Morphological, biochemical and physiological selection of spermatozoa for ICSI

Full Text

Введение Активное развитие вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) помогает преодолевать различные формы нарушения женской и мужской репродуктивной функции. Основные методы ВРТ, включающие в себя инвазивные процедуры, предусматривают стимуляцию овуляции и оплодотворение in vitro. Но, если количество получаемых ооцитов оценивается единицами, то в одной порции эякулята может содержаться до нескольких десятков миллионов сперматозоидов. Даже при значительной олигозооспермии (снижение концентрации сперматозоидов в эякуляте) и криптозооспермии (единичные сперматозоиды в эякуляте) количество доступных для оплодотворения сперматозоидов значительно превышает количество получаемых яйцеклеток. Таким образом, возникает закономерный вопрос о необходимости отбора сперматозоидов, методах и принципах селекции. Предложенный в 1992 году в Бельгии профессором Ван Штертейгем (Van Steirteghem) метод ИКСИ (внутрицитоплазматической инъекции сперматозоидов в ооцит — ICSI) позволил преодолевать определенные формы мужского бесплодия, связанные со значительным снижением концентрации, подвижности и определенными формами тератозооспермии. Уже тысячи детей рождены после процедуры ИКСИ. Одни исследователи не обнаруживают каких-либо отличий в частоте выявления пороков развития у детей, рожденных после естественного зачатия или в результате процедуры ЭКО/ИКСИ [10, 78]. Другие утверждают, что у таких детей частота врожденных пороков повышена [44, 8]. Это скорее можно объяснить особенностями выборки. До недавнего времени ИКСИ применялся только при тяжелой форме мужского бесплодия, но не всегда учитывался тот факт, что в 10–15 % случаев подобные патоспермии (олигозооспермия, криптозооспермия) связаны с хромосомными аберрациями в кариотипе и мутациями некоторых генов, что может являться причиной врожденных аномалий у детей [1]. Тем острее стоит вопрос о возможности прижизненного отбора единичных сперматозоидов по внешним признакам и корреляции этих внешних морфофункциональных параметров и таких показателей как хромосомный набор сперматозоида, целостность и зрелость его ДНК, а также его цитологические особенности. Возможно, только для определенных форм сперматозоидов характерны генетические и цитологические аномалии, которые могут приводить к нарушению оплодотворения, аномалиям развития эмбриона и рождению детей с тяжелыми пороками. В таком случае дальнейшие исследования следует направить на выявление таких форм сперматозоидов, чтобы предотвратить их участие в программах ИКСИ. 1. Отбор сперматозоидов по функциональным параметрам Не смотря на то, что в циклах ИКСИ можно проводить инъекцию с использованием слабоподвижных и неподвижных сперматозоидов, предпочтение отдается сперматозоидам с нормальной скоростью и характером движения: прямолинейное, вращательное движение со скоростью 20–25 мкм/с. При естественном зачатии оплодотворение происходит в фаллопиевой трубе и отбор сперматозоидов по подвижности происходит естественным образом — неподвижные и слабоподвижные сперматозоиды не способны к оплодотворению. Возникает вопрос: существует ли корреляция между особенностями движения сперматозоида и какими-либо генетическими, эпигенетическими и цитологическими параметрами. Локомоторный аппарат сперматозоида организован аналогично всем ресничным аппаратам эукариот [73]. Нарушения центриоли, микротрубочек, денеиновых ручек и других структур локомоторного аппарата приводят к нарушению подвижности. Действительно, аномалии ресничного аппарата приводят к патологии дыхательных путей (носа, носовых пазух, бронхов), что является причиной синдромов Картагенера и Янга (Kartagener syndrome, OMIM 244400; Young syndrome, OMIM 279000). У таких пациентов отмечается также снижение фертильности вследствие нарушения подвижности сперматозоидов (астенозооспермия) [25, 38]. Аналогичная картина наблюдается при синдроме неподвижности ресничек [75]. Таким образом, можно говорить, что существует определенная взаимосвязь между способностью сперматозоида к движению и нарушениями некоторых генов. Однако подобные генетические дефекты подвергаются действию отбора и вероятность их передачи в следующее поколение в результате естественного зачатия снижена. Следует отметить, что у человека, помимо центриоли яйцеклетки наследуется также и центриоль сперматозоида. Аномалии строения центриоли сперматозоида при оплодотворении могут приводить к нарушению сингамии, блоку дробления, а также вызывать анеуплоидию и мозаицизм эмбриона за счет нарушения первых митотических делений [73]. Это дает основание предполагать, что не только неподвижность, но и различные нарушения характера и скорости движения сперматозоида, вызванные аномалиями центриоли и других структур хвоста, могут приводить к нарушению оплодотворения и развития эмбриона. Показано, что у пациентов, в сперматозоидах которых обнаружены аномалии структур центральной аксонемы, отмечалось снижение скорости делений дробления эмбрионов, полученных методом ИКСИ [24]. Подвижность сперматозоида обеспечивается также и митохондриями, спиралевидно располагающимися вокруг аксонемы и обеспечивающими энергетическую поддержку движения жгутика. Мутации в любом из генов, участвующих в синтезе АТФ, могут существенно повлиять на эффективность его синтеза и, как следствие, отразиться на подвижности сперматозоидов. На данный момент известно несколько мутаций и делеций генов мтДНК, приводящих к бесплодию у мужчин. [70, 66]. В некоторых случаях идиопатической астенозооспермии также обнаруживаются структурные дефекты митохондриальной мембраны [4]. Однако наследование митохондрий у человека происходит по женской линии и незначительное количество отцовских митохондрий не могут значительно повлиять на развитие эмбриона. В настоящее время для основных манипуляций ВРТ используются единые методы отбора подвижных сперматозоидов: метод swim-up, основанный на способности сперматозоидов всплывать в более верхние слои питательной среды, и метод центрифугирования в градиенте плотности, основанный на способности живых сперматозоидов проходить сквозь градиент силиконовых частиц. При проведении процедуры ИКСИ выбор сперматозоидов по характеру и скорости движения происходит визуально и не представляет сложности даже при небольшом увеличении микроскопа и использовании поливинилпирролидона для замедления движения. 2. Отбор сперматозоидов по морфологическим характеристикам Характерные морфологические признаки нормального сперматозоида: овальная головка длинной 4–6 мкм и шириной 2–4 мкм, акросома занимает 40–70 % головки, отсутствие дефектов шейки и хвоста, цитоплазматическая капля не должна превышать по размеру головку [40, 79, 80]. В отличие от большинства млекопитающих, у человека регистрируется наибольший процент морфологически аномальных спермиев [47]. И за последние годы этот параметр продолжает ухудшаться. В издании ВОЗ 2010 года по анализу эякулята норма по доле морфологически нормальных сперматозоидов снижена с 14 до 4 % [79]. В настоящее время анализ генетического материала сперматозоидов проводится по двум основным параметрам: число и структура хромосом сперматозоида и функциональное состояние ДНК. Численные нарушения кариотипа и несбалансированные структурные перестройки у человека приводят к остановке развития эмбриона на ранних стадиях, тяжелым врожденным аномалиям или бесплодию. Образование эмбрионов с несбалансиорванным хромосомным набором происходит достаточно часто. Так, до 15 % беременностей, полученных естественным путем, останавливаются в развитии до 13 недели и в 60 % случаев это вызвано нарушением кариотипа эмбриона [31, 29]. Описаны случаи полиплоидии и трисомии по всем хромосомам, кроме хромосом 1 и 19, что дает основание предполагать, что дисбаланс по генам, локализованным в этих хромосомах, нарушает доимплантационное развитие эмбриона или процесс имплантации [31]. Основной вклад в частоту анеуплоидии, обнаруживаемой в эмбрионах человека, вносится ооцитом, однако порядка 10 % анеуплоидий по аутосомам и 50 % анеуплоидий по гоносомам, а также большая часть структурных перестроек de novo, имеют отцовское происхождение [44, 30]. Успешное завершение развития эмбриона, по крайне мере, частично, зависит от целостности и зрелости ДНК сперматозоида. Имеются пороговые значения повреждений ДНК (к которым относятся фрагментация ДНК, нарушение компактной упаковки ДНК, дефицит протаминов), при которых отмечаются аномалии развития эмбрионов. В ряде исследований показано выраженное различие в содержании сперматозоидов с поврежденной ДНК между группами фертильных мужчин и пациентов с бесплодием [13]. Степень оплодотворения может быть близка к нулевой, если доля сперматозоидов с повреждением ДНК превышает 30 %, как при естественном зачатии, так и при внутриматочной инсеминации [43, 13]. Также есть мнение, что фрагментация ДНК не снижает оплодотворяющей способности сперматозоида, а имеет более отдаленные последствия, снижая способность эмбриона к имплантации [74, 53, 42]. Показано, что вероятность спонтанного прерывания беременности при повышении индекса фрагментации ДНК увеличивается в 2,5 раза [64]. Исследования, касающиеся массового анализа сперматозоидов из эякулята пациентов с высоким содержанием морфологически аномальных сперматозоидов, указывают на повышение доли гетероплоидии и доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК [16, 71]. Однако при ИКСИ такие данные малоинформативны. Очевидно, что при наличии в образце эякулята сперматозоидов с нормальной морфологией именно их следует отбирать для оплодотворения, но, если таких сперматозоидов нет, то возникает вопрос о приоритете выбора сперматозоида с той или иной патологией. Основные части сперматозоида: головка, шейка и хвост. Очевидно, что наиболее важны морфологические особенности головки, содержащей ядро, несущее всю генетическую информацию, и акросому — органоид для проникновения сперматозоида в ооцит. Изменения формы головки сперматозоида различны и могут быть как изолированными, так и сочетанными. Однако они могут быть объединены в несколько групп. 2.1. Изменение линейных размеров головки сперматозоида. Одним из наиболее распространенных морфологических изменений головки сперматозоида является пропорциональное изменение ее размеров. Размеры головки сперматозоида варьируют в широких пределах: от отсутствия головки, так называемая булавочная головка, до экстремально большой головки — мегалоцефалическая. Логично предположить, что изменения количества генетической информации при гетероплоидии могут отражаться на объеме головки сперматозоида. Действительно, у пациентов с преимущественно макроцефалической формой головки методом FISH показано значительное увеличение доли полиплоидных и дисомных сперматозоидов [72]. Результаты наших собственных исследований по анализу кариотипа индивидуальных сперматозоидов также подтверждают это наблюдение [2], хотя некоторые авторы в аналогичных экспериментах не отмечали увеличения частоты гетероплоидии в сперматозоидах с увеличенной головкой [41]. Помимо этого, незначительное увеличение размеров головки сперматозоида может быть связано с нарушением этапов ремоделирования хроматина и его компактизации, что осуществляется в основном за счет замены гистоновых белков на протаминовые, обеспечивая минимизацию объема головки сперматозоида и защиту целостности ее генетического материала. При нарушениях компактизации хроматина в ядрах головок сперматозоидов повышается его чувствительность к повреждающим факторам внешней среды (окисление или повышение температуры в женском генитальном тракте), что в свою очередь может приводить к фрагментации ДНК сперматозоида. Данные полученные разными исследовательскими группами противоречивы: одни обнаруживают взаимосвязь между увеличением головки сперматозоида и нарушением целостности его ДНК [45], другие не подтверждают этого [17]. Уменьшение размеров головки сперматозоида скорее вызвано не нарушением компактизации хроматина, а уменьшением размера акросомы или снижением объема генетического материала. Но прямых доказательств взаимосвязи между уменьшением размеров головки сперматозоида и нуллисомией не обнаружено [41]. Однако такое нарушение морфологии головки сперматозоида, помимо очевидных затруднений акросомной реакции и снижения эффективности оплодотворения в программах ИИ и ЭКО, приводит к снижению эффективности оплодотворения в циклах ИКСИ и нарушению развития эмбрионов [22, 60]. 2.2. Изменение формы головки сперматозоида с сохранением симметричности В одну группу можно отнести изменения формы сперматозоида с сохранением симметричности головки: вытянутая или сигарообразная, грушевидная и круглая. Наибольшее внимание в этой группе было уделено особенностям, связанным с круглой головкой сперматозоида. Основной характеристикой таких сперматозоидов является отсутствие акросомы, что приводит к невозможности самостоятельного оплодотворения, и поэтому для пациентов с глобозооспермией всегда проводится ИКСИ. Однако и при ИКСИ эффективность оплодотворения снижена, что вызвано снижением способности таких сперматозоидов к активации ооцита [28]. Наши собственные исследования не обнаружили повышения общего уровня численных и структурных хромосомных аномалий в сперматозоидах с круглой головкой [2], что согласуется с мнением других авторов [6, 27]. Но в аналогичных исследованиях зарегистрирован повышенный уровень анеуплоидии [12, 46]. В эякуляте пациентов с глобозооспермией отмечается также увеличение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК [27, 14]. К генетическим нарушением свойственным сперматозоидам с круглой головкой также относятся изменение соотношения протаминов P1/P2 и высокий уровень незамещенных гистонов [9]. Такие особенности делают сперматозоид более уязвимым к внешним воздействиям, что объясняет повышенный уровень фрагментации ДНК. Однако следует заметить, что диагноз глобозооспермия ставится при нарушении морфологии в 100 % сперматозоидах, а доля сперматозоидов с фрагментацией ДНК оставляет по разным данным от 13 до 80 % [27, 14]. Таким образом, нарушение структуры хроматина не является обязательной характеристикой сперматозоида с круглой головкой. Также следует отметить, что помимо нарушения головки для пациентов с глобозооспермией характерны аномалии шейки сперматозоидов, что также может являться причиной нарушения оплодотворения и дробления из-за дисфункции центросомы [5]. Грушевидная и удлиненная форма головка являются достаточно распространенными формами аномалии сперматозоидов. При удлиненной головке степень деформации может быть различной: от незначительного изменения соотношения длинны и ширины головки до сигарообразной формы. При анализе частоты гетероплоидии в таких сперматозоидах нами не было зарегистрировано повышения доли сперматозоидов с численными и структурными аберрациями, что противоречит некоторым данным литературы [2, 41, 77]. В отношении сперматозоидов с грушевидной головкой таких исследований не проводилось. 2.3. Изменение формы головки сперматозоида с нарушением симметричности Все изменения регулярной формы строения головки сперматозоида традиционно объединяются в группу аморфных головок. Такие изменения достаточно распространены и, по мнению многих авторов, связаны с наиболее серьезными нарушениями генетического материала сперматозоидов. Так, на увеличение доли гетероплоидии в таких сперматозоидах указывают данные, полученные как с использованием FISH [50], так и результаты кариотипирования индивидуальных сперматозоидов [2]. В этой связи уместно отметить, что хромосомы занимают строго определенное положение в головке сперматозоида [57, 15, 81]. По-видимому, дополнительный генетический материал может нарушать этот порядок и приводить не только к увеличению размера, но и к нарушению пропорций головки сперматозоида. Существуют данные, что у аморфных сперматозоидов чаще нарушено протаминирование ДНК и плотность упаковки хроматина [11], что вероятнее всего является причиной повышения уровня фрагментации ДНК [67]. Кроме того, для сперматозоидов с аморфной, а также грушевидной и удлиненной головкой также более характерно нарушение подвижности [39], что вероятно вызвано аномалиями шейки и может объяснить снижение эффективности оплодотворения такими сперматозоидами даже в программах ИКСИ [33, 39]. 2.4. Наличие вакуоли в головке Особую группу составляют сперматозоиды с вакуолизированной головкой. Этот тип аномалий часто сопутствует другим морфологическим изменениям головки, но иногда встречается и как изолированная патология. Это единственный тип аномалии, который может быть приобретен сперматозоидом уже после завершения этапа спермиогенеза и формирования головки [36]. Относительно происхождения вакуоли нет единого мнения: одни исследователи говорят о преимущественной акросомной локализации [68], другие об исключительно ядерной локализации [7]. Кроме того, размеры вакуолей широко варьируют: от маленьких, до занимающих большую часть головки. В последнем издании ВОЗ наличие 1 мелкой вакуоли не считается патологией. Наоборот, крупные вакуоли (занимающие более 13 % площади головки) по мнению многих исследователей, связаны с фрагментацией ДНК [63, 65, 7], нарушением конденсации хроматина, а также с повышением доли гетероплоидии [7]. 2.5. Аномалии шейки сперматозоида Очевидно, что значительные изменения в шейке сперматозоида, вызванные аномалиями локомоторного аппарата и отражающимися на ее морфологических особенностях, сказываются на подвижности сперматозоида и могут приводить к нарушениям оплодотворения и развития эмбриона (см. выше). Но оценивать морфологические особенности шейки сперматозоида даже при нормальной подвижности не менее важно. Так изменение только формы шейки сперматозоида значительно снижает эффективность оплодотворения и нарушает дальнейшее развитие эмбриона [76]. С другой стороны атипичное строение жгутика сперматозоида, оказывая влияние на подвижность сперматозоида, не влияет на эффективность оплодотворения в программах ИКСИ [33]. Таким образом, можно сделать заключение, что аномалии строения сперматозоида связаны с нарушением в строении и функционировании его генома и отражаются на развитии эмбриона. Однако и массовый и индивидуальный анализ позволяет говорить лишь о различной степени сопряженности этих характеристик. Данные о взаимосвязи между параметрами спермограммы, морфологическими особенностей сперматозоидов, частотой хромосомных аберраций и целостностью ДНК, указывают на вероятность того, что гены, участвующие в мейотическом делении, способные влиять на расхождение хромосом, по-видимому, могут обладать некоторым плейтропным действием и нарушать процесс спермиогенеза, а именно, характер упаковки хроматина и формирование головки сперматозоида. Принимая во внимание сохранение прямых цитоплазматических контактов между сперматидами одной генерации [23, 54], можно предполагать, что геномные и хромосомные мутации, возникающие на предшествующих стадиях сперматогенеза, могут оказывать прямой повреждающий эффект при упаковке ДНК и формировании головки спермия. При этом последний может проявляться не в единичных, а сразу во многих спермиях всей генерации, относящихся к одной волне сперматогенеза. Результаты анализа эякулята пациентов со сходными аномалиями головки сперматозоидов (аплазия акросомы) также указывают на существование наследственной компоненты [26]. Увеличение доли сперматозоидов с тяжелыми морфологическими аномалиями часто сопровождается и снижением концентрации спермиев, что вызвано не снижением спермопродукции, а блокированием сперматогенеза, с последующей деградацией сперматогенных клеток [2]. Усиление апоптотических процессов в сперматогенезе изменяет микроокружение нормальных сперматогониев, что может являться причинной мейотических нарушений и образования гетероплоидных сперматозоидов [51]. Возможно, что такая ситуация приводит к аномальной компактизации хроматина, провоцируя образование разрывав в ДНК, и влияет на процесс формирования головки сперматозоида. Можно утверждать, что нормальная морфология и подвижность сперматозоида не гарантирует отсутствие генетических и цитологических дефектов, и наоборот, при большинстве вариантов морфологических аномалий возможно нормальное оплодотворение и развитие эмбриона (исключение составляют только мегалоцефалические головки сперматозоидов), что дает шанс на рождение здорового ребенка и при очень тяжелых формах астено и тератозооспермии. Тем не менее, в клинической практике предлагаются насколько способов оценки потенциала сперматозоида с целью повышения эффективности процедуры ИКСИ. Сейчас наиболее распространенным является метод, предложенный доктором Бенжамином Бартов — ИМСИ (IMSI — motile sperm organellar morphology examination), в котором используются строгие критерии, разработанные на основе результатов сканирующей электронной микроскопии: гладкость, симметричность и форма сперматозоида [48, 59, 58]. Оценивается морфологический статус 6 субклеточных органелл: акросома, постакросомальный регион, шейка, митоходрии, хвост и головка. Грубые аномалии строения, такие как аморфная, конусовидная, круглая, точечная или многоядерная головка из отбора исключаются сразу, остальные сперматозоиды делятся на 3 категории качества по наличию вакуолей и овальности строения головки. Авторы сообщают об увеличении эффективности до 66 %. Другая школа основана на бальной оценке головки, имеющихся вакуолей и базальной части сперматозоида. Норма — 1 балл, патология — 0 баллов. Окончательная оценка сперматозоида вычисляется по формуле: оценка = (балл головки*2)+ (балл вакуолей*3)+ (балл базальной части), тогда как акросома, шейка и цитоплазматическая капля являются второстепенными критериями. Таким образом, оценка сперматозоида составляет от 0 до 6 баллов, с максимальным баллом для морфологически нормального сперматозоида [3]. Согласно результатам последних лет использование ИМСИ оправдано. ИМСИ не увеличивает эффективность оплодотворения, но значительно улучшает имплантацию эмбрионов, вероятность наступления беременности, и снижает риск спонтанного прерывания беременности [34], а также снижает вероятность образования эмбриона с несбалансированным кариотипом [49]. 2.6. Отбор сперматозоидов по биохимическим маркерам Поверхностная мембрана сперматозоидов человека — важная составляющая, определяющая возможность оплодотворения в естественных условиях и в условиях in vitro. Будучи гаплоидными клетками, сперматозоиды имеют поверхностные антигены, отличные от остальных соматических диплоидных клеток. Сперматогенный эпителий хорошо защищен от инфекционных и токсических воздействий гематотестикулярным барьером, который нарушается в исключительных случаях. При повреждении проницаемости или структуры этого барьера, образованного собственной оболочкой семенных канальцев и цитоплазмой сустентоцитов, сперматозоиды вызывают синтез антиспермальных антител (IgG и IgA), которые связываясь с поверхностными антигенами сперматозоидов (белками теплового шока HSP), ингибируют нормальную акросомную реакцию и связывание сперматозоида с блестящей оболочкой, препятствуя оплодотворению [52]. Наиболее частыми причинами образования антиспермальных антител являются инфекции, варикоцеле, крипторхизм и аутоиммунные заболевания. По результатам ИКСИ с использованием таких сперматозоидов эффективность оплодотворения, развитие эмбрионов и частота наступления беременности не снижена [61]. В качества антигенов для иммуноглобулинов чаще всего выступают белки теплового шока [37]. Наибольшее внимание уделяют тестис-специфичному белку HSPA2, относящемуся к группе шаперонов HSP70. Синтез этого белка начинается в профазе мейоза (лепотена-зиготена), он участвует в формировании синаптонемного комплекса, связываясь с латеральным элементом, принимает участие в регуляции клеточного цикла и апоптотических процессов [18]. Мутации, связанные с нарушением работы этого белка приводят к аномалиям мейоза, что является причиной блокирования сперматогенеза, снижения концентрации сперматозоидов и повышения частоты гетероплоидии в зрелых сперматозоидах. Вторая волна экспрессии гена HSPA2 происходит во время созревания сперматид, белок принимает участие в качестве шаперона в компактизации хроматина сперматозоида, замене гистонов протаминами в сперматидах [56]. Полагают также, что такие события как экструзия цитоплазмы, ремоделирование плазматической мембраны и формирование рецепторов связывания с блестящей оболочкой и гиалуроновой кислотой также протекают с участием этого белка [32]. Сейчас в лабораторную практику вводят отбор сперматозоидов по способности связываться с гиалуроновой кислотой. Гиалуроновая кислота является основным компонентом внеклеточного матрикса кумулюсных клеток и играет решающую роль в отборе сперматозоидов способных к оплодотворению. Только зрелые сперматозоиды способны связаться с яйцеклеткой. Фактически, гиалуроновая кислота играет роль фактора для «физиологического отбора» и ИКСИ с использованием гиалуроновой кислоты имеет собственное название ПИКСИ (Physiologic ICSI). Многочисленные исследование показали, что сперматозоиды связывающиеся с гиалуроновой кислотой, обладают целостной ДНК [69], низким уровнем остаточных гистонов [21] и сниженным уровнем анеуплоидии [35], что положительно сказывается на качестве полученных эмбрионов и частоте наступления беременности [55, 20]. Возможно именно этот механизм, опосредованный через экспрессию HspA2, обеспечивает естественный отбор яйцеклеткой генетически сбалансированных сперматозоидов. По данным некоторых исследователей отбор сперматозоидов одновременно по методике ПИКСИ (способность связываться с гиалуроновой кислотой) и ИМСИ (отбор по морфологии) повышает эффективность оплодотворения, скорость дробления эмбрионов и частоту наступления беременности [62]. Однако специальные исследования, направленные на выявление взаимосвязи между морфологическими особенностями сперматозоидов и степенью их готовности к оплодотворению, не находят корелляции между этими двумя параметрами [19]. На настоящем этапе развития ВРТ подобные исследования имеют важное значение для оценки потенциала оплодотворения сперматозоида и их влияния на развитие эмбриона. Кроме того, это позволит оценить возможный генетический риск передачи потомству наследственной патологии и найти подходы к контролю за увеличением генетического груза популяции, связанного с применением ВРТ.

About the authors

Irina Dmitrievna Fedorova

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology NWD RAMS

Email: irendf@mail.ru
PhD, senior Researcher, embryologist, department of artificial redproductive technologies

Evgeniya Michailovna Shilnikova

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology NWD RAMS

Email: iagmail@ott.ru
PhD student, department of genetics and breeding, Saint-Petersburg State University, Laboratory of prenatal diagnostics of inherited and congenital human diseases, Department of artificial redproductive technologies

Alexander Mkrtichevich Gzgzyan

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology NWD RAMS

Email: iagmail@ott.ru
Full Doctor, the head of the department of of artificial redproductive technologies

References

Supplementary files