Russian Journal of Bioorganic ChemistryRussian Journal of Bioorganic ChemistryБиоорганическая химия0132-34231998-2860The Russian Academy of Sciences67062710.31857/S013234232303020XPEAUKBArticlesСтатьиDevelopment of a System for Biosynthesis, Isolation and Purification of Holoform of Recombinant Human Neuroglobin and Its CharacteristicsРазработка системы биосинтеза, выделения и очистки холоформы рекомбинантного нейроглобина и его физико-химическая характеристикаSemenovaM. A.СеменоваМ. А.cherita@inbox.ruDolgikhD. A.ДолгихД. А.cherita@inbox.ruKirpichnikovM. P.КирпичниковМ. П.cherita@inbox.ruMaksimovG. V.МаксимовГ. В.cherita@inbox.ruBrazheN. A.БражеН. А.cherita@inbox.ruBocharovE. V.БочаровЭ. В.cherita@inbox.ruZiganshinR. H.ЗиганшинР. Х.cherita@inbox.ruParshinaE. Y.ПаршинаЕ. Ю.cherita@inbox.ruIgnatovaA. A.ИгнатоваА. А.cherita@inbox.ruSmirnovaO. M.СмирноваО. М.cherita@inbox.ruBochkovaZ. V.БочковаЖ. В.cherita@inbox.ruChertkovaR. V.ЧертковаР. В.cherita@inbox.ruShemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, RASФГБУН “Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова” РАНBiological Faculty, Lomonosov Moscow State UniversityМосковский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультетBiophysics Department, Biological Faculty, Lomonosov Moscow State UniversityМосковский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра биофизики0105202349331933027022025Copyright ©; 2023, М.А. Семенова, Ж.В. Бочкова, О.М. Смирнова, А.А. Игнатова, Е.Ю. Паршина, Р.Х. Зиганшин, Э.В. Бочаров, Н.А. Браже, Г.В. Максимов, М.П. Кирпичников, Д.А. Долгих, Р.В. ЧертковаCopyright ©; 2023, М.А. Семенова, Ж.В. Бочкова, О.М. Смирнова, А.А. Игнатова, Е.Ю. Паршина, Р.Х. Зиганшин, Э.В. Бочаров, Н.А. Браже, Г.В. Максимов, М.П. Кирпичников, Д.А. Долгих, Р.В. Черткова2023М.А. Семенова, Ж.В. Бочкова, О.М. Смирнова, А.А. Игнатова, Е.Ю. Паршина, Р.Х. Зиганшин, Э.В. Бочаров, Н.А. Браже, Г.В. Максимов, М.П. Кирпичников, Д.А. Долгих, Р.В. ЧертковаМ.А. Семенова, Ж.В. Бочкова, О.М. Смирнова, А.А. Игнатова, Е.Ю. Паршина, Р.Х. Зиганшин, Э.В. Бочаров, Н.А. Браже, Г.В. Максимов, М.П. Кирпичников, Д.А. Долгих, Р.В. Чертковаhttps://journals.eco-vector.com/0132-3423/article/view/670627

An efficient system for the biosynthesis, isolation and purification of recombinant human neuroglobin has been developed and optimized, which makes it possible to produce protein in quantities sufficient to study its properties. According to UV-visible, IR-, CD-, and NMR spectroscopy data, recombinant neuroglobin is a structured protein in the holoform state. The data of chromato-mass-spectrometric analysis made it possible to conclude that there is a correctly formed disulfide bond in the structure of the oxidized form of the protein. Using Raman and surface-enhanced Raman spectroscopy with laser excitation at 532 nm, it was shown that heme in the reduced and oxidized forms of neuroglobin has vibrational degrees of freedom typical of b-type hemes, and the iron atom is six-coordinated. Using Raman spectroscopy with laser excitation at 633 nm, it was found that reduced –SH-groups were present in reduced neuroglobin, while in oxidized neuroglobin disulfide bridge was formed. The results obtained serve as the basis for detailed studies of the mechanism of the functioning of neuroglobin as a neuroprotector, in particular, during its interaction with oxidized cytochrome c, which is released from mitochondria in violation of their functioning and/or morphology.

Разработана и оптимизирована эффективная система биосинтеза, выделения и очистки рекомбинантного нейроглобина человека, позволяющая наработать белок в количествах, достаточных для исследования его свойств. Согласно данным УФ-видимой, ИК-, КД- и ЯМР-спектроскопии, рекомбинантный нейроглобин представляет собой структурированную холоформу белка. Данные хромато-масс-спектрометрического анализа позволили сделать вывод о наличии в структуре окисленной формы белка правильно замкнутой дисульфидной связи. При помощи спектроскопии комбинационного и гигантского комбинационного рассеяния с лазерным возбуждением 532 нм показано, что гем в восстановленной и окисленной формах нейроглобина имеет колебательные степени свободы, типичные для гемов b-типа, а атом железа гексакоординирован. С использованием спектроскопии комбинационного рассеяния с лазерным возбуждением 633 нм выявлено, что в восстановленном нейроглобине присутствуют восстановленные –SH-группы, которые образуют дисульфидный мостик в окисленном нейроглобине. Полученные результаты служат основой для детальных исследований механизма функционирования нейроглобина в качестве нейропротектора, в частности при его взаимодействии с окисленным цитохромом c, транслоцирующимся из митохондрий в цитозоль при нарушениях их функционирования и/или морфологии.

neuroglobinrecombinant proteinsheme-containing proteinsglobinsнейроглобинрекомбинантные белкигемсодержащие белкиглобиныBurmester T., Weich B., Reinhardt S., Hankeln T. // Nature. 2000. V. 407. P. 520–523. https://doi.org/10.1038/35035093Hundahl C.A., Allen G.C., Hannibal J., Kjaer K., Rehfeld J.F., Dewilde S., Nyengaard J.R., Kelsen J., Hay-Schmidt A. // Brain Res. 2010. V. 17. P. 58–73. https://doi.org/10.1016/j.brainres.2010.03.056Bentmann A., Schmidt M., Reuss S., Wolfrum U., Hankeln T., Burmester T. // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 20 660–20 665. https://doi.org/10.1074/jbc.m501338200Pesce A., Dewilde S., Nardini M., Moens L., Ascenzi P., Hankeln T., Burmester T., Bolognes M. // Structure. 2003. V. 11. P. 1087–1095. https://doi.org/10.1016/s0969-2126(03)00166-7Dewilde S., Kiger L., Burmester T., Hankeln T., Baudin-Creuza V., Aerts T., Marden M.C., Caubergs R., Moens L. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 38949–38955. https://doi.org/10.1074/jbc.m106438200Hankeln T., Ebner B., Fuchs C., Gerlach F., Haberkamp M., Laufs T.L., Roesner A., Schmidt M., Weich B., Wystub S., Saaler-Reinhardt S., Reuss S., Bolognesi M., De Sanctis D., Marden M.C., Kiger L., Moens L., Dewilde S., Nevo E., Avivi A., Weber R.E., Fago A., Burmester T. // J. Inorg. Biochem. 2005. V. 99. P. 110–119. https://doi.org/10.1016/j.jinorgbio.2004.11.009Petersen M.G., Dewilde S., Fago A. // J. Inorg. Biochem. 2008. V. 102. P. 1777–1782. https://doi.org/10.1016/j.jinorgbio.2008.05.008Tiso M., Tejero J., Basu S., Azarov I., Wang X., Simplaceanu V., Frizzell S., Jayaraman T., Geary L., Shapiro C., Ho C., Shiva S., Kim-Shapiro D.B., Gladwin M.T. // J. Biol. Chem. 2011. V. 286. P. 18 277–18 289. https://doi.org/10.1074/jbc.m110.159541Brittain T., Skommer J., Henty K., Birch N., Raychaudhuri S. // IUBMB Life. 2010. V. 62. P. 878–885. https://doi.org/10.1002/iub.405Burmester T., Hankeln T. // Acta Physiol. (Oxf). 2014. V. 211. P. 501–514. https://doi.org/10.1111/apha.12312Guidolin D., Tortorella C. Marcoli M., Maura G., Agnati L.F. // Int. J. Mol. Sci. 2016. V. 17. P. 1817. https://doi.org/10.3390/ijms17111817Brittain C., Bommarco R., Vighi M., Barmaz S., Settele J., Potts S.G. // Agricult. For. Entomol. 2010. V. 12. P. 259–266. https://doi.org/10.1111/j.1461-9563.2010.00485.xBurmester T., Hankeln T. // J. Exp. Biol. 2009. V. 212. P. 1423–1428. https://doi.org/10.1242/jeb.000729Dewilde S., Mees K., Kiger L., Lechauve C., Marden M.C., Pesce S., Bolognesi M., Moens L. // Methods Enzymol. 2008. V. 436. P. 341–357. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(08)36019-4Belleia M., Bortolottia C.A., Roccoa G.D., Borsarib M., Lancellottib L., Ranieria A., Solaa M., Battistuzzi G. // J. Inorg. Biochem. 2018. V. 178. P. 70–86. https://doi.org/10.1016/j.jinorgbio.2017.10.005Hamdane D., Kiger L., Dewilde S., Green B.N., Pesce A., Uzan J., Burmester T., Hankeln T., Bolognesi M., Moens L., Marden M.C. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 51713–51721. https://doi.org/10.1074/jbc.m309396200Fago A., Mathews A.J., Moens L., Dewilde S., Brettain T. // FEBS Lett. 2006. V. 580. P. 4884–4888. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2006.08.003Guimaraes B.G., Hamdane D., Lechauve C., Marden M.C., Golinelli-Pimpaneau B. // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2014. V. 70. P. 1005–1014. https://doi.org/10.1107/s1399004714000078Hamdane D., Kiger L., Dewilde S., Green B.N., Pesce A., Uzan J., Burmester T., Hankeln T., Bolognesi M., Moens L., Marden M.C. // Micron. 2004. V. 35. P. 59–62. https://doi.org/10.1016/j.micron.2003.10.019Lobstein J., Emrich C.A., Jeans C., Faulkner M., Riggs P., Berkmen M. // Microb. Cell Fact. 2012. V. 11. P. 56. https://doi.org/10.1186/1475-2859-11-56Chao Z., Lianzhi L., Li W., Haiwei J. // Chinese Sci. Bull. 2006. V. 51. P. 2581–2585. https://doi.org/10.1007/s11434-006-2144-7Kelly S.M., Jess T.J., Price N.C. // Biochim. Biophys. Acta. 2005. V. 1751. P. 119–139. https://doi.org/10.1016/j.bbapap.2005.06.005Geraci G., Parkhurst L.J. // Methods Enzymol. 1981. V. 76. P. 262–275. https://doi.org/10.1016/0076-6879(81)76127-5Chertkova R.V., Firsov A.M., Brazhe N.A., Nikelshparg E.I., Bochkova Z.V., Bryntseva T.V., Semenova M.A., Baizhumanov A.A., Kotova E.A., Kirpichnikov M.P., Maksimov G.V., Antonenko Y.N., Dolgikh D.A. // Biomolecules. 2022. V. 12. P. 665. https://doi.org/10.3390/biom12050665Semenova A.A., Goodilin E.A., Brazhe N.A., Ivanov V.K., Baranchikov A.E., Lebedev V.A., Goldt A.E., Sosnovtseva O.V., Savilov S.V., Egorov A.V., Brazhe A.R., Pershina E.Y., Luneva O.G., Maksimov G.V., Tretyakov Y.D. // J. Mater. Chem. 2012. V. 22. P. 24530–24544. https://doi.org/10.1039/C2JM34686ARygula A., Majzner K., Marzec K.M., Kaczor A., Pilarczyk M., Baranska M. // J. Raman Spectrosc. 2013. V. 44. P. 1061–1076. https://doi.org/10.1002/JRS.4335Brazhe N.A., Treiman M., Brazhe A.R., Find N.L., Maksimov G.V., Sosnovtseva O.V. // PLoS One. V. 7. P. e41990. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0041990Kakita M., Kaliaperumal V., Hamaguchi H. // J. Biophotonics. 2011. V. 5. P. 20–24. https://doi.org/10.1002/jbio.201100087Buzgar N., Buzatu A., Sanislav I. // An. Stiint. Univ. Al. I. Cuza Iasi. Geol. 2009. V. 55. P. 5–23.Hu S., Morris I.K., Singh J.P., Smith K.M., Spiro T.G. // J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. P. 12446–12458. https://doi.org/10.1021/ja00079a028Brazhe N.A., Treiman M., Faricelli B., Vestergaard J.H., Sosnovtseva O.V. // PLoS One. 2013. V. 8. P. e70488. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0070488Chertkova R.V., Brazhe N.A., Bryntseva T.V., Nekrasov A.N., Dolgikh D.A, Yusipovich A.I., Sosnovtseva O.V., Maksimov G.V., Rubin A.B., Kirpichnikov M.P. // PLoS One. 2017. V. 12. P. e0266695. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0266695Ogawa M., Harada Y., Yamaoka Y., Fujita K., Yaku H., Takamatsu T. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009. V. 382. P. 370–374. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2009.03.028Couture M., Burmester T., Hankeln T., Rousseau D.L. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 36377–36382. https://doi.org/10.1074/jbc.m103907200Couture M., Das T.K., Savard P.Y., Ouellet Y., Wittenberg J.B., Wittenberg B.A., Rousseau D.L., Guertin M. // Eur. J. Biochem. 2000. V. 267. P. 4770–4780. https://doi.org/10.1046/j.1432-1327.2000.01531.xBazylewski P., Divigalpitiya R., Fanchini G. // RSC Adv. 2017. V. 7. P. 2964–2970. https://doi.org/10.1039/C6RA25879DDong A., Huang P., Caughey W.S. // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 3303–3308. https://doi.org/10.1021/bi00465a022Moss D., Nabedryk E., Breton J., Mantele W. // Eur. J. Biochem. 1990. V. 187. P. 565–572. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1990.tb15338.xSun Y., Benabbas A., Zeng W., Kleingardner J.G., Bren K.L., Champion P.M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014. V. 111. P. 6570–6575. https://doi.org/10.1073/pnas.1322274111Venyaminov S.Y., Kalnin N.N. // Biopolymers. 1990. V. 30. P. 1259–1271. https://doi.org/10.1002/bip.360301310Тен Г.Н., Герасименко А.Ю., Щербакова Н.Е., Баранов В.И. // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Физика. 2019. Т. 19. С. 43–57.Nucara A., Maselli P., Giliberti V., Carbonaro M. // SpringerPlus. 2013. V. 2. P. 661. https://doi.org/10.1186/2193-1801-2-661STAT5A (NM_003152) Human Tagged ORF Clone. https://www.origene.com/catalog/cdna-clones/expression-plasmids/rc207482/neuroglobin-ngb-nm_ 021257-human-tagged-orf-cloneSambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. // Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Press, 1989.Nicolis S., Monzani E., Ciaccio C., Ascenzi P., Moens L., Casella L. // Biochem. J. 2007. V. 407. P. 89–99. https://doi.org/10.1042/bj20070372Kosmachevskaya O.V., Nasybullina E.I., Shumaev K.B., Topunov A.F. // Molecules. 2021. V. 26. P. 7207. https://doi.org/10.3390/molecules26237207Schagger H., Jagow G. // Anal. Biochem. 1987. V. 166. P. 368–379. https://doi.org/10.1016/0003-2697(87)90587-2Brazhe A.R. https://github.com/abrazhe/pyraman