New applications of oocyte vitrification in assisted reproductive technology

Full Text

Эра криоконсервации половых клеток человека насчитывает уже более 60 лет. За это время были достигнуты значительные успехи в данной области вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Краткая история В конце 40-х годов прошлого века A. Smith и соавт. впервые успешно криоконсервировали сперматозоиды человека при -80 °С с использованием глицерина в качестве криопротектора [49]. Впечатляющие успехи были достигнуты при криоконсервации ооцитов у животных - первые беременности у мышей были получены еще в конце 1970-х годов. Однако простой перенос методологии криоконсервирования и размораживания ооцитов животных на ооциты человека не привел к желаемому результату [24]. Тем не менее, в 1986 году в Австралии была получена первая беременность (двойня) после переноса эмбрионов из размороженных ооцитов человека [11]. Вплоть до 1994 года выживаемость зрелых ооцитов после криоконсервации была крайне низкой. В литературе описаны лишь единичные случаи наступления беременности. Альтернативным подходом и прорывом в области криоконсервации ооцитов, так же как и эмбрионов, стало начало применения метода витрификации. Первые сообщения об эффективности данного метода криокосервации ооцитов начали появляться в 1999 году, когда родился первый ребенок после использования витрифицированных ооцитов [30, 31]. Описание метода витрификации В настоящее время для клиник вспомогательных репродуктивных технологий актуальным является задача оптимизации метода витрификации ооцитов [9, 36, 41, 47, 51]. Необходимость проведения данной процедуры обусловлена как медицинскими и социальными показаниями, так и высокой потребностью в банках донорских ооцитов [17, 18, 42, 48]. В основе метода витрификации лежит ультрабыстрая технология охлаждения, в результате которой удается избежать образования кристаллов льда, повреждающих клетку. В ходе процедуры биологический материал подвергается воздействию более высоких, по сравнению с методом медленного замораживания, концентраций криопротекторов, а затем погружается в жидкий азот. По данным разных авторов, выживаемость витрифицированных эмбрионов на стадии 2 пронуклеусов колеблется в пределах 81-93 % (Park et al, 2000) [2, 27, 44], достигая по некоторым данным 100 % (Kuwayama et al., 2005) [32]. Технология криоконсервации эмбрионов методом витрификации уже стала рутинной, в отличие от криоконсервации ооцитов, которая долгие годы, как отмечено в литературе, представляла большие трудности. Процесс витрификации ооцитов имеет определенные особенности, которые связаны с рядом цитологических и молекулярно-биохимических особенностей ооцита. Ооцит - одна из крупнейших клеток человеческого организма и содержит большое количество воды, состоит из: зоны пеллюцида, гликопротеиновой оболочки, ооплазмы и ядра, органелл клетки (митохондрии, эндоплазматический ретикулюм и аппарат Гольджи), имеет диаметр 120-150 мкм. Для криоконсервации пригодны ооциты, находящиеся на стадии метафазы II, которая характеризуется наличием активного аппарата веретена деления [10, 21, 23, 36, 45]. Веретено деления ооцита крайне чувствительно к воздействию низких температур. При снижении температуры происходит стремительная деполимеризация микротрубочек, что может привести к неправильной сборке веретена после размораживания и, как следствие, к нарушению расхождения хромосом при делении яйцеклетки после размораживания [5, 21, 23, 25, 37]. Указанные проблемы в той или иной степени были успешно разрешены в результате применения для криоконсервации ооцитов метода витрификации, который практически полностью исключает формирование кристаллов льда, так как происходит быстрый переход вещества в аморфное состояние и сводит к минимуму механическое повреждение клеток [12, 28, 53]. Первоначально разработанные протоколы витрификации ооцитов, как отмечают в литературных источниках, были с высокой концентрацией криопротекторов и длительный период обладали выраженной цитотоксичностью, вызывая значимый осмотический стресс клетки [56]. Однако новым этапом в усовершенствовании метода витрификации стало увеличение числа криопротекторов в составе сред витрификации. Примером наиболее успешного использования трехкомпонентного состава витрификационных сред (этиленгликоль, ДМСО, сахароза) стал Cryotop метод [33]. Техника витрификации Современная техника витрификации происходит при большой скорости замораживания >20 000 C/мин, с использованием более низких концентраций криопротекторов, чем ранее. Такая высокая скорость витрификации достигается благодаря объему витрификационного раствора <0,1 мкл. Затем образцы помещаются в специальные устройства в жидкий азот при температуре -196 °С [6, 7, 13, 30, 49]. Существует несколько различных устройств для проведения процесса витрификации, - «закрытые»: Cryotip, High Security Vitrification, «открытые»: Cryolock, S3 [33, 34, 43, 57]. В «открытых» устройствах образцы вступают в непосредственный контакт с жидким азотом в течение витрификации. «Закрытые» устройства предотвращают непосредственный контакт образцов с жидким азотом. Больший процент показателя выживаемости, по данным литературы, при использовании открытых устройств, возможно, связан с экстремально быстрой скоростью размораживания [33]. Основным недостатком открытых систем является возможность контаминации различными инфекционными заболеваниями. Однако важно указать, что не было ни одного случая контаминации при криопереносах с применением открытых систем [15]. Но это не исключает некоторых мер предосторожности при гипотетическом риске с использованием открытых систем [16, 20]. В клинической практике после размораживания витрифицированных ооцитов применяется метод оплодотворения ИКСИ (ICSI) [38]. Много научных исследований и статей посвящено сравнению двух методов криоконсервации ооцитов: медленное замораживание и витрификация. В частности, в своей научной работе «Криоконсервация ооцитов и эмбрионов» Lisbet Van Landuyt (2012), указала несколько преимуществ техники витрификации над медленным замораживанием. 1. Исключается риск образования внеклеточных или внутриклеточных кристаллов льда, которые могут повреждать клетку. 2. Во время витрификации клетки теряют воду или обезвоживаются прежде, чем будут криоконсервированы. С другой стороны, при медленном замораживании обезвоживание клетки запускается при инициации внеклеточной кристаллизации (сидинге) в результате повышения концентрации соли во внеклеточном пространстве. Такое повышение концентрации соли называется «эффектом растворения» и, как известно, является губительным для клеток. Во время витрификации такого внеклеточного повышения концентрации соли не происходит, следовательно, отсутствует риск возникновения «эффекта растворения». 3. При витрификации процесс криоконсервации происходит очень быстро и, следовательно, возможный ущерб, причиняемый замораживанием, практически исключается [8]. Успех метода витрификации зависит от большого количества факторов: от «достаточной» проникающей способности криопротекторов и дегидратации под воздействием непроникающих криопротекторных веществ во время витрификации. Достаточная проникающая способность и достаточная степень дегидратации непосредственно связаны со специфическими характеристиками проницаемости ооцитов для воды и криопротекторов и, следовательно, эти характеристики должны учитываться при проведении процедуры витрификации; чем ниже температура, тем ниже проницаемость клеточной мембраны для воды и криопротектора. Таким образом, температура в лаборатории, где проводится процедура витрификации, должна строго контролироваться и поддерживаться неизменной на протяжении всего года для того, чтобы избежать вариаций в исходе витрификации; известно, что проницаемость для воды и криопротекторов у ооцитов меньше, чем, например, у зигот. Таким образом, оптимальный интервал времени для уравновешивания криопротекторов будет варьировать в зависимости от витрифицируемой клетки [55]; число витрифицированных зрелых ооцитов более и равное 8, именно такое количество ооцитов в среднем позволит получить достаточное количество эмбрионов. По данным Cobo A., Garrodo N., Crespo J., Jose R., Pellicer A. (2012), если число витрифицированных ооцитов более 8 - частота успешных родов возрастает с 22,6 % до 46,4 % [19]; рекомендуется витрификация только ооцитов хорошего качества, так как ооциты, имеющие пограничную морфологию, хуже переносят процедуры криоконсервации [29]. Показания для применения метода витрификации Несмотря на то что витрификация - новый метод криоконсервации биологического материала, который постоянно совершенствуется, показания к применению данного метода криоконсервации с течением времени расширяются: сохранение фертильности при различных онкологических заболеваниях. Достаточно обширен перечень онкологических заболеваний, которые успешно излечиваются с помощью лучевой терапии и химиотерапии: например, хронический миелолейкоз, лимфома Ходжкина, миелофиброз, саркома Эдвина и т. д. Проводимое лечение губительно влияет на фолликулярный аппарат яичников, вызывая их преждевременное истощение и аменорею. В ряде случаев существует возможность провести контролируемую овариальную стимуляцию яичников и получить здоровые яйцеклетки до начала лечения [4]; витрификация ооцитов в программах ЭКО/ИКСИ [33, 59]; программа «донорства ооцитов», для ее реализации необходимо создание банка ооцитов [3, 46]. Важным аспектом витрификации ооцитов в донорских программах является отсутствие необходимости синхронизации менструального цикла донора и реципиента. Более того, усовершенствование программ криоконсервации ооцитов в последние годы привело к созданию во многих странах банков ооцитов; возможность «накопления ооцитов» (oocyte collection) - «банкинг» при «бедном» ответе на программу контролируемой овариальной стимуляции. Применение программы «банкинг» актуально в данном случае, как указывают ученые N. Prados, M. Cruz, A. Requena et al., на Конгрессе ASRM 2013 г. целесообразно накопление ооцитов у женщин старшего репродуктивного возраста (>40). При накоплении минимум 6 ооцитов вероятность наступления беременности у этой группы пациентов составляет 31,6 %, в отличие от стандартных программ ВРТ - 28,3 % [39]. Возможно также проведение «банкинга» в натуральном цикле у данной категории пациенток; программа «отсроченного материнства», когда здоровая женщина желает сохранить фертильность путем витрификации ооцитов; применение витрификации ооцитов по религиозным причинам. В последнее время многие авторы отмечают, что витрификация является перспективным и высокоэффективным методом криоконсервации ооцитов. По данным различных исследователей, выживаемость ооцитов колеблется от 85 до 90 % [25, 35]. В 2009 году Nagy и соавт. сообщили о результатах исследования с использованием ооцитов от 10 доноров и 20 реципиентов, - выживаемость ооцитов составила примерно 90 %, а ЧНБ достигала 75 % [41]. В 2005 году Kuwayama и соавт. сообщили о 90 % выживаемости ооцитов и 40 % частоте наступления беременности с использованием системы «Cryotop», эти результаты были получены в проспективном рандомизированном исследовании с ооцитами, полученными от инфертильных пациенток (в возрасте до 35,5 лет), с использованием 124 ооцитов от 40 пациенток [33]. Наиболее масштабное проспективное рандомизированное контролируемое исследование по оценке банка гамет проведено в 2010 году учеными Cobo А., Meseguer M., Remohi J., Pellicer A.: эффективность донорских ооцитов с 600 реципиентами (более 3000 ооцитов) показали эквивалентные результаты при витрификации в сравнении с использованием нативных ооцитов [18]. В публикации A. Cobo [14] указала следующие результаты: выживаемость ооцитов после витрификации более 90 % (95,1 %), процент оплодотворения витрифицированных ооцитов по сравнению с нативными 73,1 % против 74,8 %, а частота наступления беременности 51,4 % против 52,6 % соответственно (р < 0,05). Cobo A, Diaz C. в своем метаанализе в 2011 г., как и ученые A. E. Jones, J. W. Miller на Конгрессе ASRM в 2013 г., указали на то, что по результатам их научного исследования по сравнению результативности применения витрифицированных и нативных ооцитов донора оплодотворение, развитие бластоцисты и частота наступления беременности не имеют достоверных различий [22]. В исследованиях Noyes N., Porcu E., Borini A. указано, что к 2009 г. родилось более 532 детей по всему миру с использованием витрифицированных ооцитов [41]. Несмотря на то что проводится большое количество исследований исходов беременности в программах ВРТ с применением метода витрификации, мы не можем точно утверждать, будут ли долгосрочные последствия от применения данного метода криоконсервации ооцитов. Обнадеживает то, что, по данным Noyes N., Porcu E., Borini A. (2009) [41], из 392 детей, рожденных с применением витрифицированных ооцитов, только 6 были с определенными хромосомными и генетическими аномалиями, - данная цифра не отличается от процента детей, зачатых естественным путем. Широкое рандомизированное контролируемое исследование Smith G. D., Serafini P., Fioravanti J., Yadid I. и соавт. (2010) указывает на то, что витрификация ооцитов повышает выживаемость, оплодотворение, получение качественных эмбрионов, а также увеличивает частоту наступления беременности и позволяет длительно хранить биологический материал [49]. Thomas J. Kim, Seung Wook Hong и соавт. в 2010 г. опубликовали информацию о рождении здорового мальчика при использовании витрифицированных ооцитов, хранившихся в течение 5 лет [54]. Таким образом, витрификация расширяет возможности вспомогательных репродуктивных технологий и имеет большие перспективы развития, так как применяется в данный момент практически для всех видов биологических материалов [1, 2, 55, 58, 59] и открывает «двери» для многих тысяч женщин, которые подвергаются риску потери репродуктивной функции вследствие различных причин. Высокие показатели выживаемости и оплодотворения витрифицированных ооцитов будут способствовать повышению эффективности и совершенствованию программ ЭКО.

About the authors

Viktoriya Vladislavovna Gabarayeva

I. I. Mechnikov North-Western State Medical University, Ministry of Public Health of Russian Federation

Email: reprodyktolog87@mail.ru
postgraduate, Department of women's reproductive health

Alla Stanislavovna Kalugina

I. I. Mechnikov North-Western State Medical University, Ministry of Public Health of Russian Federation

Email: Kalugina-AS@avaclinic.ru
M. D., Lecture at the Department of women's reproductive health

Yuliya Kazimirovna Kamenetskaya

AVA-PETER clinic

Email: Kamenetskaya-YK@avaclinic.ru
biologist of embryology department reproductive medicine

References

Supplementary files