SPECTROPHOTOMETRIC DETERMINATION OF IZONIAZID AND ITS DERIVATIVES BY REACTION OF FORMATION THE POLYMETHINE DYE WITH 4-OXOURACIL

Full Text

По данным ВОЗ ежедневно около 1000 человек в европейском регионе заражаются туберкулезом, в том числе мультирезистентным, и только 50% из них удается успешно вылечить. Ситуация требует расширения доступа к безопасным и эффективным препаратам, а также инновационного подхода к экспрессдиагностике и лечению туберкулеза, исходя из каждого индивидуального случая.

Современная фармакотерапия туберкулеза предусматривает комплексное использование специфических антибактериальных препаратов и лекарственных средств разных фармакологических групп (иммуномодуляторов, гормональных препаратов, муколитических средств и др.). К препаратам 1 ряда, являющимися основными химиотерапевтическими средствами для лечения различных форм туберкулеза, относятся изониазид и его производные антибиотики (стрептомицин, канамицин, рифампицин) и этамбутол. Препараты 1 ряда в виде комбинаций применяют преимущественно при впервые выявленном туберкулезе [1]. Курс лечения составляет от 6-ти и более месяцев. Вместе с тем необходимо учитывать, что действие противотуберкулезных препаратов сопровождается обычно побочными эффектами, выраженность которых может возрастать при их одновременном применении [2].

Изучение фармакокинетики химиотерапевтических препаратов особенно важно в процессе химиотерапии туберкулеза, так как для достижения эффекта необходимо длительное лечение, нарушение которого может привести к резистентности туберкулезной палочки к применяемым лекарственным средствам. Процесс лечения требует постоянного контроля за содержанием противотуберкулезных препаратов в крови и их выведением для оптимизации терапии. Это особенно актуально при нарушении функции почек, так как в этих случаях может наблюдаться задержка выведения противотуберкулезных средств и их кумуляция. Во многих случаях необходимо индивидуализировать дозы лекарственных препаратов с учетом их растворимости, всасываемости, интенсивности инактивации, скорости выведения, что зависит от активности фермента N-ацетилтрансферазы (NAT). Под действием фермента происходит биотрансформация (в частности, процесс ацетилирования) противотуберкулезных лекарственных средств.

В результате реакции ацетилирования изониазида образуется ацетилизониа- зид, который не обладает антитуберкулезной активностью и в дальнейшем гидролизуется до изоникотиновой кислоты и ацетилгидразина. Оба метаболита частично экскретируются с мочой. Кроме того, изоникотиновая кислота конъюгируется с глицином, а ацетилгидразин биорансфор- мируется до диацетилгидразина и может далее гидролизоваться под действием микросомальных ферментов до гидразина, обладающего гепатотоксичностью [3].

Следует отметить, что активность NAT у разных людей генетически отличается, поэтому метаболизм может быть или быстрым, или медленным. Знание относительной индивидуальной активности NAT может позволить оптимизировать режимы дозирования противотуберкулезных лекарственных средств и оценить пользу и риск их воздействия на организм. Активность фермента NAT можно определить косвенным методом по исследованию фармакокинетики тест-препарата ацетилирования - изониазида.

Таким образом, актуальной является разработка экспрессной высокочувствительной методики количественного определения изониазида в субстанции. Данная методика позволит провести количественное определение изониазида не только в лекарственных формах, но и в биологических жидкостях организма человека (моче), что необходимо при фармакокинетических исследованиях с целью определения активности фермента NAT.

Целью нашего исследования является разработка простой в использовании, экспрессной и валидизированной методики количественного определения изониазида не только в фармацевтических субстанциях и лекарственных формах, но и в биологических жидкостях.

В основе спектрофотометрического метода количественного определения изониазида в видимой области спектра, была использована реакция образования полиметинового красителя с 4-оксоурацилом.

Для достижения поставленных целей необходимо решить следующие задачи:

1. Осуществить выбор рабочей длины волны.
2. Определить линейную зависимость между концентрацией фармацевтической субстанции к оптической плотности продукта реакции с 4-оксоурацилом.
3. Установить время устойчивости окраски.
4. Определить чувствительность реакции с целью возможности использования её при химико-токсикологических исследованиях.
5. Определить диапазон подчинения продукта реакции основному закону светопоглощения.
6. Провести количественное определение изониазида в фармацевтической субстанции, лекарственной форме и биологической жидкости (моче).

Материалы и методы

Все исследования проводили на фотометре КФК-3 в кюветах с толщиной оптического слоя 10 мм при комнатной температуре. В анализе использовали рабочий стандартный образец (РСО) изониазида (ФС 42-0236-07). Приготовление стандартного рабочего раствора: 0,12 г изониазида (точная навеска) помещали в мерную колбу емкостью 100 мл, растворяли в воде, доводили водой до метки, тщательно перемешивали. 25 мл полученного раствора переносили в мерную колбу емкостью 100 мл, доводили водой до метки, тщательно перемешивали.

Статистическую обработку экспериментальных данных исследований (р=95%) проводили с помощью программ Stat Soft, Statistica 6,0, Microsoft Excel с вычислением граничных значений доверительного интервала среднего результата и определением ошибки единичного определения [4].

Результаты и их обсуждение

Для количественного определения изониазида в субстанции Государственная Фармакопея рекомендует объемный метод кислотно-основного титрования в неводных средах, используя его основные свойства. Навеску лекарственного средства титруют хлорной кислотой в среде ледяной уксусной кислоты и уксусного ангидрида [5]. Метод связан с достаточно большими временными затратами, с необходимостью использования летучих агрессивных реактивов и ограничен для применения в токсико- кинетических исследованиях.

На сегодняшний день существуют другие способы детектирования содержа ния тест-препарата ацетилирования - изо- ниазида - методами масс-спектрометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии, флуориметрии [6]. Однако эти методы имеют ряд существенных недостатков, таких как высокая стоимость, методическая сложность и длительность проведения исследования [7, 8].

Разработанная нами ранее методика спектрофотометрического определения фармацевтических субстанций [9], в том числе изониазида, в основе которой была использована реакция с метаванадатом аммония [10], может быть использована для количественного определения только нативного препарата. Данная реакция основана на способности соединений ванидия (V) образовывать окрашенные комплексы с органическими лигандами, имеющими в своей структуре незамещенную гидразид- ную группу. N-ацетильный конъюгатизо- ниазида в эту реакцию не вступает, так как является дериватом изониазида по гидразидной группе. В то же время, изо- ниазид и его ацетильный конъюгат в своей структуре содержат пиридиновый цикл со свободными а, а¹ - положениями. Для подобных циклов характерно расщепление под действием различных реактивов, например, хлорциана или бромциана. Однако, наиболее доступным является тио- цианохлорид, который образуется при взаимодействии хлорамина и тиоционата аммония. При расщеплении пиридинового цикла образуется глутаконовый альдегид,

который при взаимодействии с сочетающими реагентами, например 4-оксоура- цилом, образует полиметиновый краситель. Следовательно, использование реакции образования полиметинового красителя позволяет определить суммарно изониа- зид и его дериват - ацетилизониазид.

Для выбора рабочей длины волны готовили раствор изониазида с концентрацией 0,0003 г/мл. По истечении 5 минут измеряли оптическую плотность окрашенного продукта реакции при разных длинах волн, относящихся к видимой области спектра (380нм -780нм).

Спектр поглощения раствора изо- ниазидав видимой области имеет максимум при длине волны 608 нм. При той же длине волны проводили измерения оптической плотности испытуемых растворов и растворов сравнения. Результаты определения устойчивости окраски во времени представлены в таблице 1. Из данных таблицы видно, что в течение 30 минут окраска оставалась устойчивой.

Для выявления линейной зависимости между концентрацией фармацевтической субстанции изониазида и оптической плотностью продукта его реакции с 4- оксоурацилом готовили ряд разведений в широком диапазоне концентраций - от 0,012 г/мл до 0,048 г/мл. Проведенные исследования позволяют сделать заключение, что в выбранном интервале концентраций изониазида наблюдается подчинение закону Бугера-Ламберта-Бера.

Таблица 1. Зависимость оптической плотности окрашенного комплекса от времени

Относительная погрешность определения находилась в пределах точности спектрофотометрического анализа.

Минимальная концентрация изониа- зида, определяемая по этой методике, составляет 0,006 г/мл, что свидетельствует о возможности ее применения не только для

анализа фармацевтических препаратов, но и для определения изониазида в биологических объектах.

Следующим этапом исследования явилось определение содержания изониа- зида в фармацевтической субстанции и лекарственной форме. Определение прово дили в сравнительном аспекте с раствором стандартного образца, поскольку данный метод определения является более точным,

надежным и отвечает требованиям Государственной Фармакопеи. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Результаты определения изониазида в фармацевтической субстанции и лекарственной форме

Как следует из приведенных в таблице данных, полученные результаты укладываются в нормы допустимых отклонений.

Валидация методики показала, что данная методика не отягощена грубой и системной ошибкой, является правильной и позволяет получить воспроизводимые результаты.

Разработанная методика была применена в химико-токсикологическом исследовании изониазидав моче в качестве биологической жидкости.

Для приготовления модельной смеси использовали образец мочи, полученный от здорового добровольца. При этом в течении месяца до отбора проб человек не принимал лекарств. Модельные смеси мочи готовили путем добавления к ней определенного объема стандартного раствора изониазида с концентрацией 0,0003 г/мл. Приготовленные смеси выдерживали в течении 24 часов при комнатной температуре.

Для осаждения белковых веществ добавляли 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты. После центрифугирования проводили количественное определение по методике, разработанной для фармацевтической субстанции исследуемого лекарственного средства. Определение изониазида в моче оценивалось методом «введено - найдено». Предел обнаружения изониазида при указанных условиях спектрофотометрического определения 0,006 г/мл. Результаты исследования представлены в таблице 3.

Таким образом, разработанная методика отличается от известных методов определения изониазида [6] простотой выполнения, высокой чувствительностью, воспроизводимостью и не требует сложного оборудования и дорогих реактивов.

Экспресс-методика дает возможность определить содержание изониазида в фармацевтической субстанции и лекарственной форме.

Таблица 3. Результаты количественного определения изониазида в модельной смеси образца мочи спектрофотометрическим методом по реакции с 4-оксоурацилом

Чувствительность метода позволяет определять изониазид и его основной метаболитацетилизониазид в биологических жидкостях, так как определяемая концентрация находится в диапазоне концентраций экскретируемых с мочой [3], что позволяет косвенно судить об активности N-ацетилтрансферазы.

Выводы

1. Разработана методика количественного определения изониазида в фармацевтической субстанции, лекарственной форме и биологической жидкости спектрофотометрическим методом в видимой области спектра.
2. Показана возможность использования данной методики в дальнейших химико-токсикологических исследованиях.

Конфликт интересов отсутствует.

References

Supplementary files