Molecular genetic aspects of keratoconus pathogenesis

Full Text

Введение. Клиника и этиология кератоконуса

Кератоконус роговицы — двусторонняя дегенеративная невоспалительная стафилома, характеризующаяся прогрессирующим коническим истончением, потерей нормальной архитектуры и асимметричным выпячиванием роговицы, изменяющим её преломляющую способность. Хотя заболевание может манифестировать в любом возрасте, изменения роговицы, как правило, начинаются в подростковом возрасте с замедлением прогрессирования примерно в 30–40 лет и постепенно, на протяжении всей жизни, приводят к нарушению зрения из-за растущей близорукости, неправильной кривизны роговицы и неправильного астигматизма. Кератоконус диагностируют на основании совокупности клинических симптомов и характерных изменений топографии роговицы [1, 4, 9, 33, 35]. Клинические признаки кератоконуса весьма разнообразны и зависят от тяжести заболевания в диапазоне от субклинической формы кератоконуса, двусторонней невоспалительной прогрессирующей эктазии роговицы с протрузией и истончением до тяжёлой прогрессирующей конической протрузии, рубцов и слепоты [15]. Истончение роговицы, ведущее к образованию конуса, вызвано изменениями компонентов межклеточного матрикса (МКМ) из-за нарушения активности ферментов и апоптозом клеток [27].

В умеренных и тяжёлых случаях распространёнными признаками кератоконуса являются кольцо Флейшера вокруг основания конуса из-за отложения железа, полосы Фогта — вертикальные линии, возникающие из-за сжатия десцеметовой мембраны, увеличенная видимость нервных волокон и разрыв боуменовой оболочки. Со временем у большинства пациентов развивается симптом Мансона — выпячивание нижнего века, вызванное протрузией роговицы. У пациентов с тяжёлым кератоконусом в поражённых участках отмечаются водянка роговицы, острый отёк стромы, ведущий к образованию субэпителиальных рубцов вследствие разрывов в десцеметовой мембране. Рубцевание и отёк роговицы приводят в дальнейшем к потере зрения [1, 33].

Этиология кератоконуса считается многофакторной, связанной с комплексным взаимодействием генетических и экологических факторов. Кератоконус может быть вызван генетическими факторами с менделевским типом наследования, у других — ношением контактных линз, хроническим раздражением глаз, атопией глаз, оксидантным повреждением, например, ультрафиолетовым светом. В большинстве случаев кератоконус является результатом генетической предрасположенности, активированной факторами окружающей среды. Решающая роль генетической предрасположенности в патогенезе изолированного кератоконуса подтверждена многочисленными данными о повышенной заболеваемости в семейных группах и у монозиготных близнецов по сравнению с дизиготными [7, 22]. До 23,5 % пациентов с кератоконусом имеют положительный семейный анамнез. Риск развития кератоконуса у родственников пациентов с кератоконусом повышен в 15–67 раз по сравнению с общей популяцией [36]. Большинство семейных случаев кератоконуса наследуется по аутосомно-доминантному типу. Аутосомно-рецессивное наследование отмечено в группах с высокой степенью родства [33]. Хотя у большинства пациентов кератоконус является изолированным заболеванием, он также ассоциирован с рядом генетических синдромов и системных расстройств, в том числе с врождённым амаврозом Лебера, пигментной абиотрофией, синдромами Марфана, Тернера, Элерса – Данлоса и Дауна, пролапсом митрального клапана, несовершенным остеогенезом, коллагеновой болезнью сосудов [6, 7, 31, 33]. Признаки кератоконуса наблюдаются у 0,5–15 % пациентов с синдромом Дауна и 35 % пациентов с врождённым амаврозом Лебера [33].

Хирургическое лечение — эпикератопластика, фоторефрактивная кератэктомия или синтрастромальные кольца — исправляет рефракцию кератоконуса, но не лечит патогенетическую причину и не может остановить прогрессирование кератоконуса. В примерно 20 % случаев он прогрессирует до такой степени снижения зрения, что восстановление зрения требует трансплантации роговицы, и является ведущим показанием к кератопластике в развитых странах [15, 31]. Поэтому надежды возлагаются на изучение молекулярных механизмов его возникновения и прогрессирования, которое должно идентифицировать новые терапевтические мишени и помочь в разработке новых методов лечения.

Генетика кератоконуса

За последнее десятилетие с помощью семейного, ассоциативного и геномного/протеомного анализа достигнут значительный прогресс в идентификации генетических факторов риска кератоконуса. Генетические факторы риска кератоконуса трудно идентифицировать из-за сложной этиологии болезни. При изучении многофакторных заболеваний с низкой корреляцией генотипа с фенотипом, каким является кератоконус, полезен подход, основанный на выборе генов-кандидатов, позволяющий выявлять даже небольшие эффекты гена. Основная идея заключается в анализе присутствия генных мутаций у пациентов и здоровых лиц. Гены-кандидаты при кератоконусе выбраны на основании их ассоциаций с другими болезнями роговицы (дистрофиями роговицы) и/или их известных функций в развитии глаз. Ранние описания кератоконуса были сосредоточены на поздних стадиях заболевания с тяжёлым поражением роговицы и выраженным нарушением зрения. Появление более совершенных методов визуализации привело к пониманию огромного разброса в выраженности заболеваний роговицы. Это позволяет объективно оценить ранние и/или более лёгкие изменения в процессе развития болезни. В частности, топографическое исследование роговицы «незатронутых» членов семьи больного кератоконусом выявляет у них субклинические аномалии формы роговицы. Кроме того, конфокальная микроскопия демонстрирует микроструктурные изменения при самом начальном заболевании роговицы, а не только на конечной стадии [6].

Ген VSX1 (visual system homeobox 1, локус 20p11.2), известный как патогенетический фактор задней полиморфной дистрофии роговицы [21], является наиболее изученным среди генов, ассоциированных с кератоконусом [1]. VSX1 кодирует транскрипционный фактор, функционирующий в черепно-лицевых тканях во время эмбрионального развития. Белок VSX1 играет важную роль в развитии глаза, регулирует экспрессию генов, кодирующих опсины (светочувствительных рецепторов) колбочек во время эмбрионального развития, но у взрослых экспрессируется только в кератиноцитах травмированной роговицы, участвует в заживлении раны и связан с фибробластной трансформацией [6, 33]. Мутации в гене VSX1 (R166W и L159M) идентифицированы у пациентов с кератоконусом [33, 13]. Хотя мутации в гене VSX1 наиболее распространённые среди ассоциированных с кератоконусом, они ответственны всего за 2–3 % случаев, что отражает высокополигенную природу этого заболевания [1].

Ген DOCK9 (dedicator of cytokinesis 9, локус 13q32) экспрессируется в роговице и кодирует белок, который активирует сигнальный G-белок Cdc42 и регулирует обмен гуанозинтрифосфат/гуанозиндифосфат. В гене DOCK9 идентифицирована аутосомно-доминантная мутация А2262 > С, кодирующая замену глицина-754 на гистидин, которая ассоциирована с семейной формой кератоконуса [1, 6, 13, 33]. Хотя механизм, посредством которого эта мутация приводит к развитию кератоконуса, не ясен, известно, что мутация расположена в домене, который связывает фосфолипиды и может повлиять на соединение белка с клеточной мембраной. Кроме того, локус 13q32 содержит гены IPO5 (importin 5, белок ядерного транспорта) и STK24 (serine/threonine kinase 24), точная роль которых в патогенезе кератоконуса не известна, однако мутации этих генов (2380–134A > C и 1089 + 29G > C соответственно) описаны у пациентов со спорадическим и семейным кератоконусом [1, 14].

Часть маркеров генетической предрасположенности к кератоконусу идентифицирована на основании критерия толщины центральной роговицы (ТЦР). Средняя разность между ТЦР у пациентов с кератоконусом и у лиц контрольной группы составляет 75 мкм. Кератоконус с крайним истончением роговицы является клиническим признаком редких врождённых заболеваний соединительной ткани с грубыми аномалиями роговицы, таких как синдром хрупкой роговицы (СХР, аутосомно-рецессивное генерализованное расстройство соединительной ткани) и синдром Элерса – Данлоса, вызванных мутацией в полиморфном сайте rs9938149 (С/А) гена ZNF469 (zinc-finger 469) [19]. Эта же мутация ассоциирована с риском изолированного кератоконуса [1, 28]. Всего в гене ZNF469 идентифицировано 12 мутаций, которые вызывают СХР. У 22 из 23 пациентов с СХР из 13 неродственных семей обнаружены мутации в гене ZNF469. Все родители пациентов оказались носителями мутации, идентифицированной как причина заболевания. ZNF469 — белок с неизвестной функцией, однако в исследованиях ассоциации с болезнями глаз неоднократно показано его влияние на ТЦР. Мутации 5353C > T и 2150delT в гене ZNF469 изменяют транскрипцию генов, кодирующих компоненты МКМ, в частности генов COL4A1 и COL11A1, и нарушают структурную целостность поражённых тканей [26].

С помощью аналогичного подхода (ассоциация ТЦР-сцепленных локусов с риском кератоконуса) в результате метаанализа более 20 000 пациентов из европейских и азиатских популяций были идентифицированы полиморфизмы в или рядом с генами FOXO1 (rs2721051, Т/С), FNDC3B (rs4894535, Т/С), MPDZ-NFIB (rs1324183, A/C) с сильной ассоциацией с риском кератоконуса, COL5A1 (rs1536482, A/G и rs7044529, T/C) [5, 17, 19, 28]. Около 1 % населения являются носителями аллелей риска в каждом из 6 локусов (rs2721051, rs4894535, rs1324183, rs1536482, rs7044529, rs9938149), и эти люди подвержены 7,2-кратному увеличению риска кератоконуса по сравнению с примерно 1 % населения, гомозиготным по протективным аллелям [19].

Один из механизмов патогенеза кератоконуса связан с генетическими изменениями структуры и функции коллагена в роговице. Строма роговицы состоит из коллагеновых волокон, поэтому неудивительно, что многие ТЦР-ассоциированные локусы содержат гены различных типов коллагена, такие как COL1A1, COL1A2, COL8A2, COL27A1 и COL5A1 [17]. С кератоконусом ассоциированы аминокислотные замены метионин-1237/валин и фенилаланин-1644/фенилаланин в молекуле коллагена, кодируемого геном COL4A4 (collagen a-type IV), а также замена аспарагин-326/тирозин в молекуле коллагена, кодируемого геном COL4A3 [1, 30]. Оба гена картированы в локусе 2q36.3 [6] и кодируют коллагены типа IVa [16].

Нарушение экспрессии коллагенов, ассоциированное с дистрофиями роговицы, может быть вызвано мутацией в гене ZEB1/TCF8 (zinc finger E-box binding homeobox 1/transcription factor 8, локус 10p11.22). Белок ZEB1 является транскрипционным фактором, который играет важную роль в регуляции эпителиально-мезенхимального перехода. Мутации в ZEB1 описаны у некоторых пациентов с изолированным кератоконусом, эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса, а также в редких случаях сочетания эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса с кератоконусом и у 30 % пациентов с задней полиморфной дистрофией роговицы без кератоконуса [13, 21]. Описан единственный клинический случай, в котором все три патологии присутствуют у одного и того же больного и связаны с мутацией гена ZEB1 [21].

Миссенс-мутация 1920G > T в гене ZEB1 (за мена глицина-640 на гистидин, нарушающая экспрессию белка) ассоциирована с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса и кератоконусом, в то время как нонсенс-мутация 2249C > A (серин-750 > X) с образованием стоп-кодона, продуцирующая усечённый белок, приводит к задней полиморфной дистрофии роговицы. Миссенс-мутация 1920G > T приводит к тому, что экспрессия генов COL4A1 и COL4A2 заметно, а COL4A3, COL4A4 и COL8A2 умеренно супрессирована [16, 21]. Дизрегуляция коллагенов типа IVα представляет собой общий эффект мутаций ZEB1 при кератоконусе, задней полиморфной дистрофии роговицы, эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, хотя клинически и гистологически кератоконус отличается от других дистрофических заболеваний роговицы. Их ассоциация с мутацией ZEB1 свидетельствует о том, что в ряде случаев данные состояния имеют общую генетическую основу и общие патофизиологические механизмы [16].

Ген MIR184 (microRNA-184, локус 15q22-q24) экспрессируется на высоком уровне в роговице и хрусталике и кодирует микроРНК-184, относящуюся к малым регуляторным РНК. МикроРНК длиной 19–25 нуклеотидов регулируют активность более 60 % генов, связываясь с комплементарными последовательностями транскриптов генов-мишеней, что приводит к деградации мРНК или ингибирует трансляцию. МикроРНК-184 влия ет на транскрипционную активность ключевых генов развития и гомеостаза роговицы. Замена 57С > U в микроРНК-184, ассоциированная с кератоконусом и ранним началом передней полярной катаракты, затрагивает сайт связывания с транскриптами генов INPPL1 (inositol polyphosphate phosphatase-like 1) и ITGB4 (integrin beta 4), вовлечённых в заживление травмы роговицы как компоненты эпителиальных десмосом роговицы [1, 33]. Мутация С57 > U описана у пациентов со спорадическим [6] и семейным кератоконусом [1], а также у пациентов с ранним началом передней полярной катаракты и кератоконусом [13]. Эта же мутация приводит к тяжёлой семейной форме кератоконуса в сочетании с синдромом EDICT (раннее начало передней полярной катаракты и эндотелиальной дистрофии сетчатки, гипоплазия радужной оболочки, врождённая катаракта и стромальное истончение) [15].

У двух пациентов из 780 (0,25 %) с изолированным кератоконусом одновременно присутствуют в геноме две гетерозиготные замены MIR184 8С > А и 3A > G, изменяющие вторичную структуру микроРНК-184. Анализ экспрессии показал, что мутация 8С > А почти полностью подавляет экспрессию микроРНК-184, а 3A > G снижает её примерно на 40 %. Пенетрантность мутаций неполная, и у родителей-переносчиков отсутствует клиническая картина кератоконуса. Тем не менее оба имеют некоторые тонкие клинические особенности, которые являются частью описания кератоконуса (тонкая роговица, помутнение роговицы, проминирующие нервные волокна в строме роговицы). Авторы предполагают, что второй родитель, не несущий мутацию MIR184, скорее всего, несёт другие, неидентифицированные, генетические факторы риска кератоконуса, которые тоже унаследованы потомками и в сочетании с мутацией MIR184 привели к развитию у них клинической картины кератоконуса. Аналогичная полигенная пороговая модель патогенеза болезни уже была предложена для комплексных болезней и подробно изучена в отношении шизофрении [15].

Ген SOD1 (superoxide dismutase 1, локус 21q22.11) кодирует цитоплазматический антиоксидантный фермент Cu-Zn-супероксиддисмутазу-1, метаболизирующий супероксидные радикалы и обеспечивающий защиту от токсичности активных форм кислорода (АФК) [33]. Непосредственно контактируя с внешней средой, роговица особенно восприимчива к воздействию синего и ультрафиолетового света (УФ), который генерирует АФК и вызывает в ней оксидантный стресс, участвующий в патогенезе и прогрессировании некоторых глазных болезней, в том числе кератоконуса [27, 35]. В состоянии болезни роговица отличается сниженной активностью ферментов антиоксидантной защиты и накоплением АФК [31, 36], хотя уровень экспрессии мРНК SOD1 не отличался от нормы [27]. Уникальная делеция 7 нуклеотидов в гене SOD1 идентифицирована в 1 % случаев кератоконуса [1], спорадического [13] и семейного [15]. Мутантная супероксиддисмутаза лишена ферментативной активности и не способна защищать глаз от оксидантного стресса [13].

Исследование экспрессии генов в эпителии при кератоконусе обнаружило активацию гена LOX (lysyl oxidase, локус 5q23.2) по сравнению с нормой. Ген LOX кодирует лизилоксидазу, участвующую в сшивании волокон коллагена и эластина роговицы, катализируя окислительное дезаминирование эпсилон-аминогруппы лизина. Ген LOX содержит несколько сайтов инициации транскрипции, а также альтернативного сплайсинга и продуцирует несколько транскриптов, биологическая релевантность которых неизвестна. Полиморфные сайты rs10519694, rs2956540 в гене LOX высокодостоверно ассоциированы с кератоконусом и в семейных, и в спорадических случаях [7]. Гетерозиготные замены 473G > A в гене LOX (rs1800449, аргинин-158 > глутамин) и G > С (rs2288393, некодирующая область) обнаружены у одних и тех же пациентов, что указывает на их полное неравновесное сцепление. Гаплотипы +473A/rs2288393C и +473G/rs2288393G идентифицированы как фактор риска кератоконуса [12]. Предполагается, что комбинация минорных аллелей этих сайтов изменяет баланс и взаимодействие изоформ лизилоксидазы в ткани роговицы, приводит к нарушению поперечных сшивок коллагеновых волокон в строме роговицы, биомеханически ослабляет роговицу и предрасполагает носителей к развитию кератоконуса [7]. Хотя не ясно, какие изоформы активируются, эти результаты убедительно доказывают, что генетические варианты лизилоксидазы повышают предрасположенность к развитию кератоконуса [1, 7]. Этот вывод имеет значение для лечения по методу кросслинкинга коллагеновых волокон роговицы, который использует комбинацию рибофлавина и длинноволнового УФ для увеличения перекрёстных связей между волокнами коллагена и укрепления роговицы, чтобы остановить прогрессирование кератоконуса [8]. Тестирование на полиморфизмы гена LOX пациентов с кератоконусом и заболеваниями соединительной ткани, такими как синдром Элерса – Данлоса, при которых также обнаружен дефицит активности лизилоксидазы, может повысить эффективность и безопасность кросслинкинга коллагена за счёт выявления и исключения пациентов-«нереспондеров» до начала лечения [7]. В настоящее время проходит испытания кросслинкинг искусственных коллагеновых волокон под воздействием рибофлавина и ультрафиолетового света для лечения кератоконуса, и, следовательно, этот ген может иметь терапевтическое значение [1].

Геномные исследования выявили как фактор риска кератоконуса ген RAB3GAP1 (RAB3 GTPase activating protein subunit 1), кодирующий каталитическую субъединицу гетеродимерного фермента RAB3GAP (RAB3 GTPase-activating protein), который активирует малый G-белок из семейства Rab3 и контролирует кальций-опосредованный экзоцитоз нейротрансмиттеров и гормонов. Мутации в гене RAB3GAP1 вызывают синдромы Warburg Micro и Martsolf, фенотипически перекрывающиеся аутосомно-рецессивные заболевания, характеризующиеся глазными симптомами и нарушением психомоторного развития. Метаанализ показал, что полиморфизм сайта rs4954218, предположительно связанный с блоком регуляторных элементов гена RAB3GAP1, высокодостоверно ассоциирован с кератоконусом. Чтобы выяснить его роль в биологии роговицы, требуются дальнейшие генетические и функциональные исследования [4, 13].

Роль оксидантного стресса в патогенезе кератоконуса подтверждается повышенным уровнем окислительных повреждений ДНК в роговице [10], особенно в митохондриальной ДНК (мтДНК) [3]. У пациентов с кератоконусом показано повышение в клетках роговицы относительного содержания мтДНК (числа копий мтДНК к ядерной ДНК) по сравнению с нормой, хотя группа пациентов была моложе, чем лица контрольной группы. При кератоконусе увеличено количество митохондриальных нарушений и мутаций мтДНК, что считается результатом оксидантного стресса [36]. Под трансмиссионным электронным микроскопом в тканях роговицы наблюдается набухание митохондрий. Митохондриальная гаплогруппа Н и R повышает риск развития кератоконуса [2].

Поскольку повреждения ДНК часто связаны с развитием дегенеративных заболеваний, было высказано предположение, что гены, участвующие в репарации ДНК, могут влиять на чувствительность организма к мутагенам окружающей среды, накопление повреждений ДНК и предрасположенность к развитию комплексных заболеваний, в том числе заболеваний роговицы. Среди факторов, которые могут быть важны в патогенезе кератоконуса и эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, оксидантный стресс играет особую роль. Это подтверждается высоким уровнем маркеров оксидантного стресса, в том числе малондиальдегида, и увеличением количества мутаций мтДНК в роговице, а также подавлением экспрессии некоторых генов антиоксидантов, наблюдаемым при кератоконусе и эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса [13, 33, 34–36]. Митохондриальный оксидантный стресс приводит к повреждению биомолекул роговицы и вызывает чрезмерный апоптоз, ведущий к преждевременным физиологическим изменениям роговицы, замедленной эпителизации роговицы, уменьшению числа эндотелиальных клеток роговицы, утолщению десцеметовой мембраны, истончению паренхимы роговицы и развитию кератоконуса. Повреждения ДНК удаляют в первую очередь ферменты эксцизионной репарации (ФЭР). Изменение кодирующих их генов может влиять на способность клеток роговицы справиться с оксидантным стрессом. Генотипирование генов ФЭР у 284 пациентов с кератоконусом выявило ассоциацию ряда полиморфизмов с риском кератоконуса [36].

Митохондриальная ДНК-полимераза-γ, кодируемая геном POLG, катализирует синтез мтДНК и участвует в её репарации, вставляя нуклеотид в место разрыва, чтобы получить субстрат для ДНК-лигазы. Генотип АА полиморфизма С1370T > A гена POLG ассоциирован с повышенным риском возникновения кератоконуса, в то время как генотип AT связан со снижением риска [36].

Ген XRCC1 (X-ray repair cross-complementing group 1) кодирует ещё один компонент системы ФЭР ДНК, который действует как интерфейс белок — белок, благодаря чему координирует деятельность других белков ФЭР. Известна ассоциация между полиморфизмом гена XRCC1 и повышенным риском возрастной катаракты и прогрессированием первичной открытоугольной глаукомы. Генотип AG и А-аллель полиморфизма 1196A > G, генотип AА полиморфизма –1370T > A и C-аллель полиморфизма 580C > T в гене XRCC1 ассоциированы с увеличением риска развития кератоконуса [36].

Эндонуклеаза FEN1 (flap endonuclease 1) играет важную роль в репликации и эксцизионной репарации окислительных повреждений мтДНК. Полиморфизмы –441G > А и 61564299G > T в гене FEN1 снижают уровень его экспрессии. Функциональный дефицит FEN1 может привести к геномной нестабильности и повышенной частоте мутаций, способствующих предрасположенности к ряду генетических заболеваний. Выявлена ассоциация между полиморфизмами –441G > А и 61564299G > T и развитием кератоконуса и эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса. Генотип TT полиморфизма 61564299G > T ассоциирован с повышенной частотой возникновения кератоконуса и эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса. Аллели полиморфизма –441G > А не влияют на риск развития кератоконуса, но гаплотип GG двух полиморфизмов повышает его, а гаплотип GT снижает. Гаплотип AG связан с увеличением частоты дистрофии Фукса [35].

Изменчивость гена RAD51 также может способствовать развитию кератоконуса. Высокополиморфный ген RAD51 кодирует белок, который является ключевым ферментом системы гомологичной рекомбинации и репарации ДНК, восстанавливающей повреждённую ДНК и поддерживающей стабильность генома. Потеря экспрессии RAD51 предрасполагает клетки к генетической нестабильности и смерти. Полиморфизмы RAD51–61G > T (rs1801321; 172G > T) и –98G > C (rs1801320; 135G > C) относятся к наиболее распространённым. Аллель –61T-находится в сайте связывания транскрипционного фактора P300/СВР, который регулирует активность генов-мишеней. G-аллель этого сайта не формирует сайт связывания с P300/СВР. T-аллель связан со значительно более высокой активностью промотора RAD51 по сравнению с G-аллелем. Возникновение кератоконуса коррелирует с генотипами полиморфизма –61G > T. Генотипы GG и ТТ полиморфизма связаны со снижением риска возникновения кератоконуса, а гетерозиготный генотип GT по непонятной причине увеличивает его [31].

Обнаруженные ассоциации свидетельствуют о том, что гены репарации ДНК вовлечены в патогенез кератоконуса. Полиморфизм может привести к функциональным изменениям ферментов репарации и повысить уровень окислительных повреждений ДНК, вызывающих заболевания глаз. Снижение эффективности репарации повышает восприимчивость к окислительному повреждению ДНК в условиях оксидантного стресса и способствует развитию кератоконуса [36].

Ген HGF (hepatocyte growth factor) экспрессируется в различных тканях глаза, в том числе и в роговице, и ассоциирован в многочисленных популяциях с рефракционной ошибкой, включая близорукость и дальнозоркость. Преломляющая оптическая сила глаза определяется, по меньшей мере отчасти, формой роговицы, которая сильно изменена при кератоконусе. Ассоциативное исследование 933 случаев кератоконуса из Австралии, США и Северной Ирландии выявило достоверную ассоциацию полиморфизмов rs3735520, rs17501108 и rs1014091 в гене HGF с кератоконусом [5]. Экспрессия HGF активируется в кератиноцитах роговицы в ответ на травмы роговицы. В слёзной жидкости пациентов с тяжёлой формой кератоконуса обнаружен повышенный уровень провоспалительного цитокина IL-6. Промотор гена HGF содержит сайт связывания интерлейкина IL-6, который активирует транскрипцию гена HGF. Это позволяет предположить, что IL-6 и HGF являются важными участниками патогенеза кератоконуса [29]. Ассоциация HGF с кератоконусом предполагает потенциальное участие в его патогенезе воспалительного сигнального пути [13].

Ген FLG (filaggrin, локус 1q21) экспрессируется в кератиноцитах кожи и роговицы и кодирует белок филагрин, который является маркером дифференцировки кератиноцитов. Мутации в гене FLG являются генетическим фактором риска развития атопических состояний и кератоконуса. 5,6 % пациентов оказались носителями по крайней мере одной из двух мутаций FLG. Потеря функции филагрина в результате мутаций замены аргинина-501 и делеции 2282del4 в гене FLG обнаружена у больных кератоконусом, что свидетельствует о роли FLG в патогенезе кератоконуса [1, 13].

Усиленный апоптоз кератиноцитов роговицы, наблюдаемый в 60 % случаев кератоконуса и вызывающий стромальное истончение, обусловлен высвобождением интерлейкина IL-1b вследствие хронической механической травмы эпителия роговицы [13, 25]. Мутации в регуляторной области гена IL1B (–31С > T, rs1143627; –511С > T, rs16944) повышают концентрацию цитокина и риск кератоконуса. Гаплотип, созданный Т-аллелем rs1143627 и С-аллелем rs16944, связан с 1,7-кратным увеличением риска кератоконуса [22]. Интерлейкины IL-1α и IL-1β (кодируемые генами IL1A и IL1B соответственно) ответственны за контроль воспалительной реакции, тогда как IL-1RА (IL-1 receptor antagonist) модулирует эффекты IL-1α и IL-1β [32]. Гены обоих интерлейкинов вместе с геном IL1RN, кодирующим белок IL-1RА, расположены в локусе 2q13. Интронный полиморфизм 376C > А в гене IL1А (интерлейкин-1a) снижает риск заболевания [1]. Анализ сцепления идентифицировал замену 242С > T в гене IL1RN, которая сегрегирует с фенотипом кератоконуса [25]. Таким образом, полиморфизм генов, кодирующих белки семейства IL-1, является фактором предрасположенности к кератоконусу.

Хотя железо имеет большое значение для ряда клеточных функций, способность ионов железа генерировать свободные радикалы связана с индукцией оксидантного стресса. Избыток железа участвует в патогенезе множества заболеваний. Многочисленные исследования показывают, что внутриглазное железо может способствовать развитию широкого круга глазных болезней. Поглощение железа зависит от трансферрина и его рецепторов. Функция сывороточного гликопротеина трансферрина состоит в связывании ионов трёхвалентного железа и транспортировке их к рецепторам трансферрина на поверхности клеток, а также предотвращении окислительного повреждения клеточных структур свободными радикалами. Поскольку трансферрин является одним из факторов, необходимых для роста эпителиальных клеток, в том числе эпителиальных клеток роговицы, дисфункция трансферрина, вызванная мутациями кодирующего его гена TF, может способствовать оксидантному стрессу и расстройствам эпителия роговицы, увеличить риск кератоконуса и эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса. Мутации в гене TF влияют на содержание или активность белка, что приводит к накоплению железа в роговице и повышенной восприимчивости к окислительному повреждению. Генотип АА и А-аллель полиморфизма 3296G > А в гене TF ассоциированы с возникновением кератоконуса, в то время как G-аллель отрицательно коррелирует с ним. Снижение риска возникновения кератоконуса ассоциировано и с генотипом AG полиморфизма 3481A > G [34].

Ген CAST (calpastatin, локус 5q15) кодирует кальпастатин — эндогенный высокоспецифичный ингибитор внутриклеточных кальций-зависимых цистеинпротеаз — кальпаинов. Полиморфизм rs4434401 в гене CAST ассоциирован с семейной и спорадической формами кератоконуса [1]. Протеолитическая система калпаин/кальпастатин присутствует в различных частях глаза, включая роговицу. В эпителии роговицы она предположительно играет роль в обмене эпителиальных клеток и заживлении ран. Иммуногистохимическая локализация кальпаинов и кальпастатина в глазах кролика выявила присутствие кальпаина и кальпастатина в эпителиальных кератиноцитах и фибробластах роговицы, эндотелиальных клетках. Экспрессия гена CAST также выявлена в различных частях глаза (трабекулярной сети, птеригиуме, хрусталике, эпителии и строме роговицы) в норме и при кератоконусе. Соотношение кальпастатин/кальпаин является важным фактором в регуляции калпаин-индуцированного протеолиза в тканях, высокие уровни кальпастатина связаны с его подавлением. Однако транскрипты, полученные из роговицы с кератоконусом, отличаются по структуре от нормальных. Нарушения регуляции системы кальпаин/кальпастатин, в том числе из-за генетических дефектов, связаны с рядом заболеваний человека, включая рак, болезнь Альцгеймера, инфаркт миокарда, сахарный диабет, мышечные дистрофии и катаракту, избыточная экспрессия кальпастатина усиливает некротические процессы в тканях. Ген CAST содержит полиморфизм rs4434401, минорный T-аллель которого ассоциирован с семейным и спорадическим кератоконусом. Оценка уровня экспрессии и активности кальпастатина в ткани роговицы больных кератоконусом, несущих аллель риска полиморфизма rs4434401, откроет возможность для разработки нехирургических методов лечения, основанных на манипуляции с системой кальпаин/кальпастатин [18].

Анализ сцепления идентифицировал аутосомно-доминантную делецию 54 нуклеотидов в позиции c.2558+149_2558+203 в гене SLC4A11 (sodium bicarbonate transporter like protein 11, локус 20p13), которая сегрегирует с фенотипом кератоконуса. Ген SLC4A11 (solute carrier family 4) кодирует полифункциональный мембраносвязанный белок-транспортёр бикарбоната натрия, который участвует в росте и пролиферации клеток, активируя сигнальные пути. Ген SLC4A11 экспрессируется на высоком уровне в эндотелиальных клетках крови, яичников, лёгких, кожи, толстой кишки и роговицы. Дисфункция SLC4A11 приводит к апоптозу. Известно, что апоптоз вовлечён в патогенез кератоконуса. Мутации SLC4A11 описаны у пациентов с SLC4A11-связанными заболеваниями роговицы, в том числе рецессивной эндотелиальной дистрофией роговицы, дистрофией роговицы с перцептивной глухотой, эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса [25].

Все эти данные только начинают раскрывать молекулярную этиологию кератоконуса, при этом многочисленные генетические факторы риска этого сложного заболевания остаются неидентифицированными. Об этом говорят результаты исследования дифференциальной экспрессии генов в эпителии роговицы при кератоконусе по сравнению с нормой. Анализ транскрипции идентифицировал 47 генов, которые активированы, и 9 генов, которые ингибированы при кератоконусе. Например, уровень мРНК гена KRT72 (keratin 72) повышен в 5,2 раза [24], а ADH1B (alcohol dehydrogenase 1B class I beta polypeptide) в кератиноцитах больных кератоконусом снижен более чем в 200 раз [23]. Геномный анализ, выполненный М. Mace et al., идентифицировал 87 дифференциально экспрессирующихся генов, регулирующих апоптоз, клеточную пролиферацию и дифференцировку [20]. Анализ глобальной экспрессии генов выявил дифференциальную экспрессию 471 гена [11].

В стромальных фибробластах роговицы при кератоконусе показана активация генов BMP4 (bone morphogenetic protein 4), CFL1 (cofilin 1) и подавление экспрессии генов ACTA2 (actin, alpha 2), GRCC10 (gene rich cluster, C10), SSTR1 (somatostatin receptor 1), AQP5 (aquaporin 5), ALDH3 (aldehyde dehydrogenase class 3) [2, 23, 34]. В поиске генов-кандидатов анализ сцепления по всему геному идентифицировал несколько хромосомных локусов, ассоциированных с кератоконусом: 1p36.23-36.21, 2p24, 10p11.22, 12p, 20p11.21, 1q21, 4q, 5q14-q21, 5q21.2, 5q23.2, 5q32-q33, 8q13.1-q21.11, 9q34, 13q32, 13q33.3, 14q11.2, 14q24.3, 15q22–24, 16q22.3-q23.1, 20q12, 21q22.11 [4, 6, 22, 35, 36]. Анализ протеома роговицы и слёзной жидкости у пациентов с кератоконусом выявил множество структурных белков, сигнальных молекул, цитокинов и ферментов, экспрессия которых дисрегулирована. Эти данные дают ключ к пониманию сложного процесса деградации роговицы и разработке новых способов диагностики и лечения данного заболевания [11].

Заключение

Генетическая предрасположенность к кератоконусу убедительно доказана, но идентифицирована лишь небольшая часть генов. Функциональное влияние патогенных мутаций изменяет экспрессию генов-мишеней, и это формирует основу корреляции генотип — фенотип. Деградация тканей при кератоконусе вовлекает дерегуляцию экспрессии множества молекул, в том числе ферментов, медиаторов воспаления, цитокинов, молекул клеточной адгезии и протеиназ, цитокератинов и иммуноглобулинов. Многочисленность генов, ассоциированных с кератоконусом, свидетельствует о чрезвычайной генетической гетерогенности заболевания. Анализ сегрегации, данные генетических эпидемиологических исследований и картирование генов подтвердили, что генетические факторы играют ключевую роль в развитии заболеваний роговицы. Наиболее достоверно установлена ассоциация генов VSX1, SOD1, LOX, COL4A1-4, COL5A1, DOCK9, ZEB1. Эти генные идентификации начинают раскрывать молекулярную этиологию кератоконуса, но остаётся множество ещё не идентифицированных генетических факторов риска этого сложного заболевания.

Хотя протеомные и генные исследования экспрессии обнаружили как общие, так и уникальные молекулы, которые могут служить биомаркерами кератоконуса, необходимы дальнейшие исследования точных молекулярных механизмов его прогрессирования, чтобы его остановить. Включение в анамнез генетической информации гарантирует, что только «генотипически подходящие» пациенты получат лечение по индивидуально разработанной программе, что соответствует концепции персонализированного подхода в современной медицине. Первым примером такого подхода в клинике кератоконуса является тестирование пациентов на полиморфизмы гена лизил оксидазы, которое может повысить эффективность и безопасность выполнения кросслинкинга коллагена путем подбора пациентов, которые отвечают на это лечение. Накопление информации о молекулярных механизмах, лежащих в основе патогенеза кератоконуса, позволит увеличить число таких примеров. Преимущество персонализированного подхода в медицине заключаются в высокой эффективности и специфичности терапии и уменьшении риска побочных эффектов.

About the authors

Alexey N Kulikov

S.M. Kirov Military Medical Academy

Author for correspondence.
Email: alexey.kulikov@mail.ru

MD, PhD, DMedSc, professor, head of the department. Ophthalmology Department

Russian Federation, Saint Petersburg, Russia

Sergey V Churashov

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: Churashoff@mail.ru

MD, PhD, DMedSc, assistant professor, professor. Ophthalmology Department

Russian Federation, Saint Petersburg, Russia

Tatiana A Kamilova

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: Kamilovaspb@mail.ru

PhD, Biology, senior research associate. Scientific research laboratory (tissue engineering) of the Scientific research department (of the medical biological research) of the Scientific research center

Russian Federation, Saint Petersburg, Russia

Vladimir A Reituzov

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: varvar.61@mail.ru

MD, PhD, assistant professor. Ophthalmology Department

Russian Federation, Saint Petersburg, Russia

References

Supplementary files