Association of polymorphisms of HLA-DRB1 and TNF-308 G/A with radiographic joint damage in patients with early rheumatoid arthritis with high inflammatory activity, treated according to the principle of “Treat to target” (REMARKA study)

I A Guseva; Гусева Ирина Анатольевна; A V Smirnov; Смирнов Александр Викторович; N V Demidova; Демидова Наталья Викторовна; M Yu Krylov; Крылов Михаил Юрьевич; A S Avdeeva; Авдеева Анастасия Сергеевна; E Yu Samarkina; Самаркина Елена Юрьевна; E L Luchikhina; Лучихина Елена Львовна; D E Karateev; Каратеев Дмитрий Евгеньевич; D D Abramov; Абрамов Дмитрий Дмитриевич; E L Nasonov; Насонов Евгений Львович

doi:10.26442/terarkh201890538-43

Association of polymorphisms of HLA-DRB1 and TNF-308 G/A with radiographic joint damage in patients with early rheumatoid arthritis with high inflammatory activity, treated according to the principle of “Treat to target” (REMARKA study)

Authors: Guseva IA¹, Smirnov AV¹, Demidova NV¹, Krylov MY.¹, Avdeeva AS¹, Samarkina EY.¹, Luchikhina EL², Karateev DE², Abramov DD³, Nasonov EL¹^,4
Affiliations:
1. Federal State Budgetary Scientific Institution «Research Institute of Rheumatology named after V.A. Nasonova»
2. Moscow Regional Research and Clinical Institute (MONIKI)
3. National Research Center - Institute of Immunology Federal Medical-Biological Agency of Russia
4. Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Education I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation
Issue: Vol 90, No 5 (2018)
Pages: 38-43
Section: Editorial
URL: https://ter-arkhiv.ru/0040-3660/article/view/32740
DOI: https://doi.org/10.26442/terarkh201890538-43
ID: 32740

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Objective. To clarify the association between HLA-DRB1 and TNFα (-308G>A) genes polymorphism and joint destruction/further progression during 12 months of the follow-up period (FUP) in patients with early (<6 months), active, predominantly antibodies to cyclic citrullinated peptide (ACCP) and rheumatoid factor (RF)-positive rheumatoid arthritis (RA) treated according to "Treat to target" strategy. Materials and Methods. The study included 85 patients with early RA and duration of symptoms <6 months. All patients were initially assigned to subcutaneous methotrexate (MTX) with rapid dose escalation to 20-25 mg/week. Combination MTX + biological therapy, mainly adalimumab, was used when MTX was ineffective. Joint destruction was assessed by Sharp-Van der Heijde modification scoring method at baseline and after 12 months FUP. Real time polymerase chain reaction (PCR-RT) was used for TNFα gene polymorphism (-308G>A) genotyping. Low resolution PCR-RT with subsequent sequence-based typing of *04 were performed to study HLA-DRB1 gene polymorphism. The HLA-DRB1*01, *04:01, *04:04, *04:05, *04:08, *10 alleles were categorized as SE+ (Shared Epitope) alleles. Results. As for TNFα gene polymorphism, it was demonstrated that the number of narrowings and total Sharp score values were almost twice as high at baseline in GG genotype carriers as compared to GA genotype carriers (р<0,005, and р<0,004 respectively). Similar association was found after 12mo FUP. The progression of joint destruction, assessed as the change (∆) in the number of erosions, joint space narrowings and the total score, was statistically significantly associated with HLA-DRB1*(SE) genotypes: the carriers of SE (SE+/SE+) double-dose had more advanced progression as compared to (SE+/SE-)/(SE-/SE-) carriers (р<0,028, р<0,019, р<0,035 respectively). Conclusion. Our data suggest that HLA-DRB1 (SE+) gene and TNFα (-308G>A) polymorphisms are associated with the progression of radiographic joint destruction in early, active RA patients managed according to "Treat to target" stratagy.

Keywords

HLA-DRB1, Shared epitope, SE, TNFA, early rheumatoid arthritis, disease activity, radiographic damage, HLA-DRB1, Shared epitope, SE, TNFA, single nucleotide polymorphism

Full Text

АЦЦП - антитела к циклическим цитруллинированным пептидам БПВП - базисные противовоспалительные препараты ВГН - верхняя граница нормы ГИБП - генно-инженерный биологический препарат МТ - метотрексат ОШ - отношение шансов ПЦР - полимеразная цепная реакция ПЦР-РВ - ПЦР в режиме реального времени РА - ревматоидный артрит РРА - ранний РА РФ - ревматоидный фактор СРБ - C-реактивный белок ФНО- α - фактор некроза опухоли-α ЧПС - число припухших суставов IgM - иммуноглобулин М Ревматоидный артрит (РА) - хроническое системное воспалительное заболевание соединительной ткани, характеризующееся деструктивным поражением суставов, в патогенезе которого значительную роль играют аутоиммунные механизмы [1]. РА относится к большой группе мультифакториальных, полигенных заболеваний, которые характеризуются вовлеченностью в формирование предрасположенности к болезни и выраженный клинический полиморфизм многих генов. Для идентификации пациентов с РА на ранней стадии болезни разработаны критерии ACR/EULAR 2010 г. [2], что позволило начинать лечение как можно раньше, следуя стратегии «Лечения до достижения цели» (“Treat to target”). Основная цель такого подхода - достижение клинической ремиссии или низкой активности заболевания. Однако необходимо подчеркнуть, что у пациентов с одинаковым диагнозом наблюдается межиндивидуальная вариабельность клинических, лабораторных, инструментальных и функциональных параметров как в момент постановки диагноза, так и в процессе лечения. В частности, у ряда пациентов наблюдается быстрое рентгенологическое прогрессирование суставного процесса с разрушением хряща и образованием эрозий, несмотря на проводимое лечение, что может приводить к функциональной недостаточности уже на ранних стадиях РА. В семейных и популяционных исследованиях показано, что не только предрасположенность к развитию РА, но и степень деструктивного поражения суставов, продукции антител к циклическим цитруллинированным пептидам (АЦЦП), ревматоидного фактора РФ генетически детерминированы [3-6]. Наиболее значимым генетическим маркером прогрессирования деструктивного поражения суставов является ген HLA-DRB1, точнее, некоторые его аллели, которые обозначают как Shared Epitope, SE-общий, схожий эпитоп, который кодируется аллелями *01:01, *01:02, *04:01, *04:04, *04:05, *04:08, *14:02, *10 [7, 8]. Всего в системе гистосовместимости человека HLA идентифицировано 200-220 генов, 30-40% из которых принимают участие в реализации иммунного ответа. Одним из ключевых цитокинов, играющих центральную роль в патогенезе РА, является интерлейкин TNF-α [фактор некроза опухоли (ФНО-α)], который кодируется геном TNFA и который, в свою очередь, картируется в регионе класса III системы HLA. В силу выраженного неравновесия по сцеплению (физически близкое расположение более 200 генов на участке ≈6 килобаз) образуются устойчивые гаплотипы. Наиболее известным является HLA-A1; B8; DR3; DQ2. Кроме того, установлено, что аллель HLA*03 ассоциирован с аллелем А полиморфного варианта гена TNFА(-308G>A). Данные о взаимосвязи наиболее хорошо изученного полиморфизма TNFА(-308G>A) в рентгенологической суставной деструкции противоречивы. Цель нашего исследования заключалась в изучении взаимосвязи аллелей гена HLA-DRB1 и полиморфизма TNFА(-308G>A) независимо друг от друга или в комбинации с деструктивным поражением суставов и его прогрессированием в течение 12 мес у больных с ранним (<6 мес), активным, преимущественно АЦЦП и РФ-позитивным РА, леченным согласно стратегии «Treat to target». Материалы и методы Исследование проведено в рамках программы РЕМАРКА (Российское исслЕдование МетотрексАта и биологических препаратов при Раннем аКтивном Артрите). В исследование включены 85 больных ранним РА (РРА) с длительностью симптомов не более 6 мес. Диагноз РА ставился по критериям ACR/EULAR 2010 г. Необходимые условия для включения пациентов в исследование: высокая активность заболевания [SDAI≥11, число припухших суставов (ЧПС) ≥3, СОЭ по Вестергрену ≥28 мм/ч или C-реактивный белок (СРБ) ≥10 мг/л]; наличие прогностических неблагоприятных факторов (обнаружение АЦЦП, иммуноглобулина М (IgM) РФ, эрозий по данным рентгенографии, значение индекса HAQ); отсутствие терапии базисными противовоспалительными препаратами (БПВП) к моменту включения пациентов в исследование. Всем пациентам первоначально назначен метотрексат (МТ) с быстрой эскалацией дозы до 20-25 мг/нед. При неэффективности назначали комбинированную терапию МТ+ГИБП, главным образом адалимумаб. Каждые 3 мес эффективность терапии контролировали по индексам активности DAS28, SDAI, CDAI. Степень деструктивного поражения суставов оценивали в момент включения в исследование (85 человек) и через 12 мес наблюдения (68 человек). Для оценки прогрессирования изменений в суставах при РА использовали метод Sharp в модификации van der Heijde. Оценивались суставы кистей и дистальных отделов стоп. Максимальный общий счет (модифицированный счет Шарпа) представлял собой суммирование баллов по эрозиям и сужениям суставных щелей. Прогрессирование суставной деструкции оценивали у каждого пациента как разность баллов (∆ счета эрозий, ∆ счета сужений суставных щелей и ∆ общего счета), измеренных при включении в исследование и через 12 мес. Кроме того, прогрессия оценивалась как дихотомичная вариабельность (есть/нет), при этом наличие прогрессии регистрировали, если имелись изменения в счете баллов (Δ=1,0 балл) при оценке рентгенограмм между временными точками 0-12 мес. Геномная ДНК выделена методом солевой экстракции с использованием хлорида натрия. Для базового низкоразрешающего генотипирования локуса HLA-DRB1 на уровне групп аллелей использовали метод на основе классической методики сиквенс-специфических праймеров (Sequence Specific Primers, SSP), модифицированной для полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (ПЦР-РВ; НПФ «ДНК-Технология»). Разработанная тест-система представляла собой 13 комплектов реагентов, предназначенных соответственно для выявления в образце следующих групп аллелей локуса HLA-DRB1: *01, *15(*02), *16(*02), *03, *04, *11(*05), *12(*05), *13(*06), *14(*06), *07, *08, *09, *10. Накопление продуктов амплификации регистрировали с помощью флюоресцентно-меченого зонда типа Taq-man®, расположенного на участке второго экзона локуса HLA DRB1, общего для всех групп аллелей. ПЦР, детекцию продуктов амплификации в режиме РВ и интерпретацию полученных результатов проводили с помощью детектирующего амплификатора ДТ-96 (ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Россия) и программного обеспечения к нему. Высокоразрешающее генотипирование аллелей DRB1*04, позволяющее «прочитать» последовательность нуклеотидов и точно определить аллель до 4-8 знаков после значка «*» (например, DRB1*040101, *0404) осуществлено на секвенаторе 3130I Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Экзон 2-го гена DRB1 амплифицирован с использованием групп специфических праймеров с последующим секвенированием ампликонов. Генотипирование полиморфизма гена TNFА(-308G>A, rs1800629) выполнено методом ПЦР-РВ (PCR-RT) с использованием оригинальных сиквенс-специфических праймеров и проб, меченных различными флюоресцентными метками (НПФ «ДНК-Технология»). Автоматическую регистрацию и интерпретацию полученных результатов проводили на отечественном инновационном детектирующем амплификаторе ДТ-96 (ООО «ДНК-Технология»). Генотипирование проводили согласно инструкции фирмы-изготовителя наборов. При проверке работоспособности созданных тест-систем в качестве референсного метода определения генотипа образцов использовали автоматическое секвенирование ДНК по Сэнгеру с применением автоматического секвенатора ABI PRISM®310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Определение концентрации АЦЦП 2 проводили иммуноферментным методом с использованием коммерческого набора фирмы «Axis-Shield Diagnostic Limited» (Великобритания) согласно инструкции фирмы-производителя, верхняя граница нормы (ВГН) - 5 Ед/мл. Больных с уровнем продукции АЦЦП > 5 Ед/мл относили в группу АЦЦП-позитивных лиц, с уровнем продукции ≤ 5 Ед/мл - в группу АЦЦП-негативных лиц. Также АЦЦП определяли электрохемилюминесцентным методом (Cobas e411), ВГН - 17 Ед/мл. Определение IgM РФ проводили методом иммунонефелометрии на автоматическом анализаторе BN-100 (Dade Behring, Германия), ВГН - 15 МЕ/л. Больные с уровнем продукции IgM РФ >15 МЕ/л отнесены в группу РФ-позитивных лиц, с уровнем продукции ≤15 МЕ/л - в группу РФ-негативных лиц. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета прикладных программ SPSS 17.0 с включением методов параметрического и непараметрического анализов. Для вариабельностей с нормальным распределением подсчитаны средние величины (means - M) и среднеквадратичные отклонения (Standard Deviations - SD), t-критерий использован для сравнения двух выборок. При асимметричном распределении вариабельностей данные представлены как медиана и межквартильный размах. Для сравнения двух независимых выборок использовали критерий Манна-Уитни, для сравнения двух зависимых выборок - критерий Вилкоксона. При сравнении трех и более независимых выборок использовали критерий Краскала-Уоллеса. Для оценки информативности генетических маркеров (аллели гена HLA-DRB1 и полиморфизм гена TNFA-308G/A) в качестве предикторов прогрессирования эрозивного процесса как бинарной переменной использован метод логистической регрессии. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы принимали равным 0,05. Результаты Демографическая, клинико-лабораторная, рентгенологическая и молекулярно-генетическая характеристики больных РРА при включении в исследование представлены в табл. 1. Обследованы 85 пациентов (19 мужчин, 66 женщин). Возраст больных варьировал от 20 до 74 лет и в среднем составил 52,0±12,9 года. В группе преобладали женщины - 66 (77,6%), соотношение мужчин и женщин равнялось 1:3,5. Средняя продолжительность заболевания на момент включения в исследование составила 4,1±1,4 мес (от 1 до 6 мес). Подавляющее число больных являлись АЦЦП (79/85) и РФ (80/85) позитивными. Количественные значения АЦЦП оказались высоки: у подавляющего числа пациентов концентрация достигала 50 Ед/мл и выше. При включении в исследование эрозии выявлены у 35 (41,2%) из 85 пациентов, через 12 мес - у 30 (44,1%) из 68 пациентов. Сужение суставных щелей наблюдалось у 82 (96,5%) из 85 и у 84 (98,8%) из 85 пациентов на момент включения в исследование и через 12 мес динамического наблюдения. Базовые количества эрозий, сужения суставных щелей и общий счет по Шарпу в баллах представлены в табл. 1. Аллели HLA-DRB1*(SE+) определялись у 56 (65,8%) пациентов, из них двойная доза SE (SE+/SE+) выявлена у 15 (17,6%) и одна копия SE (SE+/SE-) - у 41 (48,2%) пациента (см. табл. 1). Генотип TNFA- 308GG обнаружен у 64 (75,3%) пациентов и генотип GА - у 21 (24,7%) пациента. Генотип АА не выявлен ни у одного пациента (см. табл. 1). В табл. 2 представлены значения счета эрозий, сужений суставных щелей, общего счета по Шарпу, стратифицированных по генотипам гена TNFA. При включении в исследование и через 12 мес проспективного наблюдения значения счета эрозий не различались у носителей генотипов GG и GA (p>0,05). В то же время сужение суставных щелей и общего счета по Шарпу значительно коррелировало с генотипами гена TNFA. Базовые значения числа сужений и общего счета по Шарпу у носителей генотипа GG почти в два раза превышали таковые у носителей генотипа GA (p<0,005 и p<0,004 соответственно). Аналогично через 1 год значения числа сужений и общего счета по Шарпу у носителей генотипа GG в два раза превышали таковые у носителей генотипа GA (p<0,007 и p<0,002 соответственно). Необходимо отметить, что прогрессирование деструкции суставов, оцененное как ∆ сужения суставных щелей и общего счета Шарпа, не ассоциировано с полиморфизмом гена TNFA (p>0,05) через 12 мес проспективного исследования. Кроме того, мы проанализировали, усиливается ли взаимосвязь комбинации аллелей HLA-DRB1*03 и аллелей TNFA (GG/DRB1*03+, GG/DRB1*03-, GA/DRB1*03+, GA/DRB1*03-) с прогрессированием деструкции суставов. Анализ показал, что ни одна комбинация не увеличивала взаимосвязь с рентгенологическими изменениями по сравнению с генотипами TNFA. В табл. 3 представлены данные по счету эрозий, сужению суставных щелей, общему счету по Шарпу, а также прогрессированию суставного процесса, оцененному как ∆ вышеперечисленных показателей в зависимости от носительства генотипов HLA-DRB1*(SE). Пациентов разделили на две группы: 1) носители двойной дозы SE (SE+/SE+); 2) носители или одной дозы SE (SE+/SE-) или аллелей HLA-DRB1, не относящихся к SE (SE-/SE-). Как следует из табл. 3, число эрозий, сужений суставных щелей и общий счет по Шарпу как при включении в исследование, так и через 12 мес не ассоциированы с носительством и дозой аллелей SE (p>0,05). Однако прогрессирование деструктивного поражения суставов, оцененное как изменение (∆) числа эрозий, сужений суставных щелей и общего счета статистически значимо ассоциировано с генотипами HLA-DRB1*(SE): у носителей двойной дозы SE (SE+/SE+) прогрессирование выражено значительнее по сравнению с таковым у носителей (SE+/SE-)/(SE-/SE-). Логистический регрессионный анализ также выявил взаимосвязь прогрессирования деструкции суставов (эрозирование, общий счет по Шарпу), как бинарных переменных, с наличием в генотипе больного двойной дозы SE+. Показатели отношения шансов (ОШ) оказались практически одинаковыми при оценке прогрессирования по изменению счета баллов по эрозиям и общему счету по Шарпу (ОШ=4,1 [1, 1-17, 6], p=0,05). Это объясняется тем, что прогрессирование в большей мере связано с увеличением числа эрозий, но не числа сужений суставных щелей. Нами проанализирована дополнительно взаимосвязь позитивности по АЦЦП и РФ как бинарных переменных с рентгенологическими показателями деструкции суставов и генотипами генов TNFA и HLA-DRB1 (SE+). Никаких статистически значимых взаимосвязей иммунологических показателей с инструментальными и молекулярно-генетическими параметрами не обнаружено. Обсуждение РА относится к большой группе мультифакториальных, полигенных заболеваний, которые характеризуются вовлеченностью в формирование предрасположенности к болезни и выраженный клинический полиморфизм многих генов. Вполне вероятно, что гены или их полимофные варианты могут быть ассоциированы не только с предрасположенностью к развитию заболевания, но и его отдельными фенотипами. До сих пор деструктивное поражение суставов является практически неотъемлемым признаком РА, хотя у пациентов это проявление болезни носит чрезвычайно вариабельный характер. Ранее во многих исследованиях показана важная роль аллелей гена HLA-DRB1(SE+) в качестве генетического маркера неблагоприятного прогноза прогрессирования деструкции суставов [9, 10], хотя ряд исследователей полагают, что такая взаимосвязь обусловлена тесной ассоциацией аллелей HLA-DRB1(SE) с АЦЦП, которые и предопределяют тяжелое течение болезни. В нашем исследовании практически все больные являлись АЦЦП-позитивными, причем с очень высокими титрами аутоантител (выше трех норм). Однако деструктивное поражение суставов, в частности эрозирование, развилось лишь у части пациентов. Поскольку наша выборка больных с ранним активным РА характеризовалась чрезвычайно высокой частотой позитивности по АЦЦП и РФ (условие включения пациента в исследование), мы ожидали, что и частота аллелей SE+ также будет более высокой. К нашему удивлению, распределение генотипов HLA-DRB1 (SE+/SE+, SE+/SE-, SE-/SE-) не отличалось от такового в выборке больных из исследования РАДИКАЛ (21,1, 40,6, 38,3% соответственно), которая характеризовалась более низкой частотой позитивности по АЦЦП и РФ (61,0 и 67,0% соответственно) [11]. Можно предположить, что прямая взаимосвязь аллелей гена HLA-DRB1 с продукцией АЦЦП не является столь очевидным фактом. Несмотря на проводимое лечение согласно принципу «Treat to target», причем начатое на ранней стадии заболевания, у больных с активным РА наблюдалось некоторое прогрессирование деструкции суставов. Такая прогрессия связана скорее с увеличением числа эрозий, чем числа сужений суставных щелей. Мы выявили статистически значимую взаимосвязь прогрессирования деструкции суставов по Шарпу с генотипами гена HLA-DRB1(SE+). В то же время полиморфизм гена TNFA-308G/A статистически значимо ассоциирован с сужением суставных щелей и общим счетом по Шарпу как при включении больных в исследование, так и через 1 год динамического наблюдения. Однако необходимо отметить, что на фоне лечения согласно принципу «Treat to target» прогрессирования сужения щелей и общего счета по Шарпу не наблюдалось. В литературе мы не обнаружили исследований, посвященных изучению взаимосвязи полиморфизмов генов HLA-DRB1 и TNFA-308G/A с деструктивным поражением суставов и его прогрессированием в ходе лечения больных РА согласно стратегии «Treat to target». В более ранних исследованиях ассоциативная связь выше перечисленных полиморфизмов с деструкцией суставов тестировалась у больных с ранним РА, леченных базисными противовоспалительными препаратами. В 5-летнем проспективном исследовании D. Khanna и соавт. выявлена ассоциация генотипов AA/AG с более высокой степенью прогрессирования эрозий, сужения суставных щелей и общим счетом по Шарпу по сравнению с генотипом GG. Ассоциативная взаимосвязь полиморфизма гена HLA-DRB1 и совместных генотипов HLA-DRB1 и TNFA-308G/A с деструктивным поражением суставов и его прогрессированием не обнаружена [12]. Исследования A.H. van der Helm-van Mil и соавт. и S. Reneses и соавт. не выявили взаимосвязь степени деструктивного поражения суставов с полиморфизмом TNFA-308G/A [13, 14]. Заключение Полученные результаты свидетельствуют, что полиморфизм гена HLA-DRB (SE+) ассоциирован с прогрессированием деструктивного поражения суставов через 12 мес лечения. В то же время полиморфизм TNFА(-308G>A) ассоциирован с базовыми значениями сужения суставов и общим счетом по Шарпу, но не прогрессированием суставного процесса у больных с ранним, активным РА после 12 мес лечения согласно стратегии «Treat to target».