Features of oxidative modification of proteins and erythrocyte functional state in pregnancy complicated by placental insufficiency

Full Text

Известно, что одним из патогенетических механизмов формирования хронической плацентарной недостаточности (ХПН) является окислительный стресс, причина которого - избыточное образование активных форм кислорода и истощение механизмов антиоксидантной защиты [2, 8, 10]. Окислительная модификация белков (ОМБ), в результате которой изменяются структура, физико-химические и биологические свойства белковой молекулы, считается ранним и наиболее надежным индикатором окислительного стресса и поражений тканей при свободно-радикальной патологии [4]. Диагностика окислительного стресса невозможна без учета состояния антиоксидантной системы (АОС) организма. Одним из основных показателей, характеризующих работу многих ее компонентов, считается уровень в крови восстановленных тиолов, которые являются низкомолекулярными антиоксидантами и проявляют как антирадикальное, так и антиперекисное действие. Кроме того, они являются кофакторами глутатионовых ферментов (глютатионпероксидазы, глютатионредуктазы и др.), участвующих в антиоксидантной защите организма [1, 4, 12, 29]. В литературе имеются единичные сведения, касающиеся особенностей ОМБ [9, 19, 30] или содержания восстановленных тиолов [33] при беременности, осложненной ХПН или задержкой внутриутробного развития плода (ЗВРП). Одним из интегральных показателей прооксидантно-антиоксидантного равновесия в организме считается качественный состав эритроцитов и их деформационные характеристики [5], изменение которых наблюдается в результате окислительного повреждения структурных элементов (белков, липидов) эритроцитарной мембраны. Однако сведения о функциональном состоянии эритроцитов при физиологической и осложненной ХПН беременности немногочисленны и противоречивы [15, 22, 24, 31]. Цель настоящей работы - изучить интенсивность ОМБ и уровень восстановленных тиолов в крови в сопоставлении с функциональным состоянием эритроцитов при беременности, осложненной ХПН. Материалы и методы исследований В настоящее исследование включены 109 женщин. Основную группу составили 72 беременные (средний возраст 29,00 ± 0,68 лет), которые были разделены на 2 группы. В первую группу вошли женщины (n=31), беременность у которых осложнилась ХПН, во вторую - здоровые женщины (n = 41) с физиологическим течением беременности. Контрольную группу составили 37 здоровых небеременных женщин (средний возраст 27,81 ± 0,92 года). Диагноз ХПН во время беременности устанавливали на основании клинического обследования, данных соматического, акушерско-гинекологического анамнеза, анализа течения настоящей беременности, данных ультразвуковой фетометрии и допплерометрии. Наличие субкомпенсированной формы ХПН было подтверждено гистологическим исследованием плаценты. Критериями исключения для всех групп являлись многоплодная беременность, курение, сахарный диабет, бронхиальная астма, хроническая обструктивная болезнь легких, перенесенные менее чем за 2 недели до обследования острое респираторное или обострение хронического заболевания. Забор крови для исследования проводили в утренние часы: у пациенток основной группы - в третьем триместре беременности (36,76 ± 0,35 нед.), у женщин контрольной группы - на 7-10 день менструального цикла. Для определения уровня ОМБ и восстановленных тиолов использовали образцы венозной крови, для оценки функционального состояния эритроцитов - образцы капиллярной крови. Для количественного определения продуктов ОМБ применяли метод, описанный Levine R. L. et al. (1990), в модификации Дубининой Е. Е. и соавт. (1995), основанный на реакции взаимодействия карбонильных производных окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов, которые регистрировали спектрофотометрически [4, 21]. Продукты реакции, образовавшиеся на стадии инициации процесса, регистрировали при длине волны 270 нм, а на стадии элонгации - при 363 нм. Количество продуктов ОМБ выражали в единицах оптической плотности, рассчитанной на 1 мг белка (Е/мг белка). Для оценки индуцированной ОМБ использовали величину приращения ОМБ, вычитая из значений, полученных в пробе после стимуляции реактивом Фентона, значения спонтанной ОМБ. Спонтанная ОМБ является показателем, характеризующим базальный уровень окисленных белков. Индуцированная ОМБ указывает на наличие субстрата для свободно-радикальных процессов, то есть является показателем устойчивости системы к переокислению. Количество восстановленных тиолов определяли по методу Соколовского В. В. и соавт. [11]. Результаты выражали в мкМ в расчете на 1 мл. Для оценки функционального состояния эритроцитов применяли метод, основанный на свойствах эритроцитов увеличивать объем и гемолизировать при помещении в аммонийную среду (140 мМ NH4Cl, 5 мМ глюкозы, 5 мМ KCl, 1 мМ CaCl2, 5 мМ HEPES). Оценку количества подвергшихся гемолизу красных клеток крови осуществляли с помощью техники малоуглового светорассеяния [25]. Этот метод позволяет количественно оценить популяцию клеток с хорошими деформационными свойствами и одновременно определить долю вступивших в стадию апоптоза и не способных гемолизировать эритроцитов и, следовательно, прогнозировать их функциональную активность [7]. Кинетику гемолиза в аммонийной среде характеризовали рядом параметров: %gem - процент гемолизированных эритроцитов, Vgem - максимальная скорость гемолиза ( %/сек), Tgem - время достижения максимальной скорости гемолиза (с). Высокий процент эритроцитов, подвергшихся гемолизу в аммонийной среде, указывает на их хорошую деформируемость. Методы описательной статистики включали среднюю арифметическую величину (М), среднее квадратическое отклонение (σ) и среднюю ошибку средней величины (m). Достоверность различий независимых выборок оценивали, используя критерий Манна-Уитни. Для выявления взаимосвязей между показателями, оценки их силы и направления применяли непараметрический корреляционный анализ Спирмена. Различия считались достоверными при уровне значимости p < 0,05. Статистическую обработку материала проводили с помощью стандартного приложения прикладных программ «Statistica» для персонального компьютера. Результаты исследований и их обсуждение Результаты исследования показали, что у беременных с ХПН наблюдается высокая частота экстрагенитальной патологии (табл. 1). Из таблицы 1 видно, что у них преобладали заболевания эндокринной, иммунной, сердечно-сосудистой и мочевыделительной систем. Стоит отметить, что патология трех и более функциональных систем организма у пациенток с ХПН встречалась в 8 раз чаще, чем у женщин с физиологическим течением беременности, что могло быть причиной развития этого осложнения. Кроме того, 74 % пациенток первой группы и лишь 44 % беременных второй группы (p < 0,05) имели отягощенный акушерско-гинекологический анамнез (невынашивание беременности, бесплодие, хронические урогенитальные инфекции, нарушение менструального цикла, миома матки, эндометриоз). Результаты исследования показателей ОМБ и уровня восстановленных тиолов в крови представлены в таблице 2. Видно, что интенсивность спонтанной ОМБ у пациенток с ХПН имеет тенденцию к повышению в 1,4 раза по сравнению с этим показателем у здоровых беременных, а интенсивность индуцированной ОМБ у них значительно меньше, что свидетельствует об истощении резерва белков для окисления. В то же время при отсутствии ХПН содержание продуктов ОМБ у беременных существенно не отличается от такового у небеременных женщин. При ХПН значительно снижается уровень восстановленных тиолов (табл. 2), что в сочетании с уменьшением резервов белков для окисления указывает на развитие окислительного стресса и истощение АОС. Результаты определения функционального состояния эритроцитов представлены в таблице 3. Видно, что при ХПН происходит значительное снижение процента эритроцитов, подвергшихся гемолизу в аммонийной среде. При физиологической беременности, напротив, наблюдается повышение этого показателя, то есть функциональное состояние эритроцитов улучшается. Корреляционный анализ показал (табл. 4), что при увеличении интенсивности спонтанной и уменьшении индуцированной ОМБ происходит снижение числа эритроцитов, подвергшихся гемолизу в аммонийной среде. Степень снижения этого показателя коррелирует также с уменьшением уровня восстановленных тиолов. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что при осложнении беременности ХПН наблюдается усиление процессов ОМБ и истощение глутатион-зависимого звена АОС, что указывает на участие процессов свободно-радикального окисления белков в патогенезе этого осложнения. В литературе мы встретили единичные сведения об увеличении количества продуктов ОМБ в крови беременных с ЗВРП [19], а также в плаценте при ХПН [9]. Другие исследователи [33] указывают на снижение уровня восстановленных тиолов в крови при ЗВРП. Одной из причин усиления окислительных процессов можно считать наличие соматической патологии у беременных первой группы. Известно, что даже вне беременности заболевания сердечно-сосудистой, мочевыделительной, эндокринной, иммунной систем сопровождаются нарушением прооксидантно-антиоксидантного равновесия в организме [14, 23, 26, 32]. При беременности происходит перестройка работы многих функциональных систем, в том числе про- и антиоксидантной, что было показано в нашем предыдущем исследовании [13] и ряде работ других авторов [3, 20, 28, 29]. Поэтому можно полагать, что наличие множественной соматической патологии (трех и более функциональных систем) играет роль в развитии окислительного стресса при беременности. Известно, что ранней мишенью свободно-радикального окисления являются белки эритроцитов (гемоглобин, белки мембраны) [5]. У пациенток с ХПН обнаружено значительное уменьшение количества эритроцитов, подвергшихся гемолизу в аммонийной среде. Эти результаты согласуются с данными литературы [31] и свидетельствуют о снижении доли клеток с хорошими деформационными свойствами в результате их вступления в стадию апоптоза. Такие изменения могут играть роль в развитии ХПН за счет ухудшения реологических свойств крови и снижения эффективности капиллярного кровотока в ворсинах хориона [17, 18]. У здоровых беременных, напротив, наблюдается улучшение функционального состояния эритроцитов, что можно рассматривать как приспособительный механизм, развивающийся в организме при физиологической беременности и направленный на создание и поддержание эффективной плацентарной микроциркуляции и нормального развития плода. Важно также отметить выявленную нами взаимосвязь показателей ОМБ и уровня восстановленных тиолов в крови с функциональным состоянием эритроцитов. Это согласуется с литературными сведениями о том, что качественный состав эритроцитов является одним из значимых показателей прооксидантно-антиоксидантного равновесия в организме [5]. Известно, что, кроме эритроцитарных белков, окислительной деструкции подвергаются и белки плаценты [9], что способствует развитию ХПН. Функциональное состояние плаценты во многом определяется состоянием ее белкового компонента. Так, известно, что белки-транспортеры обеспечивают поступления макронутриентов через плацентарную мембрану к плоду [16, 27]. Белки, входящие в состав рецепторов гормонов и факторов роста, участвуют в регуляции роста плаценты и плода [27]. Изменение этих рецепторов осложняет реализацию биологических эффектов гормонов и факторов роста, которая зависит не только от содержания самого гормона, но и от количества рецепторного белка, а также сохранения нативной структуры рецептора, определяющей сродство к гормону [6]. Синтетическая функция и метаболизм плаценты также тесно связаны с активностью белков, входящих в состав различных ферментов. Митохондриальные белки ответственны за энергетический потенциал клеток плаценты. Изменение структуры негистоновых белков хроматина, являющихся регуляторами биологической активности ДНК, может оказывать негативное влияние на метаболические процессы в плаценте [9]. Следовательно, изменение структуры, физико-химических и биологических свойств белковых молекул, происходящее в результате их окислительной модификации, может приводить к развитию ХПН. Таким образом, полученные результаты указывают на роль ОМБ в патогенезе ХПН. Показатели индуцированной ОМБ и уровень восстановленных тиолов, а также функциональное состояние эритроцитов являются маркерами этого осложнения беременности и могут быть использованы для диагностики ХПН и контроля эффективности применяемой терапии.

About the authors

Anna Aleksandrovna Shevelkova

I. P. Pavlov First State Medical University of St. Petersburg

Email: gavrilova_aa@mail.ru
post-graduate student

Eduard Karpovich Aylamazyan

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: iagmail@ott.ru
academician, professor

Inna Ivanovna Evsyukova

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: eevs@yandex.ru
MD, professor, the head of the Department of physiology and pathology of newborns

References

Supplementary files