Hygiene and SanitationHygiene and SanitationГигиена и санитария0016-99002412-0650Federal Scientific Center of Hygiene named after F.F. Erisman63867510.47470/0016-9900-2021-100-12-1366-1371ENVIRONMENTAL HYGIENEГИГИЕНА ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫStudy of the relationship between antibiotic resistance markers and virulence markers in NDM-positive Klebsiella pneumoniae strains circulating in various waters and human lociИзучение связи маркеров антибиотикорезистентности с маркерами вирулентности у NDM-положительных штаммов Klebsiella pneumoniae, циркулирующих в различных водах и локусах человекаhttps://orcid.org/0000-0001-7086-0899PayGalina V.ПайГ. В.
Russian Federation
https://orcid.org/0000-0003-3554-7690RakitinaDaria V.РакитинаД. В.
Russian Federation
https://orcid.org/0000-0003-4795-0751SukhinaMariya A.СухинаМ. А.
Russian Federation
https://orcid.org/0000-0002-7942-8004YudinSergey M.ЮдинС. М.
Russian Federation
MakarovValentin V.МакаровВ. В.
Russian Federation
https://orcid.org/0000-0002-6295-661XManiyaTamari R.МанияТамари Резоевна
Russian Federation

MD, researcher of Microbiology and Parasitology laboratory in the Centre for Strategic Planning of FMBA of Russia, Moscow, 119121.

e-mail: TManiya@cspmz.ru

Науч. сотр. лаб. микробиологии и паразитологии ФГБУ «Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью» ФМБА России 119121, Москва.

e-mail: TManiya@cspmz.ru

tmaniya@cspmz.ruhttps://orcid.org/0000-0003-4772-9686ZagaynovaAngelika V.ЗагайноваА. В.
Russian Federation
Centre for Strategic Planning and Management of Biomedical Health Risks of the Federal Medical Biological AgencyФГБУ «Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью» Федерального медико-биологического агентстваState Scientific Centre of Coloproctology n.a. A.N. RyzhikhФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр колопроктологии имени А.Н. Рыжих» Министерства здравоохранения Российской Федерации23122021100121366137125102024Copyright ©; 2024, Pay G.V., Rakitina D.V., Sukhina M.A., Yudin S.M., Makarov V.V., Maniya T.R., Zagaynova A.V.Copyright ©; 2024, Пай Г.В., Ракитина Д.В., Сухина М.А., Юдин С.М., Макаров В.В., Мания Т.Р., Загайнова А.В.2024Pay G.V., Rakitina D.V., Sukhina M.A., Yudin S.M., Makarov V.V., Maniya T.R., Zagaynova A.V.Пай Г.В., Ракитина Д.В., Сухина М.А., Юдин С.М., Макаров В.В., Мания Т.Р., Загайнова А.В.https://journals.eco-vector.com/0016-9900/article/view/638675

Introduction. The propagation of multi-resistance to antibiotics among hospital isolates of Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) is a subject of growing concern worldwide. At present, growing data of association between resistance and hypervirulence in clinical isolates of K. pneumoniae emerges. However, the occurrence of these pathogens in the environment remains an open question. 

The aim of this study was to evaluate and compare antibiotic resistance determinants occurrence in Klebsiella pneumoniae isolates from water sources (environmental and sewage), human sources (practically healthy people and patients with inflaammatory bowel disease (IBD), and extraintestinal infections (ExII)). 

Materials and methods. The PCR assay of carbapenemase genes IMP, NDM, VIM, KPC, OXA-48 was performed with the commercial “Amplisense” kits according to the manufacturer's instructions. The assay was used to evaluate the occurrence of antibiotic-resistance genes in 223 isolates of Klebsiella pneumoniaе from various sources: 42 isolates from sewage, 19 isolates from surface water sources, 30 isolates from biological material (blood, urine, surgical wounds, bronchoalveolar lavage) of patients with extraintestinal infections (ExII), 69 isolates from patients with inflammatory bowel diseases (IBD), and 63 isolates from faeces of practically healthy people. 

Results. The ExII group revealed various antibiotic resistance genes. The most prevalent gene was OXA (30% had this gene only, other 26,6% had also KPC or NDM). NDM as the only resistance gene was observed in 23,3% of ExII isolates. KPC gene was observed in 3,3% of ExII group. Two isolates from IBD group contained NDM gene along with VIM gene. Only NDM gene was found in all the other groups of Klebsiella pneumoniae isolates (13-28% isolates in every group, no statistical difference). NDM was shown to be associated with virulence genes iutA and rmpA that are responsible for iron consumption and hypermucoid phenotype. 

Conclusion. The most abundant resistance genes in the studied Klebsiella pneumoniae isolates were NDM (13.5%) and ОХА (8%). At the same time, NDM was the only gene found in all groups (11-28%). NDM metallobeta-lactamase gene was associated with rmpA and iutA genes, giving an example of the connection between virulence and resistance properties. A significant amount of resistant isolates from healthy donors and surface waters indicates the need for additional study of the role of NDM positive isolates in pathogenicity of Klebsiella pneumoniae.

Contribution:

Pay G.V. — concept and design of the study, collection and processing of material, performing the experiments, statistical processing, writing, editing;

Rakitina D.V. — performing the experiments, writing;

Sukhina M.A. — collection of clinical material;

Yudin S.M. — editing, approval of the final version of the article;

Makarov V.V. — editing, approval of the final version of the article;

Maniya T.R. — collection and processing of material, editing;

Zagaynova A.V. — concept and design of the study, editing, approval of the final version of the article.

All authors are responsible for the integrity of all parts of the manuscript and approval of the manuscript final version.

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Acknowledgment. The research was carried out within the framework of the research work “Development of technologies for cryopreservation and archiving of biological samples of human microecological resources (code“Cryobank”)»№ АААА-А18-118020590091-2.

Received: July 22, 2021 / Accepted: November 25, 2021 / Published: December 30, 2021

Введение. Рост антибиотикорезистентности среди госпитальных штаммов Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) вызывает всё большую озабоченность во всём мире. На сегодняшний день появляется много данных о связи резистентных штаммов c гипервирулентностью клинических изолятов. Однако вопрос о распределении этих условных патогенов во внешней среде остаётся пока открытым.

Цель исследования — оценить и сравнить встречаемость детерминант устойчивости к антибиотикам у изолятов K. pneumoniae из водных источников (окружающей среды и сточных вод), человеческих источников (практически здоровых людей и пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК) и внекишечными инфекциями (EXII)).

Материалы и методы. ПЦР-детекцию генов карбапенемаз IMP, NDM, VIM, KPC, OXA-48 проводили с помощью коммерческих наборов «Амплисенс», согласно протоколу производителя. С помощью ПЦР-анализа оценивали частоту встречаемости генов антибиотикорезистентности у 223 изолятов K. pneumoniae, выделенных из различных источников. Использовали 42 изолята из сточных вод, 19 изолятов из поверхностных водных источников, 30 устойчивых к антибиотикам изолятов от пациентов с внекишечными инфекциями (ВКИ), 69 изолятов от пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника, а также 63 изолята из кала здоровых людей.

Результаты. Среди изолятов внекишечных инфекций выявлены разнообразные гены антибиотикоустойчивости. Чаще других выявлялся тип ОХА (у 30% обнаружен только он, ещё у 26,6% он выявлен вместе с КРС или NDM). NDM в качестве единственного гена устойчивости обнаруживался у 23,3% изолятов из внекишечных инфекций. КРС, наиболее редкий тип генов устойчивости, показан у 3,3% изолятов из внекишечных инфекций. У двух изолятов из кала больных воспалительными заболеваниями кишечника помимо генов NDM были обнаружены гены VIM. В остальных группах K. pneumoniae из всех изученных генов бета-лактамаз была обнаружена только группа генов NDM (обнаружен у 13–28% изолятов в каждой группе, статистически достоверных различий между группами не выявлено). Была показана ассоциация генов NDM с генами вирулентности iutA и rmpA, отвечающими за поглощение железа и гипермукоидный фенотип.

Заключение. В исследованной выборке K. pneumoniae из различных источников наиболее распространённым вариантом резистентности к антибиотикам были NDM (13,5%) и ОХА (8%). При этом NDM в отличие от остальных генов устойчивости встречается во всех группах изолятов с частотой 11–28%. На примере гена металло-β-лактамазы NDM у K. pneumoniae мы наблюдаем ассоциацию между маркерами резистентности и маркерами вирулентности rmpA и iutA. Значительный процент резистентных штаммов у здоровых доноров и в поверхностных водах требует дальнейшего изучения роли NDM+ штаммов в патогенности выделенных K. pneumoniae.

Участие авторов:

Пай Г.В. — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материала, выполнение экспериментальной работы, статистическая обработка, написание текста, редактирование;

Ракитина Д.В. — выполнение экспериментальной работы, написание текста;

Сухина М.А. — сбор материала от пациентов;

Юдин С.М. — редактирование, утверждение окончательного варианта статьи;

Макаров В.В. — редактирование, утверждение окончательного варианта статьи;

Мания Т.Р. — сбор материала, редактирование;

Загайнова А.В. — концепция и дизайн исследования, редактирование, утверждение окончательного варианта статьи.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов в связи с публикацией данной статьи.

Финансирование. Исследование проведено в рамках НИР «Разработка технологий криоконсервации и архивирования биообразцов микроэкологических ресурсов человека (шифр «Криобанк»)», № АААА-А18-118020590091-2.

Поступила: 22.07.2021 / Принята к печати: 25.11.2021 / Опубликована: 30.12.2021

hvKpKlebsiella pneumoniaecarbapenemaseNDM-type metallo-beta-lactamasesurface watersewage waterIBDExtraintestinal infectionKlebsiella pneumoniaeвирулентностькарбапенемазаметалло-β-лактамаза NDM-типаповерхностные водысточные водыВЗКвнекишечные инфекцииKhan A.U., Maryam L., Zarrilli R. Structure, genetics and worldwide spread of New Delhi Metallo-β-lactamase (NDM): a threat to public health. BMC Microbiol. 2017; 17(1): 101. https://doi.org/10.1186/s12866-017-1012-8Mena A., Plasencia V., García L., Hidalgo O., Ayestarán J.I., Alberti S., et al. Characterization of a large outbreak by CTX-M-1-producing Klebsiella pneumoniae and mechanisms leading to in vivo carbapenem resistance development. J. Clin. Microbiol. 2006; 44(8): 2831-7. https://doi.org/10.1128/jcm.00418-06Cagnacci S., Gualco L., Roveta S., Mannelli S., Borgianni L., Docquier J.D., et al. Bloodstream infections caused by multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae producing the carbapenem-hydrolysing VIM-1 metallo-beta-lactamase: first Italian outbreak. J. Antimicrob. Chemother. 2008; 61(2): 296-300. https://doi.org/10.1093/jac/dkm471Nordmann P., Cuzon G., Naas T. The real threat of Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing bacteria. Lancet Infect. Dis. 2009; 9(4): 228-36. https://doi.org/10.1016/s1473-3099(09)70054-4Poirel L., Naas T., Nordmann P. Diversity, epidemiology, and genetics of class D beta-lactamases. Antimicrob. Agents Chemother. 2010; 54(1): 24-38. https://doi.org/10.1128/aac.01512-08Sonnevend A., Al Baloushi A., Ghazawi A., Hashmey R., Girgis S., Hamadeh M.B., et al. Emergence and spread of NDM-1 producer Enterobacteriaceae with contribution of IncX3 plasmids in the United Arab Emirates. J. Med. Microbiol. 2013; 62(Pt. 7): 1044-50. https://doi.org/10.1099/jmm.0.059014-0Pesesky M.W., Hussain T., Wallace M., Wang B., Andleeb S., Burnham C.A., et al. KPC and NDM-1 genes in related Enterobacteriaceae strains and plasmids from Pakistan and the United States. Emerg. Infect. Dis. 2015; 21(6): 1034-7. https://doi.org/10.3201/eid2106.141504Dortet L., Poirel L., Al Yaqoubi F., Nordmann P. NDM-1, OXA-48 and OXA-181 carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in Sultanate of Oman. Clin. Microbiol. Infect. 2012; 18(5): E144-8. https://doi.org/10.1111/j.1469-0691.2012.03796.xKumarasamy K.K., Toleman M.A., Walsh T.R., Bagaria J., Butt F., Balakrishnan R., et al. Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK: a molecular, biological, and epidemiological study. Lancet Infect. Dis. 2010; 10(9): 597-602. https://doi.org/10.1016/s1473-3099(10)70143-2Ma L.C., Fang C.T., Lee C.Z., Shun C.T., Wang J.T. Genomic heterogeneity in Klebsiella pneumoniae strains is associated with primary pyogenic liver abscess and metastatic infection. J. Infect. Dis. 2005; 192(1): 117-28. https://doi.org/10.1086/430619Paczosa M.K., Mecsas J. Klebsiella pneumoniae: Going on the Offense with a Strong Defense. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2016; 80(3): 629-61. https://doi.org/10.1128/mmbr.00078-15Russo T.A., Olson R., Fang C.T., Stoesser N., Miller M., MacDonald U., et al. Identification of biomarkers for differentiation of hypervirulent Klebsiella pneumoniae from Classical K. pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 2018; 56(9): e00776-18. https://doi.org/10.1128/jcm.00776-18European Centre for Disease Prevention and Control. Outbreak of carbapenemase-producing (NDM-1 and OXA-48) and colistin-resistant Klebsiella pneumoniae ST307, north-east Germany, 2019. Stockholm: ECDC; 2019. Available at: https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/outbreak-Klebsiella-pneumoniae-GermanyGu D., Dong N., Zheng Z., Lin D., Huang M., Wang L., et al. A fatal outbreak of ST11 carbapenem-resistant hypervirulent Klebsiella pneumoniae in a Chinese hospital: a molecular epidemiological study. Lancet Infect. Dis. 2018; 18(1): 37-46. https://doi.org/10.1016/s1473-3099(17)30489-9Zhuravlev P.V., Alyoshnya V.V., Panasovets O.P. Antibiotic resistance of bacteria isolated from the water of open reservoirs. Public health and habitat. 2015; (5): 24–6.Журавлёв П.В., Алешня В.В., Панасовец О.П. Антибиотикорезистентность бактерий, выделенных из воды открытых водоемов. Здоровье населения и среда обитания. 2015; (5): 24-6.Rakhmanin Yu.A. Ivanova L.V., Artemova T.Z., Gipp E.K., Zagaynova A.V., Maksimkina T.N., Krasnyak A.V., Zhuravlev P.V., Aleshnya V.V., Panasovets O.P. Prevalence of bacteria of the genus Klebsiella in water bodies and their importance in the occurrence videobuilding acute intestinal infection. Gigiena i Sanitaria (Hygiene and Sanitation, Russian journal). 2016; 95(4): 397–406.Рахманин Ю.А., Иванова Л.В., Артемова Т.З., Гипп Е.К., Загайнова А.В., Максимкина Т.Н., Красняк А.В., Журавлев П.В., Алешня В.В., Панасовец О.П. Распространение бактерий рода Klebsiella в водных объектах и их значение в возникновении водообусловленных острых кишечных инфекций. Гигиена и санитария. 2016; 95(4): 397-406.Zhuravlev P.V., Alyoshnya V.V., Panasovets O.P. Study of pathogenicity factors of potentially pathogenic microflora isolated from water bodies. J. Population health and habitat. 2018; (1): 7-11.Журавлёв П.В., Алешня В.В., Панасовец О.П. Изучение факторов патогенности потенциально патогенной микрофлоры, выделенной из водных объектов. Здоровье населения и среда обитания. 2018; (1): 7-11.Recommendations «Antibiotic-resistance test». Available at: https://www.antibiotic.ru/files/321/clrec-dsma2021.pdf (in Russian)Рекомендации «Определение чувствительности к антимикробным препаратам». Доступно: https://www.antibiotic.ru/files/321/clrec-dsma2021.pdfPay G.V., Rakitina D.V., Pankova M.N., Zagaynova A.V. Comparison of the pathogenic potential of Klebsiella pneumoniae isolates from human intestinal microbiota, surface waters, and sewage. Environmental hygiene. Gigiena i Sanitaria (Hygiene and Sanitation, Russian journal). 2020; 99(12): 1360–4. https://doi.org/10.47470/0016-9900-2020-99-12 (in Russian)Пай Г.В., Ракитина Д.В., Панькова М.Н., Юдин С.М., Загайнова А.В. Сравнение патогенного потенциала изолятов Klebsiella pneumonia, выделенных из кишечной микробиоты человека, из поверхностных и сточных вод. Гигиена окружающей среды. Гигиена и санитария. 2020; 99(12): 1360-4. https://doi.org/10.47470/0016-9900-2020-99-12-1360-1364Compain F., Babosan A., Brisse S., Genel N., Audo J., Ailloud F., et al. Multiplex PCR for detection of seven virulence factors and K1/K2 capsular serotypes of Klebsiella pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 2014; 52(12): 4377-80. https://doi.org/10.1128/jcm.02316-14Yong D., Toleman M.A., Giske C.G., Cho H.S., Sundman K., Lee K., et al. Characterization of a new metallo-beta-lactamase gene, bla(NDM-1), and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence typefrom India. Antimicrob. Agents Chemother. 2009; 53(12): 5046-54. https://doi.org/10.1128/aac.00774-09Walsh T.R., Weeks J., Livermore D.M., Toleman M.A. Dissemination of NDM-1 positive bacteria in the New Delhi environment and its implications for human health: an environmental point prevalence study. Lancet Infect. Dis. 2011; 11(5): 355-62. https://doi.org/10.1016/s1473-3099(11)70059-7Dortet L., Poirel L., Nordmann P. Worldwide dissemination of the NDM-type carbapenemases in Gram-negative bacteria. Biomed. Res. Int. 2014; 2014: 249856. https://doi.org/10.1155/2014/249856Tavoschi L., Forni S., Porretta A., Righi L., Pieralli F., Menichetti F., et al. Prolonged outbreak of New Delhi metallo-beta-lactamase-producing carbapenem-resistant Enterobacterales (NDM-CRE), Tuscany, Italy, 2018 to 2019. Euro Surveill. 2020; 25(6): 2000085. https://doi.org/10.2807/1560-7917.es.2020.25.6.2000085Poirel L., Dortet L., Bernabeu S., Nordmann P. Genetic features of blaNDM-1-positive Enterobacteriaceae. Antimicrob. Agents Chemother. 2011; 55(11): 5403-7. https://doi.org/10.1128/aac.00585-11Mulvey M.R., Grant J.M., Plewes K., Roscoe D., Boyd D.A. New Delhi metallo-β-lactamase in Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli, Canada. Emerg. Infect. Dis. 2011; 17(1): 103-6. https://doi.org/10.3201/eid1701.101358Shen Z., Hu Y., Sun Q., Hu F., Zhou H., Shu L., et al. Emerging carriage of NDM-5 and MCR-1 in Escherichia coli from healthy people in multiple regions in China: A Cross Sectional Observational Study. EClinicalMedicine. 2018; 6: 11-20. https://doi.org/10.1016/j.eclinm.2018.11.003Onanuga A., Eboh D., Odetoyin B., Adamu O. Detection of ESBLs and NDM-1 genes among urinary Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae from healthy students in Niger Delta University, Amassoma, Bayelsa State, Nigeria. PAMJ-OH. 2020; 2: 12. https://doi.org/10.11604/pamj-oh.2020.2.12.23588Toleman M.A., Bugert J.J., Nizam S.A. Extensively drug-resistant New Delhi metallo-β-lactamase - encoding bacteria in the environment, Dhaka, Bangladesh, 2012. Emerg. Infect. Dis. 2015; 21(6): 1027-30. https://doi.org/10.3201/eid2106.141578Ahammad Z.S., Sreekrishnan T.R., Hands C.L., Knapp C.W., Graham D.W. Increased waterborne blaNDM-1 resistance gene abundances associated with seasonal human pilgrimages to the Upper Ganges River. Environ. Sci. Technol. 2014; 48(5): 3014-20. https://doi.org/10.1021/es405348hFang C.T., Chuang Y.P., Shun C.T., Chang S.C., Wang J.T. A novel virulence gene in Klebsiella pneumoniae strains causing primary liver abscess and septic metastatic complications. J. Exp. Med. 2004; 199(5): 697-705. https://doi.org/10.1084/jem.20030857Hsu C.R., Lin T.L., Chen Y.C., Chou H.C., Wang J.T. The role of Klebsiella pneumoniae rmpA in capsular polysaccharide synthesis and virulence revisited. Microbiology (Reading). 2011; 157(Pt. 12): 3446-57. https://doi.org/10.1099/mic.0.050336-0Holden V.I., Breen P., Houle S., Dozois C.M., Bachman M.A. Klebsiella pneumoniae Siderophores Induce Inflammation, Bacterial Dissemination, and HIF-1α Stabilization during Pneumonia. mBio. 2016; 7(5): e01397-16. https://doi.org/10.1128/mbio.01397-16Holt K.E., Wertheim H., Zadoks R.N., Baker S., Whitehouse C.A., Dance D., et al. Genomic analysis of diversity, population structure, virulence, and antimicrobial resistance in Klebsiella pneumoniae, an urgent threat to public health. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2015; 112(27): E3574-81. https://doi.org/10.1073/pnas.1501049112Turton J.F., Payne Z., Coward A., Hopkins K.L., Turton J.A., Doumith M., et al. Virulence genes in isolates of Klebsiella pneumoniae from the UK during 2016, including among carbapenemase gene-positive hypervirulent K1-ST23 and ‘non-hypervirulent’ types ST147, ST15 and ST383. J. Med. Microbiol. 2018; 67(1): 118-28. https://doi.org/10.1099/jmm.0.000653Turton J., Davies F., Turton J., Perry C., Payne Z., Pike R. Hybrid Resistance and Virulence Plasmids in «High-Risk» Clones of Klebsiella pneumoniae, Including Those Carrying blaNDM-5. Microorganisms. 2019; 7(9): 326. https://doi.org/10.3390/microorganisms7090326Yuan Y., Li Y., Wang G., Li C., Chang Y.F., Chen W., et al. blaNDM-5 carried by a hypervirulent Klebsiella pneumoniae with sequence type 29. Antimicrob. Resist Infect. Control. 2019; 8: 140. https://doi.org/10.1186/s13756-019-0596-1