптотический белок митохондриального пути активации апоптоза - Bax, маркер антиапоптоза - Bcl 2. С целью исследования сосудистого компонента эндометрия возможно применение сосудистого эндотелиального фактора роста - VEGF A, который участвует в регуляции ангиогенеза в репродуктивной системе, что, в свою очередь, является важным диагностическим критерием для оценки состояния стромального компонента эндометрия [7, 8, 11]. Следует отметить, что у пациенток, которые являются носителем вируса папилломы человека (ВПЧ) онкогенного типа или имели его в анамнезе, целесообразно включить в исследование онкопротеин ингибитор циклин-зависимой киназы p16ink4a для исключения цитопатического действия вируса на эндометрий. При подозрении на опухолевую патологию эндометрия (атипическую железистую гиперплазию, аденокарциному, карциносаркому и др.) рекомендуется консультация онкоморфолога в специализированном учреждении с проведением возможного иммунофенотипирования опухолевых клеток для уточнения гистогенеза. После проведения иммуногистохимического анализа проводится качественная и количественная оценка результатов исследования с применением световой микроскопии и морфометрии. Оценка экспресии рецепторов эстрогена и прогестерона проводится по системе Histochemical Score. Существующая система гистологического подсчета Histochemical Score, которая активно используется в исследованиях, не отражает полную картину. Даже в разных исследованиях данная методика описана по-разному. Histochemical Score = ∑ P (i) × I, где I - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах от 0 до 3; P (i) - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью. Система подсчета включает в себя интенсивность иммуногистохимической окраски по 3-балльной шкале и долю ( %) окрашенных клеток, представляет собой сумму произведений процентов, отражающих долю клеток с различной интенсивностью окраски на балл, соответствующий интенсивности реакции. Интенсивность окраски 0 - нет окрашивания, 1 - слабое окрашивание, 2 - умеренное окрашивание, 3 - сильное окрашивание. Максимальное значение счета должно соответствовать 300 единицам. Основным недостатком данного метода является именно суммирование баллов, поэтому целесообразно использование данной модели не только для оценки выраженности экспрессии рецепторов, но и характера распределения экспресии рецепторов в исследуемом материале (равномерно, неравномерно). Помимо шкалы H-Score в патоморфологических лабораториях используется система компьютерного анализа микроскопических изображений, которая оценивает оптическую плотность и площадь экспрессии изучаемого маркера в иммуногистохимических препаратах. Площадь экспрессии (S) измеряют в пикселях; оптическую плотность - в условных единицах. Достоинство метода заключается в оценке реакции вне зависимости от локализации рецепторов (ядерные или цитоплазматические). После подсчета полученные результаты обрабатываются пакетом статистического анализа. На втором этапе оценки проводится верификация хронического эндометрита. Исследование проводится на основании оценки 10 полей зрения при увеличении ×400, но не менее 4 полей, в зависимости от объема материала, по системе подсчета количества иммунопозитивных клеток. Для получения результата общее количество иммунопозитивных клеток делится на количество полей зрения. Для верификации воспалительного процесса по совокупности исследуемых маркеров оценивается степень выраженности хронического эндометрита. Результаты наших многолетних морфологических исследований биоптатов эндометрия и микробиологического исследования содержимого полости матки позволили обосновать степень выраженности хронического эндометрита. Данные представлены в таблице 1. Следует отметить, что при наличии хронического эндометрита отмечаются особенности распределения экспресии рецепторов ER и PR в стромальном компоненте. При умеренно выраженной и выраженной степени хронического эндометрита отмечается неравномерное снижение и практически полное отсутствие экспрессии рецепторов ER и PR в фибропластически измененной строме эндометрия. Снижение экспресии рецепторов стероидных гормонов на фоне хронического эндометрита является основным диагностическим критерием эндометриальной дисфункции. На заключительном этапе устанавливается диагноз по совокупности гистологического и иммуногистохимического исследований, который должен обязательно отражать состояние эндометрия в соответствии с днем менструального цикла, экспрессию рецепторов эстрогена и прогестерона (соответствие морфологической картине) и наличие или отсутствие хронического эндометрита. Таким образом, создание и применение единого алгоритма диагностики эндометриальной дисфункции у пациенток с нарушением репродуктивной функции позволит обосновать патогенетическую терапию, направленную на коррекцию и восстановление репродуктивного потенциала, или провести адекватную подготовку и лечение для осуществления вспомогательных репродуктивных технологий.

About the authors

Gulrukhsor Haybulloevna Tolibova

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: gulyatolibova@mail.ru
PhD, MD, senior scientist, department of pathomorphology

Tatyana Georgievna Tral´

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: TTG2008@bk.ru
MD, Pathologist, department of pathomorphology

Maxim Alexandrovich Kleshchov

FGBU “Oncology Institute. N. N. Petrov” Russian Ministry of Health

Email: makleshchov@mail.ru
MD

Igor Moiseevich Kvetnoy

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: igor.kvetnoy@yandex.ru
MD, professor. The head of a Department patomorphology

Edvard Karpovich Aylamazyan

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: iagmail@ott.ru
academician, professor, the chief

References

Supplementary files