Russian Journal of Bioorganic ChemistryRussian Journal of Bioorganic ChemistryБиоорганическая химия0132-34231998-2860The Russian Academy of Sciences67061110.31857/S0132342323030065PDLOLWArticlesСтатьиFluorescence Decay Analysis of the Model Compounds as an Approach to Photophysical Engineering of Fluorescent ProteinsАнализ времен жизни флуоресценции модельных соединений как подход к фотофизическоЙ инженерии флуоресцентных белковBaleevaN. S.БалееваН. С.noobissat@ya.ruBaranovM. S.БарановМ. С.noobissat@ya.ruBogdanovA. M.БогдановА. М.noobissat@ya.ruShemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic ChemistryФГБУН “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАНPirogov Russian National Research Medical UniversityРоссийский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова0105202349327528427022025Copyright ©; 2023, Н.С. Балеева, М.С. Баранов, А.М. БогдановCopyright ©; 2023, Н.С. Балеева, М.С. Баранов, А.М. Богданов2023Н.С. Балеева, М.С. Баранов, А.М. БогдановН.С. Балеева, М.С. Баранов, А.М. Богдановhttps://journals.eco-vector.com/0132-3423/article/view/670611

Studying of structure-function relationships between a chromophore and its protein environment plays a key role in photophysical engineering of fluorescent proteins (FPs), specifically, in the guided designing of their new variants with a higher fluorescence quantum yield (FQY). Known approaches to FQY increasing mostly rely on suppression of the excited state nonradiative processes, but no tools have been suggested for the tuning of the radiative rate constant (kr), which is also a potentially “adjustable” value. Here, we propose an experimental approach in which the synthetic chromophore of FP models the “fixation” of the most important radiationless constants and allows monitoring of the fluorescence lifetime flexibility (as an indicator of the kr value). As a proof-of-concept, we studied the time-resolved fluorescence behavior of the green and blue FP chromophore analogs in diverse chemical environments. The conformationally locked analog of the GFP chromophore in most cases showed monophasic fluorescence decay kinetics with a lifetime of 2.7–3.0 ns, thus adequately modeling the typical behavior of GFPs with the highest FQYs. Under the conditions of stimulated ionization of this chromophore, we observed increased (up to 4.3–4.6 ns) fluorescence lifetimes, which can be interpreted in terms of an increase in the radiative constant (kr). The conformationally locked analog of the Sirius chromophore showed biexponential fluorescence decay kinetics, partly simulating the properties of the blue FPs. In an acetic acid solution, this compound exhibited distinct fluorescent properties (elevated fluorescence intensity with a major lifetime population of ~4 ns), which can be interpreted as the emission of an unusual cationic form of the chromophore.

Изучение структурно-функциональных взаимосвязей между хромофором и его белковым окружением – ключевой аспект при фотофизической инженерии флуоресцентных белков (ФБ), в частности в направленном получении их новых вариантов с высоким квантовым выходом флуоресценции (КВФ). Описаны подходы к увеличению КВФ, основанные на подавлении безызлучательных процессов в возбужденном состоянии, однако не выработан инструментарий направленного изменения константы флуоресценции (kr), которая также выступает потенциально “настраиваемой” величиной. Мы предлагаем экспериментальный подход, в рамках которого синтетический хромофор ФБ моделирует “фиксацию” наиболее значимых безызлучательных констант и дает представление о пластичности времени жизни флуоресценции (как индикатора kr). Для подтверждения работоспособности данного подхода мы проанализировали времяразрешенное флуоресцентное поведение аналогов хромофора зеленого и синего ФБ в разнообразном химическом окружении. Конформационно-фиксированный аналог хромофора зеленого флуоресцентного белка (GFP) в большинстве случаев показывал монофазные кинетики затухания флуоресценции со временем жизни 2.7–3.0 нс, адекватно моделируя типичное поведение GFP с наиболее высокими КВФ. В условиях же принудительной ионизации этого хромофора мы наблюдали увеличенные (до 4.3–4.6 нс) времена жизни флуоресценции, которые могут быть интерпретированы в терминах увеличения константы флуоресценции (kr). Конформационно-фиксированный аналог хромофора Sirius показал биэкспоненциальные кинетики затухания флуоресценции, отчасти моделирующие свойства синих ФБ. В растворе уксусной кислоты это соединение проявило отличающиеся флуоресцентные свойства (интенсивную флуоресценцию с мажорной долгоживущей популяцией ~4 нс), которые можно интерпретировать как эмиссию необычной катионной формы хромофора.

fluorescent proteinGFPSiriusfluorescence lifetimemodel chromophoresolvatochromismradiative rate constantфлуоресцентный белокGFPSiriusвремя жизни флуоресценциимодельный хромофорсольватохромизмконстанта флуоресценцииChudakov D.M., Matz M.V., Lukyanov S., Lukyanov K.A. // Physiol. Rev. 2010. V. 90. P. 1103–1163. https://doi.org/10.1152/physrev.00038.2009Lukyanov K.A. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2022. V. 633. P. 29–32. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2022.08.089Zimmer M. // Chem. Rev. 2002. V. 102. P. 759–781. https://doi.org/10.1021/cr010142rMaddalo S.L., Zimmer M. // Photochem. Photobiol. 2006. V. 82. P. 367–372. https://doi.org/10.1562/2005-04-11-RA-485Mukherjee S., Jimenez R. // J. Phys. Chem. B. 2022. V. 126. P. 735–750. https://doi.org/10.1021/acs.jpcb.1c05629Dong J., Solntsev K.M., Poizat O., Tolbert L.M. // J. Am. Chem. Soc. 2007. V. 129. P. 10084–10085. https://doi.org/10.1021/ja073622uWu L., Burgess K. // J. Am. Chem. Soc. 2008. V. 130. P. 4089–4096. https://doi.org/10.1021/ja710388hDrobizhev M., Callis P.R., Nifosì R., Wicks G., Stoltzfus C., Barnett L., Hughes T.E., Sullivan P., Rebane A. // Sci. Rep. 2015. V. 5. P. 13223. https://doi.org/10.1038/srep13223Lin C.-Y., Romei M.G., Oltrogge L.M., Mathews I.I., Boxer S.G. // J. Am. Chem. Soc. 2019. V. 141. P. 15250–15265. https://doi.org/10.1021/jacs.9b07152Lin C.-Y., Boxer S.G. // J. Am. Chem. Soc. 2020. V. 142. P. 11032–11041. https://doi.org/10.1021/jacs.0c02796Bajar B.T., Wang E.S., Lam A.J., Kim B.B., Jacobs C.L., Howe E.S., Davidson M.W., Lin M.Z., Chu J. // Sci. Rep. 2016. V. 6. P. 20889. https://doi.org/10.1038/srep20889Duwé S., Dedecker P. // Curr. Opin. Biotechnol. 2019. V. 58. P. 183–191. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2019.04.006Olsen S., Smith S.C. // J. Am. Chem. Soc. 2007. V. 129. P. 2054–2065. https://doi.org/10.1021/ja066430sFaraji S., Krylov A.I. // J. Phys. Chem. B. 2015. V. 119. P. 13052–13062. https://doi.org/10.1021/acs.jpcb.5b07724Park J.W., Rhee Y.M. // J. Am. Chem. Soc. 2016. V. 138. P. 13619–13629. https://doi.org/10.1021/jacs.6b06833Simine L., Lammert H., Sun L., Onuchic J.N., Rossky P.J. // J. Am. Chem. Soc. 2018. V. 140. P. 1203–1206. https://doi.org/10.1021/jacs.7b10851Goedhart J., von Stetten D., Noirclerc-Savoye M., Lelimousin M., Joosen L., Hink M.A., van Weeren L., Gadella T.W.J., Jr., Royant A. // Nat. Commun. 2012. V. 3. P. 751. https://doi.org/10.1038/ncomms1738Bourgeois D. // Int. J. Mol. Sci. 2017. V. 18. P. 1187. https://doi.org/10.3390/ijms18061187Prangsma J.C., Molenaar R., van Weeren L., Bindels D.S., Haarbosch L., Stouthamer J., Gadella T.W.J.J., Subramaniam V., Vos W.L., Blum C. // J. Phys. Chem. B. 2020. V. 124. P. 1383–1391. https://doi.org/10.1021/acs.jpcb.9b10396Manna P., Hung S.-T., Mukherjee S., Friis P., Simpson D.M., Lo M.N., Palmer A.E., Jimenez R. // Integr. Biol. (Camb.). 2018. V. 10. P. 516–526. https://doi.org/10.1039/c8ib00103kMukherjee S., Manna P., Hung S.-T., Vietmeyer F., Friis P., Palmer A.E., Jimenez R. // J. Phys. Chem. B. 2022. V. 126. P. 4659–4668. https://doi.org/10.1021/acs.jpcb.2c01956Yan W., Zhang L., Xie D., Zeng J. // J. Phys. Chem. B. 2007. V. 111. P. 14055–14063. https://doi.org/10.1021/jp0756202Baranov M.S., Lukyanov K.A., Borissova A.O., Shamir J., Kosenkov D., Slipchenko L.V., Tolbert L.M., Yampolsky I.V., Solntsev K.M. // J. Am. Chem. Soc. 2012. V. 134. P. 6025–6032. https://doi.org/10.1021/ja3010144Mo G.C.H., Posner C., Rodriguez E.A., Sun T., Zhang J. // Nat. Commun. 2020. V. 11. P. 1848. https://doi.org/10.1038/s41467-020-15687-xConyard J., Heisler I.A., Chan Y., Bulman Page P.C., Meech S.R., Blancafort L. // Chem. Sci. 2018. V. 9. P. 1803–1812. https://doi.org/10.1039/c7sc04091aMamontova A.V., Solovyev I.D., Savitsky A.P., Shakhov A.M., Lukyanov K.A., Bogdanov A.M. // Sci. Rep. 2018. V. 8. P. 13224. https://doi.org/10.1038/s41598-018-31687-wSen T., Mamontova A.V., Titelmayer A.V., Shakhov A.M., Astafiev A.A., Acharya A., Lukyanov K.A., Krylov A.I., Bogdanov A.M. // Int. J. Mol. Sci. 2019. V. 20. P. 5229. https://doi.org/10.3390/ijms20205229Mamontova A.V., Shakhov A.M., Lukyanov K.A., Bogdanov A.M. // Biomolecules. 2020. V. 10. P. 1547. https://doi.org/10.3390/biom10111547Bindels D.S., Haarbosch L., van Weeren L., Postma M., Wiese K.E., Mastop M., Aumonier S., Gotthard G., Royant A., Hink M.A., Gadella T.W.J., Jr. // Nat. Methods. 2017. V. 14. P. 53–56. https://doi.org/10.1038/nmeth.4074Bindels D.S., Postma M., Haarbosch L., van Weeren L., Gadella T.W.J., Jr. // Nat. Protoc. 2020. V. 15. P. 450–478. https://doi.org/10.1038/s41596-019-0250-7Mukherjee S., Hung S.-T., Douglas N., Manna P., Thomas C., Ekrem A., Palmer A.E., Jimenez R. // Biochemistry. 2020. V. 59. P. 3669–3682. https://doi.org/10.1021/acs.biochem.0c00484Heim R., Cubitt A.B., Tsien R.Y. // Nature. 1995. V. 373. P. 663–664. https://doi.org/10.1038/373663b0Ormö M., Cubitt A.B., Kallio K., Gross L.A., Tsien R.Y., Remington S.J. // Science. 1996. V. 273. P. 1392–1395. https://doi.org/10.1126/science.273.5280.1392Tomosugi W., Matsuda T., Tani T., Nemoto T., Kotera I., Saito K., Horikawa K., Nagai T. // Nat. Methods. 2009. V. 6. P. 351–353. https://doi.org/10.1038/nmeth.1317Baleeva N.S., Tsarkova A.S., Baranov M.S. // Tet. Lett. 2016. V. 57. P. 3043–3045. https://doi.org/10.1016/j.tetlet.2016.06.006Богданов А.М., Горбачев Д.А., Зайцева Э.Р., Смирнов А.Ю., Балеева Н.С. // Биоорг. химия. 2021. Т. 47. С. 413–416. [Bogdanov A.M., Gorbachev D.A., Zaitseva E.R., Smirnov A.Y., Baleeva N.S., Baranov M.S. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2021. V. 47. P. 784–787.] https://doi.org/10.31857/S0132342321030040Borst J.W., Hink M.A., van Hoek A., Visser A.J.W.G. // J. Fluoresc. 2005. V. 15. P. 153–160. https://doi.org/10.1007/s10895-005-2523-5van Manen H.-J., Verkuijlen P., Wittendorp P., Subramaniam V., van den Berg T.K., Roos D., Otto C. // Biophys. J. 2008. V. 94. P. L67–L69. https://doi.org/10.1529/biophysj.107.127837Suhling K., Siegel J., Phillips D., French P.M.W., Lévêque-Fort S., Webb S.E.D., Davis D.M. // Biophys. J. 2002. V. 83. P. 3589–3595. https://doi.org/10.1016/S0006-3495(02)75359-9Strickler S.J., Berg R.A. // J. Chem. Phys. 1962. V. 37. P. 814–822. https://doi.org/10.1063/1.1733166Seifert M.H.J., Ksiazek D., Azim M.K., Smialowski P., Budisa N., Holak T.A. // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. P. 7932–7942. https://doi.org/10.1021/ja0257725Liu C.C., Schultz P.G. // Annu. Rev. Biochem. 2010. V. 79. P. 413–444. https://doi.org/10.1146/annurev.biochem.052308.105824Lambert T.J. // Nat. Methods. 2019. V. 16. P. 277–278. https://doi.org/10.1038/s41592-019-0352-8Lam A.J., St-Pierre F., Gong Y., Marshall J.D., Cranfill P.J., Baird M.A., McKeown M.R., Wiedenmann J., Davidson M.W., Schnitzer M.J., Tsien R.Y., Lin M.Z. // Nat. Methods. 2012. V. 9. P. 1005–1012. https://doi.org/10.1038/nmeth.2171Shaner N.C., Lambert G.G., Chammas A., Ni Y., Cranfill P.J., Baird M.A., Sell B.R., Allen J.R., Day R.N., Israelsson M., Davidson M.W., Wang J. // Nat. Methods. 2013. V. 10. P. 407–409. https://doi.org/10.1038/nmeth.2413Yandell M.A., King S.B., Neumark D.M. // J. Chem. Phys. 2014. V. 140. P. 184317. https://doi.org/10.1063/1.4875021Chattoraj M., King B.A., Bublitz G.U., Boxer S.G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 8362–8367. https://doi.org/10.1073/pnas.93.16.8362Subach O.M., Gundorov I.S., Yoshimura M., Subach F.V., Zhang J., Grüenwald D., Souslova E.A., Chudakov D.M., Verkhusha V.V. // Chem. Biol. 2008. V. 15. P. 1116–1124. https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2008.08.006Grigorenko B.L., Polyakov I.V., Savitsky A.P., Nemukhin A.V. // J. Phys. Chem B. 2013. V. 117. P. 7228–7234. https://doi.org/10.1021/jp402149qYang L., Nian S., Zhang G., Sharman E., Miao H., Zhang X., Chen X., Luo Y., Jiang J. // Sci. Rep. 2019. V. 9. P. 11640. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47660-0