APPLICATION SCANNING MICROSCOPY TO STUDY REPARATION A BONE FABRIC

Abstract

For studying of regenerative-reparative processes a bone fabric of a skull of rats implants from nanostructure the titan with various kinds of a covering were used. For an estimation of results were used optical, electronic microscopy, the trace element analysis. It is established that use nanocomposites considerably accelerated processes of regeneration of a bone fabric of a skull in difference from use titanum without a covering.

Full Text

В последние десятилетия достижения нанотехнологий находят все более широкое применение в науке и технике. Область применения наноматериалов постоянно расширяется. Сохраняет свою актуальность травматизм [1, 2]. Частота черепно-мозговой травмы составляет от 1,8 до 5,4 случаев на 1000 человек населения. Помимо этого, сохраняется необходимость оперативных вмешательств по поводу новообразований головного мозга. Значительное развитие в последнее десятилетие приобрели новые способы лечения сосудистой патологии. Современные подходы к лечению 29 Российский медико - биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2016. Т. 24, № 3 инсультов также диктуют необходимость хирургических вмешательств [3]. Решение задач, связанных с разработкой искусственных материалов для замещения участков, поврежденной или отсутствующей костной ткани, представляет сложную комплексную проблему, поскольку функциональная надежность имплантатов в значительной мере зависит от их биологической, биохимической и биомеханической совместимости с костной тканью живого организма. В последнее время в литературе появилось множество публикаций, посвященных изучению влияния различных по своему составу биокомпозиционных материалов [4-7]. При этом представляют отдельный интерес различные режимы поверхности титана: микродуговое оксидирование (МДО) и пескоструйная обработка. Перспективным является использование биокомпо-зитных материалов на основе коллаген-ГАП-декстрановых компонентов, нанесенных на металлическую подложку в связи с выполнением титаном каркасной и протективной функций [8, 9]. Однако имеющиеся материалы нуждаются в дальнейших разработках. При этом одной из важнейших проблем после внедрения трансплантата является регенерация костной ткани [3, 6, 7, 10-14]. В связи с этим, целью нашей работы послужил анализ влияния различных по своему составу биокомпозитов на основе титана в нано-структурном состоянии на регенерацию костной ткани черепа в экспериментальной модели. Материалы и методы Для эксперимента было взято 140 самцов крыс линии «Вистар», которые были разделены на 4 группы по 35 особей: ложнооперированные (1-я группа), особи, которым был имплантирован композит из нанотитана Grey с пескоструйной обработкой без покрытия (2-я), животные, которым введен композит из нанотитана Grey с пескоструйной обработкой с одним слоем покрытия (композиционный препарат, в состав которого входил желатин и высокомолекулярный декстран (3-я), жи 30 вотные, которым имплантирован биокомпозит из нанотитана Grey с пескоструйной обработкой с двумя слоями покрытия (1-желатин, декстран, 2- гидроксиапатит, коллаген, декстран (4-я). Проведение эксперимента и содержание животных, соответствовали общепринятым стандартам. В условиях передозировки эфирного наркоза животных выводили из эксперимента на сроках 1, 2, 4, 6, 9, 12 недель. Проведено макроскопическое описание. Затем гистологические срезы, окрашенные гематоксилином и эозином, изучали в световом микроскопе «Topic-T» Ceti-Т с применением морфометрического анализа. Образцы, обработанные родамином, фотографировали в флуоресцентном микроскопе "Микмед-6", вариант 11. Для электронной микроскопии пробы фиксировали в стандартном глутаровом фиксаторе, а затем фотографировали и проводили морфометрический анализ с использованием растрового микроскопа FE1 Quanta 200 3D с приставкой для макро- и микроэлементного анализа (Na, Mg, Al, S, Fe, C, N, O, P, Ca). Содержание элементов определялось в процентах в участках от их общего количества: в матриксовой кости на расстоянии 1-2 мм от участка три-фанации, непосредственно на краю удаленной кости во вновь образованной ткани в центре и над имплантатом. Для атомно-силовой микроскопии образцы исследовали и выполняли морфометрический анализ на сканирующем зондовом микроскопе Ntegra-Aura. Согласно целям и задачам исследования результаты группировались для сопоставления различных качественных показателей. Для визуализации исходных данных и результатов их анализа использовали модуль построения диаграмм системы Microsoft Office. Характер распределения данных нормальный. Статистическая обработка полученных данных осуществлялась с помощью Microsoft Excel и Statistica 6.0. В целях определения репрезентативности исследования высчитывался коэффициент вариации (V<33%), далее применялся t- Российский медико - биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2016. Т. 24, № 3 критерий Стьюдента для оценки значимости расхождения между средними выборочных совокупностей, была оценена однородность исследуемых совокупностей на основе коэффициента вариации. Результаты и их обсуждении При изучении регенерации костной ткани в опытных группах с различными видами наноимплантатов (одна-две недели экспозиции) показано, что ширина ободка демаркационной зоны воспаления составляла через неделю 1,4±0,4 2-я группа), 1,6±0,35 (3-я), 1,8±0,33 (4-я), а через две недели - 1,8±0,29, 2,1±0,25, 2,2±0,22 мм соответственно (у ложнооперирован-ных животных соответственно 1,3±0,4 и 1,5±0,23). К четвертой неделе выявлялись остатки гематомы с волокнами фибрина. Через шесть недель экспозиции матрикс-ная кость не изменена. Гаверсовы каналы умеренно полнокровны вплоть до сроков двенадцати недель. Происходило дальнейшее разрастание хрящевой ткани и сосудов. Связь между композитом и имплантатом во всех группах была уже более прочной, но лучше проявлялась в группах с покрытием, особенно с двумя слоями, чем без него. При 7 дневной экспозиции у всех животных просвет между костной тканью и композитом заполнялся соединительной тканью. Следует отметить, что в группе № 2 эта связь была более рыхлой и наиболее полноценной она была выполнена в группе № 4. Г раница между волокнистым и клеточным слоями не определялась. Между композитом и материнской костью было выражено полнокровие, особенно четко определяемое во 2-й группе. Наблюдались фрагменты с диапедезными кровоизлияниями. v ='4Si.*' ■*» ІЗ -~ JO pni-- Q*i4»*EC' Б fliHOOOe rrwo іцмі <эт tu» HV < JWMPV 4ÎLtC/l 2 ** 30 ~ QweroPEO Рис. 1. Фрагмент костной ткани черепа крысы (теменная область). Группа контроля. Первая неделя выдержки. Грануляционная ткань и коллагеновые волокна. РЭМ. Рис.Б (х10000) фрагмент Рис. А (х5000) Через две недели между тканью и композитом просматривалась хорошо сформированная соединительная ткань, богатая полнокровными сосудами, что особенно ярко было выражено в группе № 4. Связь между композитом и имплантатом во всех группах была уже более прочной. К 30 суткам между мат-риксной костью и имплантатом формируются сложные взаимосвязи из не скольких видов тканей: это фиброзная ткань, которая как бы является основой для располагающихся среди нее островков хрящевой ткани, и которая более выражена в группах 3 и 4, а также жировая ткань. Здесь определяются уже и вновь образованные сосуды. Через де-вять-двенадцать недель между имплантатом и матриксной костью наблюдается формирование костной ткани с развити 31 Российский медико - биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2016. Т. 24, № 3 ем Гаверсовых каналов, которые на этой стадии меньшего размера и полнокровны. Остеобласты располагаются в полостях и хорошо выражены. Через девять недель в 1-й группе дефект не был полностью заполнен грубоволокнистой тканью. Через неделю покрытия имплантата вновь образованной тканью в группе № 2 не наблюдалось. В 3 группе составляло 1,0±0,2х0,4±0,1, в 4-й -2,0±0,3х0,4±0,08 мм. При экспозиции шесть недель покрытие имплантата было следующим: 2 группа - 1,8±0,21х3,8±0,1, 3-я - 2,1±0,25х4,2±0,08, 4-я -2,6±0,3х4,5±0,05 мм. На сроках экспозиции свыше девяти недель имплантат полностью покрыт вновь образованной I тканью по всей поверхности. При изучении ткани над имплантатом было показано, что при использовании биокомпозитов формировалась ровная зона мезенхимальной ткани, заполняющей дефект между костной тканью и композитом и равномерно прикрывающей последний, толщиной до 11,0±0,5 цм. При использовании же композитов без покрытия слой вновь образованной ткани был неравномерным, 5,0±1,5 цм, и наблюдались лишь отдельные фрагменты формирования ткани над имплантатом. Ободок соединительной ткани по периферии имплантата составил через неделю 160,0±35,0, 170,0±24,0, 180,0±16,0 цт; а через две недели - 180,0±30,0, 190,0±20,0 « I I Г ЛОТОСВ I . Лр 1«{кг ЛИ | cur I I ■ цч - 1 Î0&PW 1 ’Oi'Mwti 00 LFD-0-2** »OTkV >i*»PÊG Рис. 2. Фрагмент черепа костной ткани крысы (теменная область). Контрольная группа. Экспозиция четырнадцать недель с момента операции. Ткань имеет неровную поверхность. Наблюдается дефект ткани (указано стрелкой). От 200 до 300 цт - толщина ткани с беспорядочным расположением волокон (указано стрелкой). Рис. Б (х500). Г (х1000) фрагменты Рис. А. 100. РЭМ. Рис. В (х400). Окраска гематоксилином и эозином 32 Российский медико - биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2016. Т. 24, № 3 Рис. 3. Участок ткани кости черепа крысы (теменная область). Контрольная группа. Шестнадцать недель эксперимента. Нанесенное повреждение заполнено сформировавшейся костной тканью с сосудами. Зондовая сканирующая микроскопия и 200,0±10,0. Размер вновь образованной ткани: 56±20,0, 70,0±10,0, 80,0±7,0, а через две недели - 80±15,0, 89,0±7,0, 95,0±5,0 %. К 30 дням вновь сформированная фиброзная и хрящевая ткань начинала распределяться более равномерным слоем. Перепад рельефа в 4 группе определялся до 1,5±1,5 цт, во 2-й - 6,0±2,2 цт, в 3-й -3,2±2,0 цт. Наиболее равномерно она заполняла дефект в 4-й группе. К 30 дням фиброзная ткань в группах № 3, 4 в виде ободка наблюдалась на имплантате. Постепенно (наиболее в группе № 4) обнаруживались неравномерной величины поля хрящевой ткани, которые переходили в сеть костных трабекул. Балки расположены хаотично, и вытесняют хрящевую ткань. Наиболее четко этот процесс прослеживался к шести неделям экспозиции, особенно при наличии биокомпозитов. Вновь образованная ткань снаружи начинала покрываться надкостницей, которая была хорошо контуриро-вана и утолщена. Остеобласты клеточного слоя лежали преимущественно однорядно, последовательно, без больших промежутков между клетками. Компактное вещество костной ткани матриксовой кости имело обычное строение. Поверхность над 33 имплантатом к девяти неделям была заполнена костной тканью. Граница между старой и новообразованной костью визуализировалась только под микроскопом. Определялась компактная кость с грубоволокнистыми костными трабекулами, фрагменты пластинчатой кости. Отмечено формирование зрелой пластинчатой кости из губчатой. Выявлены новообразованные остеоны. Расстояние между центром имплантата и вновь образованной тканью через девять недель в опытных группах составляло: 450,09±28,7, 380,12±20,08, 300,02±9,98 цт. К двенадцатой неделе оно соответственно уменьшалось, особенно в группе 4, до 187,69±28,24, 150,08±19,87, 98,84±8,9 цт соответственно. При экспозиции девять недель при ультрамикроскопическом изучении определено соединение имплантата с костью. Толщина вновь образованной ткани над центром композита составляла при девяти недельной экспозиции: 497,08±29,51, 687,0±20,03, 905,0±9,62 цт; а при двенадцати недельной - 1167,0±29,1, 1284,0±19,92, 1396,0±8,34, которая прогрессировала к дальнейшим срокам. При экспозиции девять недель определено соединение имплантата с костью. Наблюда Российский медико - биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2016. Т. 24, № 3 лось формирование Гаверсовых каналов. Был выявлен активный остеогенез, наличие остеогенных клеток - остеобластов. Выявлены процессы реваскуляризации в виде отдельных эндотелиоцитов в сети коллагеновых волокон. Центры кальцификации новообразованных костных трабекул в эндостальной части появлялись через 7 суток с момента операции и особенно были развиты к 14 суткам, что подтверждалось с помощью микро- и макро-элементного анализа и люминесцентной микроскопии. При изучении фосфора в матриксо-вой кости на расстоянии 1 -2 мм от участка трифанации нами было показано, что в группе № 1 его содержание достоверно возрастало к четвертой (6,32±0,42%) и восьмой (3,53±0,45%) по сравнению с первой (2,38±0,04%), а затем постепенно снижалось к двенадцати неделям (1,47±0,03%). В группах № 2, 3, 4 мы наблюдали положительную динамику его содержания в изучаемом участке, как и магния. Непосредственно на краю удаленной кости во вновь образованной ткани у животных группы № 1 уже через неделю после операции содержание кальция было достоверно выше (14,93±2,94%), чем в матриксовой кости (6,58±1,34%), а затем незначительно снижалось к двенадцати (11,01 ±3.29%) неделям. В группах № 2, 3, 4 значительный скачок содержания кальция происходил после четырех недель. При изучении фосфора в данной зоне нами было показано, что его содержание в группе № 1 превышало уже к первой неделе (3,77±0,01%) количество в матрик-совой кости (2,38±0,04%) и возрастало до 5,71 ±0,30% к восьмой и двенадцатой (5,20±1,12%) неделям. В группе № 2 в первую неделю его количество было достоверно меньше (0,60±0,02%), чем до эксперимента, однако к двенадцати неделям доходило до 5,97±0,58%, что достоверно не отличалось от количества его в матриксовой кости. В группе № 4 содержание фосфора состав-лявшее в первую неделю 0,63,±0,01%, затем 34 возрастало к восьмой (0,79±0,03%) и двенадцатой (3,05±0,04%). Во вновь образованной ткани над имплантатом в группе № 2 была пока-зана достоверная тенденция к росту кальция. К восьмой неделе он составлял 12,81±1,06% (6,52±0,44% в матриксовой кости) и 13,36±1,53% к двенадцатой неделе экспозиции. Аналогичная тенденция была в группах № 3, 4. Содержание фосфора значительно, до двух раз возрастало во всех группах по мере роста временной экспозиции, по сравнению с матриксовой костью. При исследовании уровня магния видна его достоверная тенденция к росту во всех группах с наноструктурирован-ными имплантатами из титана, но наибольшие величины, превышающие исходные в два раза, можно наблюдать при применении титана покрытого двумя слоями композита. Динамика изменений других элементов была менее показательной. Применение биокомпозитов при дефектах костной ткани увеличивает скорость процессов регенерации за счет создания депо ионов кальция и фосфора преимущественно в зоне «матриксовая кость-биокомпозит» и выполнения опорной функции для новой образовавшейся ткани. Использование имплантатов из нано-структурированного титана значительно ускоряет физиологические процессы регенерации костной ткани черепа и уменьшает вероятность повреждения ткани головного мозга до окончания этапа формирования аутокости. Скорость фазы энхонд-рального окостенения при наличии костных дефектов распределяется в следующей прогрессии: 1) у животных, прооперированных без применения биокомпозитов и имплантатов, 2) с использованием имплантатов из наноструктурированного титана, 3) имплантатов с биокомпозитами с 1 слоем покрытия, 4) имплантатов с биокомпозитами с 2 слоями покрытии. При изучении элементного состава новообразованной ткани на участке «матриксовая кость-имплантат» и вокруг последнего установлено увеличение концентрации кислорода, Российский медико - биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2016. Т. 24, № 3 кальция, фосфора, натрия, магния через восемь недель после эксперимента, что характеризует развитие активных регенераторных процессов в этой зоне. После двенадцати недель при использовании нано-структурированных имплантатов выявлены равномерность рельефа вновь образованной костной ткани и развитие надкостницы с полным заполнением дефекта костной ткани между имплантатом и головным мозгом. Полученные результаты, характеризующие эффективность нанобио- Литература 1. Корж Н.А., Дедух Н.В. Репаративная регенерация кости: современный взгляд на проблему// Ортопедия, травматология и протезирование. 2006. № 1. С. 77-84. 2. Чехонадских А.А., Суслина З.А., Ти-мербаева С.Л. Современные вопросы консервативного и хирургического лечения нарушения мозгового кровообращения // Ремедиум Приволжье. 2009. № 9. С. 23-27. 3. Павлова Т.В., Куликовский В.Ф., Павлова Л.А. Клиническая и экспериментальная морфология. М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2016. 256 с. 4. Берченко Г.Н. Синтетические кальций-фосфатные материалы в травматологии и ортопедии // Сборник работ Всерос. науч.-практ. конф. центр. инта травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова. М., 2010. С. 3-5. 5. Аверченко В.Н., Мовшев П.Е. Повторная посттравматическая регенерация костной ткани у тимэктомированных крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2002. Т. 67, № 5. С. 83-85. 6. Валиев Р.З., Александров И.В. Объемные наноструктурные металлические материалы. М.: Академкнига, 2007. 397 с. 7. Павлова Т.В., Куликовский В.Ф., 35 имплантатов, могут быть рекомендованы для использования в практическом здравоохранении (нейрохирургии, травматологии, ортопедии, стоматологии). Выводы Таким образом, наличие покрытия из коллаген-гидроксиаппатитно-декстранового соединения увеличивает скорость процессов регенерации за счет создания депо ионов кальция, фосфора и выполняет опорную функцию для вновь образованной ткани за счет коллаген-декстранового компонента.