Assessment of endometrial receptivity by biomarkers

Abstract

Endometrial receptivity defect can lead to a recurrent failures in ART. Data on endometrial receptivity assessment by the most studied biomarkers, such as pinopodes, leukemia-inhibitory factor, αVβ3 integrin, mucin MUC 1, are presented. Analysis of controlled ovarian stimulation protocols influence on endometrial receptivity is composed.

Full Text

Бесплодный брак остается одной из важнейших медицинских и социально-экономических проблем во всем мире, в решении которой вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) приобретают все большее значение. Имплантация эмбриона является сложным многоступенчатым процессом. По современным представлениям, важную роль в этом процессе играют реципрокные взаимодействия эндометрия, с одной стороны, и бластоцисты — с другой. Имплантация эмбриона контролируется цитокинами, простагландинами, факторами роста, молекулами адгезии, а также множеством других гуморальных, клеточных факторов и межклеточных взаимодействий [21, 44]. Успешность имплантации во многом зависит как от качества эмбриона, так и морфофункционального состояния эндометрия. Нарушение рецептивности наблюдается при таких заболеваниях, как эндометриоз, синдром поликистозных яичников, патологии маточных труб [2, 12, 13, 40, 59, 63]. В литературе обсуждается возможное влияние миомы матки на рецептивность эндометрия [11, 35, 37]. Нарушение рецепторного аппарата эндометрия может послужить причиной многократных неудач при проведении программ ВРТ. Поэтому в настоящее время исследователями разных стран уделяется большое внимание изучению состояния эндометрия и ведется поиск новых информативных биологических маркеров окна имплантации, позволяющих прогнозировать наступление беременности в программах ВРТ. На сегодняшний день для оценки рецепторных свойств эндометрия предложен целый ряд потенциальных биомаркеров. В данной статье будут рассмотрены некоторые из них. К наиболее изученным биомаркерам окна имплантации относятся пиноподии. Пиноподии представляют собой микроскопические выпячивания на апикальной поверхности эпителиальных клеток эндометрия, выступающие в полость матки. Развитие пиноподий связано с подъемом уровня прогестерона в среднюю фазу секреции, а также, по некоторым данным, с экспрессией лейкемия-ингибирующего фактора (LIF), интегрина αVβ3 [15, 30, 36, 68, 70]. Кроме того, важную роль в формировании пиноподий играют гены HOXA 10, блокирование которых у мышей приводит к резкому уменьшению количества пиноподий [8]. В исследованиях на крысах было показано, что появление пиноподий строго соответствует короткому периоду окна имплантации [16]. Однако вопрос, могут ли пиноподии быть надежным маркером рецептивности эндометрия у человека, остается спорным [72, 75]. Bentin-Ley U. et al. в условиях in vitro продемонстрировали преимущественное взаимодействие эмбрионов с участками эндометрия, на которых эпителиальные клетки содержали пиноподии, предполагая участие пиноподий в процессе адгезии бластоцисты [58]. В исследованиях, проведенных Psychyos A. et al., а позднее и другими авторами, появление пиноподий совпадало с непродолжительным окном имплантации [54, 61]. В связи с чем пиноподии активно выдвигались на роль достоверного маркера рецептивности эндометрия. В 2004 году Pantos et al. предприняли попытку использовать определение пиноподий в практике для улучшения клинических результатов [14]. Пациенткам с первичным бесплодием, имеющим в анамнезе 3 и более неудачные попытки переноса эмбрионов, проводили биопсию эндометрия на 6-й и 8-й дни от начала терапии прогестероном. Для каждой пациентки устанавливали день, соответствующий максимальной рецептивности, путем выявления зрелых пиноподий. В первой группе перенос донорских эмбрионов проводился в соответствии с установленным днем. Во второй группе перенос эмбрионов осуществлялся по стандартному протоколу на 5-й день от начала терапии прогестероном. В результате в группе с модифицированным протоколом роды произошли у 67 % пациенток. В то время как во второй группе — только у 25 %. Однако имеется множество публикаций, подвергающих сомнению ценность пиноподий в роли маркера «окна имплантации». Так, Ordi J. et al. при исследовании биоптатов эндометрия, полученных от здоровых женщин в трех последовательных циклах на 7-й день после овуляции, показали, что наличие и выраженность пиноподий может значительно отличаться от цикла к циклу [75]. В ряде исследований было показано, что пиноподии могут присутствовать всю среднюю и позднюю фазы секреции, однако претерпевая циклические морфологические изменения [68, 72]. Пиноподии были обнаружены у женщин, страдающих бесплодием [4, 27, 70, 72]. При сравнении количества пиноподий, обнаруженных в биоптатах эндометрия, полученных от пациенток с бесплодием, обусловленным эндометриозом I–II стадии, идиопатическим бесплодием и пациенток, прошедших хирургическую стерилизацию, составивших контрольную группу, статистически значимого различия найдено не было [27]. Схожие результаты были получены и другими авторами [4]. Mikolajczyk M. et al. не удалось выявить корреляционной связи между формированием пиноподий и экспрессией LIF [51]. Таким образом, значимость пиноподий для определения рецептивности эндометрия остается недоказанной. Для оценки способности эндометрия к имплантации у пациенток с бесплодием широко используется определение экспрессии αVβ3 интегрина. Интегрины относятся к молекулам адгезии, они представлены семейством гетеродимерных трансмембранных гликопротеинов, выполняющих множество функций в клетке, в том числе в эндометрии. Рядом авторов было показано, что экспрессия αVβ3 интегрина совпадает с «открытием» окна имплантации и имеет устойчивую корреляционную связь с гистологической картиной эндометрия [45]. Lessey B. et al. при иммуногистохимическом исследовании биоптатов эндометрия, полученных в первом триместре у 112 пациенток, показали, что экспрессия αVβ3 интегрина сохраняется при беременности и распространяется на децидуальные клетки [31]. Также Lessey B. et al. выявили значительное снижение экспрессии αVβ3 интегрина у пациенток с бесплодием, обусловленным эндометриозом легкой степени [31]. Позднее было обнаружено снижение экспрессии в эндометрии αVβ3 интегрина при наличии гидросальпинксов. Хирургическая коррекция в объеме тубэктомии приводила к восстановлению экспрессии данного маркера. При этом другие вмешательства, включающие неосальпингостомию, лигирование и аспирацию, оказались менее эффективными в этом отношении [40]. В литературе описаны попытки использования определения αVβ3 интегрина в качестве предиктора успешности программ ВРТ [26, 55, 43]. В исследовании, проведенном Thomas K. et al., экспрессия αVβ3 интегрина была статистически значимо выше у пациенток с успешным результатом лечения. Однако беременности были получены у нескольких пациенток при отсутствии экспрессии данного маркера [26]. Схожие результаты были получены Revel A. et al. в 2005 году [43]. Так, частота наступления беременности в программах ВРТ была почти в два раза выше у пациенток с нормальной экспрессией β3 интегрина. Однако не во всех исследованиях удалось подтвердить информативность интегринов в качестве биомаркеров рецептивности [18, 34, 46, 75]. В исследовании, проведенном Hii L. и Rogers P., значимого изменения в экспрессии αVβ3 интегрина в клетках железистого эпителия в течение менструального цикла как у пациенток с эндометриозом, так и у пациенток контрольной группы, не имеющих данного заболевания, установлено не было [34]. Кроме того, статистически значимого различия в экспрессии данного биомаркера в клетках железистого эпителия у пациенток обеих групп найдено не было. Creus M. et al. также не удалось выявить различия в экспрессии интегринов у пациенток с эндометриозом и пациенток с другими причинами бесплодия [46]. Экспрессия интегринов у пациенток, спонтанно забеременевших в течение года, и пациенток с сохранившимся бесплодием была схожей. Ordi J. et al. в 2003 году показали, что экспрессия αVβ3 интегрина в течение нескольких менструальных циклов характеризуется значительной вариабельностью [75]. Acosta et al. выявили асинхронность появления пиноподий и экспрессии αVβ3 интегрина. Так, пиноподии определялись с 20–21-го дня и сохранялись до 28-го дня менструального цикла. Экспрессия αVβ3 в поверхностном и железистом эпителии начиналась с 22 дня, то есть через 48 часов после появления пиноподий [23]. Схожие результаты были получены и другими авторами. В исследовании, проведенном Thomas K. et al., достоверного различия в экспрессии αVβ3 между группой пациенток с мужским фактором бесплодия, группой пациенток с другими причинами бесплодия, включающую трубно-перитонеальный фактор, бесплодие, обусловленное эндометриозом, идиопатическое бесплодие и контрольной группой фертильных женщин найдено не было [25]. В более позднем исследовании, Surrey E. et al. изучали информативность определения экспрессии αVβ3 интегрина для прогнозирования эффективности применения супердлинного протокола у пациенток с эндометриозом [18]. Частота наступления клинической беременности, частота имплантации значимо не различались не зависимо от того, проводилось ли предварительное лечение агонистами ГнРГ или нет как в группе с положительной экспрессией интегрина, так и в группе с отрицательной экспрессией. Однако отрицательные результаты могли быть связаны с малой выборкой. Важную роль в регуляции имплантации играет широкий спектр цитокинов. Одним из них является лейкемия-ингибирующий фактор, относящийся к семейству интерлейкина-6. Доказательством влияния LIF на процесс имплантации послужил тот факт, что у мышей, гомозиготных по дефектному гену LIF, имплантация эмбрионов не происходит [65]. Влияние LIF на процесс имплантации реализуется посредством связывания цитокина с рецептором LIF-R с последующей активацией различных сигнальных путей. Несмотря на то, что данные об экспрессии LIF на протяжении пролиферативной и ранней секреторной фазы несколько противоречивы, значительное повышение экспрессии данного фактора в среднюю и позднюю секреторную фазу многократно подтверждено различными исследователями [48, 50]. LIF экспрессируется в поверхностном железистом эпителии и строме эндометрия. Однако в отличие от эпителия в строме эндометрия изменения экспрессии данного фактора на протяжении менструального цикла не наблюдается. Для пациенток с бесплодием, особенно имеющим в анамнезе повторяющиеся неудачные попытки ЭКО, характерно нарушение экспрессии LIF, что также подтверждает важную роль данного фактора в процессе имплантации. Кроме того, мутации гена LIF могут быть причиной повторяющихся неудачных попыток ЭКО [47, 49]. При исследовании эксплантатов эндометрия пациенток с идиопатическим бесплодием секреция LIF в секреторную фазу повышалась незначительно по сравнению с пролиферативной [33]. Аналогично концентрация LIF в смывах из полости матки была значимо ниже у пациенток с идиопатическим бесплодием по сравнению с контрольной группой фертильных женщин [73]. Данная методика определения LIF была предложена для оценки вероятности наступления беременности [69]. Схожие результаты были получены и другими авторами [7]. Однако, по данным Mikolajczyk M. et al., различия экспрессии LIF между пациентками с эндометриозом I–II стадии и контрольной группой фертильных женщин найдено не было [52]. Serafini P. et al. продемонстрировали, что пациентки с высоким уровнем экспрессии LIF в период окна имплантации имеют большую вероятность наступления беременности по сравнению с пациентками с низкой экспрессией данного фактора [22]. Снижение экспрессии в эндометрии LIF было обнаружено у пациенток с бесплодием при наличии гиросальпинксов. При этом оперативное лечение в объеме тубэктомии приводило к восстановлению экспрессии данного маркера [64]. Проводились исследования по улучшению рецептивности эндометрия путем назначения рекомбинантнго LIF человека (r-hLIF). Однако по данным, полученным Brinsden et al., терапия r-hLIF в течение лютеиновой фазы после переноса эмбриона у пациенток с повторяющимися неудачными попытками не привела к улучшению клинических результатов [62]. Муцины представляют собой семейство высокогликозилированных протеинов с большой молекулярной массой. Наиболее изученным является MUC-1. Гену, кодирующему MUC-1, присущ полиморфизм. Вариации в аллелях касаются исключительно числа повторов и не затрагивают саму нуклеотидную последовательность повтора, напрямую коррелируя с полиморфизмом на уровне белка. MUC-1 был определен в эндометрии. В течение менструального цикла наблюдаются колебания экспрессии MUC-1. В исследованиях на мышах, крысах, свиньях было обнаружено снижение экспрессии MUC-1 в период окна имплантации. В связи с чем предполагалась ингибирующая роль MUC-1 в процессе имплантации. Однако при исследовании эндометрия пациенток было обнаружено повышение экспрессии данного фактора в периимплантационный период [6]. Horne A. et al. в 2002 году с помощью сканирующей электронной микроскопии в комбинации с иммуногистохимическим исследованием эндометрия удалось обнаружить MUC-1 только на поверхности реснитчатых клеток. При этом MUC-1 на поверхности клеток, лишенных микроворсинок, а также на поверхности пиноподий не определялся [5]. При исследовании процесса имплантации в условиях in vitro MUC-1 в эпителии под фиксированной бластоцистой и в ближайшей окружности не обнаруживался [38]. Было сделано предположение, что факторы на поверхности бластоцисты или секретируемые самой бластоцистой вызывают локальную потерю MUC-1 [67]. У пациенток с повторными потерями беременности экспрессия MUC-1 в среднюю лютеиновую фазу снижена по сравнению с группой фертильных женщин. При сравнении полиморфизма MUC-1 у пациенток с повторными имплантационными потерями было обнаружено повышение частоты носительства короткого варианта аллеля MUC-1 по сравнению с контрольной группой [53]. Таким образом, первичное бесплодие, связанное с нарушением имплантации, может быть обусловлено полиморфизмом гена MUC-1, приводящим к образованию белка со сниженным количеством повторяющихся последовательностей из 20 аминокислот. Также к биомаркерам, потенциально участвующим в имплантации, относятся трофинин, лиганд L-селектина, гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста и многие другие. Однако их роль в оценке рецептивности эндометрия изучена недостаточно. Современные исследования в области иммунологии, протеомики, эпигенетики значительно расширяют список потенциальных биомаркеров, ассоциированных с окном имплантации [3, 9, 10, 17, 29, 32, 39, 41, 60, 66, 74]. Появление геномных биочипов расширило представление о характере экспрессии генов в течение менструального цикла, причем в некоторых исследованиях был обнаружен определенный спектр генов, экспрессируемых в середину секреторной фазы. Diaz-Gimeno P. et al. в 2011 году разработали диагностический метод оценки рецептивности эндометрия, основанный на применении биочипов [1]. Возможность использования более узкого набора генов, временно экспрессируемых в соответствии с фазой рецептивности, делает технологию менее затратной по сравнению с применением биочиопов для оценки полного спектра экспрессируемых генов. Однако дальнейшие исследования необходимы для демонстрации ценности данного диагностического подхода в клинической практике. По многим данным, контролируемая овариальная стимуляция (КОС) негативно сказывается на рецептивности эндометрия. Так, Chen Q. et al. проводили оценку экспрессии β3 интегрина и LIF у пациенток с мужским фактором бесплодия в стимулированном цикле с использованием агонистов ГнРГ и р-ФСГ по длинному протоколу и фертильных женщин в натуральном цикле [20]. В результате исследования была выявлена более низкая экспрессия указанных маркеров в стимулированных циклах по сравнению с натуральными как в группе пациенток с высоким ответом, так и с умеренным. При этом экспрессия LIF в железистом эпителии у пациенток с высоким ответом была ниже по сравнению с пациентками с умеренным ответом. Рядом авторов было продемонстрировано, что КОГ приводит к более раннему образованию пиноподий по сравнению с натуральным циклом [24, 28]. Однако в более позднем исследовании при оценке экспрессии пиноподий у одной и той же пациентки в натуральном и стимулированном цикле различия найдено не было [70]. При изучении экспрессии β3 интегрина в среднюю лютеиновую фазу были получены противоречивые результаты. Так, КОС приводила как к снижению, так и к повышению экспрессии αVβ3 интегрина [70, 71]. В исследованиях на мышах Ruan H. также показали, что овариальная стимуляция приводит к снижению экспрессии β3 интегрина и LIF, а также к снижению частоты имплантации по сравнению с контрольной группой, не получавшей терапию. Однако в группе мышей, получавшей агонисты ГнРГ, все перечисленные параметры были выше по сравнению как с группой, в которой стимуляция проводилась с применением антагонистов ГнРГ, так и с группой, получавшей только гонадотропины сыворотки жеребых кобыл (СЖК) [56]. Схожие результаты были получены Pan Y. et al. [57]. Экспрессия LIF в группах мышей, в которых проводилась суперовуляция с использованием агонистов ГнРГ или только гонадотропинов СЖК, была ниже по сравнению с контрольной группой. При этом экспрессия LIF в группе мышей, получавшей агонисты ГнРГ, была выше, по сравнению с группой, получавшей только гонадотропины. Zhang C. et al. при изучении экспрессии LIF и формирования пиноподий в исследовании на мышах получили следующие результаты [19]. В группах мышей, в которых проводилась стимуляция суперовуляции (группа A), наблюдалось нарушение развития пиноподий по сравнению с контрольной группой мышей, не получавших терапию (группа D), а также группами мышей, в которых в стимулированном цикле проводилась терапия прогестероном с целью поддержки лютеиновой фазы (группа B) или прогестероном в сочетании с эстрадиолом (группа С). Экспрессия LIF в группах C и D значимо не различалась и была выше по сравнению с группами A и B. При этом в группе B экспрессия LIF все же была выше по сравнению с группой A. Однако в клиническом исследовании, проведенном van der Gaast M. et al., экспрессия LIF в стимулированных циклах с использованием антагонистов ГнРГ и натуральных циклах не различалась [42]. Эндометрию принадлежит одна из ключевых ролей в процессе имплантации. Поиск достоверных биомаркеров рецептивности эндометрия остается актуальной задачей, решение которой позволит повысить эффективность диагностики и лечения бесплодия.