The ability of three model green proteins to covalently bind to microparticles (MP) based on poly(D,L-lactic acid) (PLA). Green fluorescent protein (sfGFP), recombinant human beta2-microglobulin-sfGFP fusion protein (β2M-sfGFP), and recombinant human amylin-sfGFP fusion protein (IAPP-sfGFP) were isolated by affinity chromatography. The double emulsion method was used to form PLA-MPs. The modification of PLA MPs by proteins was testified using laser scanning microscopy (LSM). Phagocytosis of PLA-MPs modified with different proteins and free model proteins by macrophages was also studied using LSM. Recombinant sfGFP has been shown to bind to particle surfaces at lower levels compared to β2M-sfGFP and IAPP-sfGFP. Presumably, this is due to the fact that amino groups that could potentially react with activated carboxyl groups on particle surfaces, are spatially unavailable for this reaction due to the structure of sfGFP. β2M and IAPP within the corresponding recombinant proteins are spacer structures between the surface of spherical particles and sfGFP. It was also found that increasing the protein/particle ratio by a factor of three did not lead to an increase in the amount of bound protein per unit mass of particles, which may indicate that the amount of protein that can be bound per unit mass of particles is limited by the capacity of the particles themselves. The study of phagocytosis of PLA-MPs modified with model proteins revealed that MPs bearing β2M-sfGFP and IAPP-sfGFP were captured by macrophages and, therefore, contribute to the activation of the cellular immune response, which is important in the fight against various viral infections. In addition, model proteins (β2M-sfGFP, IAPP-sfGFP) appeared to be also capable of phagocytosis. This may be due to the fact that both β2M and IAPP are amyloidogenic and aggregation prone proteins. Apparently, the aggregates of these proteins are also able to be absorbed by macrophages due to the increase in size compared to their monomeric forms.
В работе изучали способность трех модельных зеленых белков ковалентно связываться с микрочастицами (МЧ) на основе поли(D,L-молочной кислоты) (ПМК). Зеленый флуоресцентный белок (sfGFP), рекомбинантный белок слияния бета2-микроглобулина человека (β2M) с sfGFP (β2M-sfGFP), а также рекомбинантный белок слияния амилина человека (IAPP) с sfGFP (IAPP-sfGFP) выделяли методом аффинной хроматографии. Для формирования МЧ-ПМК использовали метод двойной эмульсии. Модификацию МЧ-ПМК белком подтверждали при помощи лазерной сканирующей микроскопии (ЛСМ). Кроме того, при помощи ЛСМ исследовали фагоцитоз МЧ-ПМК, модифицированных различными белками, и свободных модельных белков макрофагами. Было показано, что рекомбинантный sfGFP связывается с поверхностью частиц в меньших количествах по сравнению с β2M-sfGFP и IAPP-sfGFP. По-видимому, это обусловлено тем, что аминогруппы белка, которые потенциально могли бы вступить в реакцию с активированными карбоксильными группами на поверхности частиц, оказываются стерически недоступными для этой реакции из-за структуры sfGFP. Белки β2M и IAPP в составе соответствующих рекомбинантных белков слияния являются спейсерными структурами между поверхностью сферических частиц и sfGFP. Установлено, что увеличение соотношения белок : частицы в три раза не приводило к повышению количества связанного белка на единицу массы частиц, что может свидетельствовать о том, что количество белка, которое может быть связано на единицу массы частиц, ограничивается емкостью самих частиц. Изучение фагоцитоза модифицированных белками МЧ-ПМК показало, что МЧ-ПМК, содержащие на поверхности модельные белки (β2M-sfGFP и IAPP-sfGFP), успешно фагоцитируются макрофагами и, таким образом, могут способствовать активации клеточного иммунного ответа, что важно при борьбе с различными инфекциями, в том числе вирусными. Кроме того, в работе был показан фагоцитоз модельных белков (β2M-sfGFP, IAPP-sfGFP). Это может быть связано с тем, что как β2M, так и IAPP являются амилоидогенными и склонными к агрегации белками. По всей видимости, агрегаты этих белков тоже способны поглощаться макрофагами благодаря увеличению размера по сравнению с их мономерными формами.