Russian Journal of Bioorganic ChemistryRussian Journal of Bioorganic ChemistryБиоорганическая химия0132-34231998-2860The Russian Academy of Sciences68309310.31857/S0132342325010022MAAQNPArticlesСтатьиResearch ArticleQuantitative analysis of biomolecular condensates on a modified supportКоличественный анализ биомолекулярных конденсатов на модифицированной подложкеShtorkA. S.ШторкА. С.
Russian Federation
vedekhina.ts@rcpcm.ruPavlovaIu. I.ПавловаЮ. И.
Russian Federation
vedekhina.ts@rcpcm.ruSvetlovaJ. I.СветловаЮ. И.
Russian Federation
vedekhina.ts@rcpcm.ruIudinM. S.ЮдинМ. С.
Russian Federation
vedekhina.ts@rcpcm.ruGrafskaiaE. N.ГрафскаяЕ. Н.
Russian Federation
vedekhina.ts@rcpcm.ruManuveraV. A.МанувераВ. А.
Russian Federation
vedekhina.ts@rcpcm.ruAlievaS. E.АлиеваС. Э.
Russian Federation
vedekhina.ts@rcpcm.ruVarizhukA. M.ВарижукА. М.
Russian Federation
vedekhina.ts@rcpcm.ruV. N. LazarevV. N. Lazarev V. N. LazarevВ. Н. ЛазаревВ. Н. Лазарев В. Н. Лазарев
Russian Federation
vedekhina.ts@rcpcm.ruVedekhinaT. S.ВедехинаТ. С.
Russian Federation
vedekhina.ts@rcpcm.ruFederal Research and Clinical Center of Physical-Chemical MedicineФедеральный научно-клинический центр физико-химической медицины им. акад. Ю.М. Лопухина ФМБА РоссииMIREA — Russian technological universityМИРЭА – Российский технологический университет15022025511193105062025Copyright ©; 2025, Russian Academy of SciencesCopyright ©; 2025, Российская академия наук2025Russian Academy of SciencesРоссийская академия наукhttps://journals.eco-vector.com/0132-3423/article/view/683093

Biomolecular condensates are associates of biopolymers formed in aqueous solutions via “liquid-liquid” phase separation. Aberrant phase transitions of proteins or nucleic acids underlie several pathologies, and the need for their in vitro models stimulates the development of methods for biocondensate investigation. This work addresses the key problem of visualizing labeled protein-RNA condensates using fluorescence microscopy. The SARS-CoV-2 N-protein with a C-terminal hexahistidine tag was expressed in Escherichia coli BL21-Gold(DE3) and isolated by metal chelate chromatography. The N-protein was labeled with the RED dye, which emits fluorescence in the far-red range of the spectrum, using the RED-NHS dye. Commercially available RNA isolated from Torula yeast was used as random RNA to obtain condensates with the N-protein and SR-rich peptide. In experiments to test the colocalization of the condensate components, a labeled modified oligonucleotide forming an SL4 hairpin with an elongated stem was added to the random RNA. To obtain the APTES substrate, chemically polished glass was treated with 3-aminopropyltriethoxysilane in ethyl alcohol at pH 4.5–5.5. To obtain the DSC-APTES substrate, the APTES substrate was additionally functionalized by treating with N,N′-disuccinimidyl carbonate in the presence of diisopropylethylamine in anhydrous acetone. Quantitative assessment of condensate formation was performed using fluorescence microscopy data. The FastTrack program was used to assess droplet mobility. The Droplet_Calc program was used to assess the droplet area and curvature coefficient. The mobility of the condensates in a sample layer on glass complicates data processing. In previous studies, condensate immobilization on 3-aminopropyltriethoxysilane-treated glass (APTES), was proposed to overcome this problem. The APTES support allows non-covalent RNA/DNA binding but is suboptimal for proteins. By treating APTES with N,N′-disuccinimidyl carbonate, we obtained an alternative support, DSC-APTES, which allows covalent binding of protein fragments via lysine residues. A comparative analysis of known condensates on the abovementioned supports revealed their decreased mobility on APTES/DSC-APTES, and the optimal type of support modification depended on the condensate composition. Condensate immobilization improved image quality, and increased the colocalization of the oligonucleotide and protein components. It also facilitated the quantitative analysis of the phase separation based on the condensate fractions. New software, Droplet_Calc, was developed to automate condensate identification and fraction calculation. The results confirmed the advantages of APTES and DSC-APTES over glass when analyzing the concentration dependence of the condensate fraction and creating phase diagrams. Thus, the optimization of the support and the automation of image processing pave the way for rapid and reliable quantitative analysis of biopolymer phase transitions, which may find application in the screening of therapeutic agents disrupting pathogenic condensates.

Биомолекулярные конденсаты представляют собой скопления биополимеров, образующиеся в водных растворах по механизму разделения фаз “жидкость–жидкость”. Нарушения фазовых переходов белков и нуклеиновых кислот в клетке лежат в основе ряда патологий, и необходимость их моделирования in vitro стимулирует развитие методов исследования конденсатов. В данной работе рассмотрена ключевая проблема визуализации конденсатов меченых белков и РНК методом флуоресцентной микроскопии в бесклеточных моделях. Она сводится к тому, что подвижность конденсатов в слое образца на стекле осложняет обработку и интерпретацию данных. Для ее решения ранее предлагалось иммобилизовать конденсаты на модифицированной подложке – стекле, обработанном 3-аминопропилтриэтоксисиланом (АПТЭС). Такая подложка предполагает нековалентное связывание РНК/ДНК и неоптимальна для белковых конденсатов. С помощью обработки АПТЭС N,N′-дисукцинимидилкарбонатом нами была получена альтернативная подложка ДСК-АПТЭС для ковалентного связывания конденсатов по лизиновым остаткам экспонированных на поверхности конденсата белковых фрагментов. Сравнительный анализ образцов известных конденсатов на всех трех типах подложки выявил значимое снижение их подвижности на модифицированной (АПТЭС или ДСК-АПТЭС) подложке, причем оптимальный тип модификации зависел от состава конденсатов. Эффективная иммобилизация улучшила качество фокусировки, что проявилось в повышении показателя солокализации олигонуклеотидного и белкового компонентов, а также упростила количественный анализ разделения фаз на основе объемной доли конденсатов в образце. Для идентификации конденсатов и автоматизации расчета их доли была разработана программа Droplet_Calc. Полученные с ее помощью данные подтверждают преимущества АПТЭС и ДСК-АПТЭС в сравнении с немодифицированным стеклом при анализе концентрационной зависимости доли конденсатов для построения фазовых диаграмм. Оптимизация подложки и автоматизация обработки изображений открывают возможность быстрого и надежного количественного анализа фазовых переходов биополимеров методами микроскопии, что может быть востребовано в скрининге терапевтических агентов для разрушения патогенных конденсатов.

biomolecular condensatesliquid-liquid phase separationAPTESN-proteinRNAбиомолекулярные конденсатыразделение фаз “жидкость–жидкость”AПТЭСN-белокРНКГосударственное финансированиеGovernment funding124031200005-4Российский научный фондRussian Science Foundation22-15-00129Flory P.J. // J. Chem. Phys. 1949. V. 17. P. 303–310. https://doi.org/10.1063/1.1747243Dignon G.L., Best R.B., Mittal J. // Annu. Rev. Phys. Chem. 2020. V. 71. P. 53–75. https://doi.org/10.1146/annurev-physchem-071819-113553Bergeron-Sandoval L.-P., Safaee N., Michnick S.W. // Cell. 2016. V. 165. P. 1067–1079. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.05.026Mehta S., Zhang J. // Nat. Rev. Cancer. 2022. V. 22. P. 239–252. https://doi.org/10.1038/s41568-022-00444-7Erdel F., Rippe K. // Biophys. J. 2018. V. 114. P. 2262–2270. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2018.03.011Ilık İ.A., Aktaş T. // FEBS J. 2022. V. 289. P. 7234–7245. https://doi.org/10.1111/febs.16117Svetlova J.I., Pavlova Iu.I., Aralov A.V., Varizhuk A.M. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2023. V. 49. P. 917–929. https://doi.org/10.1134/S1068162023050229Rekulapally P., Suresh S.N. // Trends Biochem. Sci. 2019. V. 44. P. 993–995. https://doi.org/10.1016/j.tibs.2019.10.001Protter D.S.W., Parker R. // Trends Cell Biol. 2016. V. 26. P. 668–679. https://doi.org/10.1016/j.tcb.2016.05.004Wang B., Zhang L., Dai T., Qin Z., Lu H., Zhang L., Zhou F. // Sig. Transduct. Target Ther. 2021. V. 6. P. 290. https://doi.org/10.1038/s41392-021-00678-1Ganser L.R., Myong S. // Trends Biochem. Sci. 2020. V. 45. P. 1004–1005. https://doi.org/10.1016/j.tibs.2020.05.011Alberti S., Gladfelter A., Mittag T. // Cell. 2019. V. 176. P. 419–434. https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.12.035Erkamp N.A., Qi R., Welsh T.J., Knowles T.P.J. // Lab Chip. 2023. V. 23. P. 9–24. https://doi.org/10.1039/D2LC00622GChen C., Li P., Luo W., Nakamura Y., Dimo V.S., Kanekura K., Hayamizu Y. // Langmuir. 2021. V. 37. P. 5635–5641. https://doi.org/10.1021/acs.langmuir.1c00493Chen C., Jia H., Nakamura Y., Kanekura K., Hayamizu Y. // ACS Omega. 2022. V. 7. P. 19280–19287. https://doi.org/10.1021/acsomega.2c00811Saar K.L., Morgunov A.S., Qi R., Arter W.E., Krainer G., Lee A.A., Knowles T.P.J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2021. V. 118. P. e2019053118. https://doi.org/10.1073/pnas.2019053118Cascarina S.M., Ross E.D. // J. Biol. Chem. 2022. V. 298. P. 101677. https://doi.org/10.1016/j.jbc.2022.101677.Perdikari T.M., Murthy A.C., Ryan V.H., Watters S., Naik M.T., Fawzi N.L. // EMBO J. 2020. V. 39. P. e106478. https://doi.org/10.15252/embj.2020106478Iserman C., Roden C.A., Boerneke M.A., Sealfon R.S.G., McLaughlin G.A., Jungreis I., Fritch E.J., Hou Y.J., Ekena J., Weidmann C.A., Theesfeld C.L., Kellis M., Troyanskaya O.G., Baric R.S., Sheahan T.P., Weeks K.M., Gladfelter A.S. // Mol Cell. 2020. V. 80. P. 1078–1091. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.11.041Zheng X., Peng Q., Wang L., Zhang X., Huang L., Wang J., Qin Z. // Int. J. Biol. Sci. 2020. V. 16. P. 2442– 2453. https://doi.org/10.7150/ijbs.46751Fargason T., De Silva N.I.U., King E., Zhang Z., Paul T., Shariq J., Zaharias S., Zhang J. // Elife. 2023. V. 12. P. e84412. https://doi.org/10.7554/eLife.84412Hermanson G.T. // Bioconjugate Techniques, 3rd ed. Amsterdam: Elsevier BV, 2013. https://www.sciencedirect.com/book/9780123822390/bioconjugate-techniquesKoniev O., Wagner A. // Chem. Soc. Rev. 2015. V. 44. P. 5495–5551. https://doi.org/10.1039/c5cs00048cSvetlova J., Gustin D., Manuvera V., Shirokov D., Shokina V., Prusakov K., Aldarov K., Kharlampieva D., Matyushkina D., Bespyatykh J., Varizhuk A., Lazarev V., Vedekhina T. // Int. J. Mol. Sci. 2022. V. 23. P. 13220. https://doi.org/10.3390/ijms232113220Matyushkina D., Shokina V., Tikhonova P., Manuvera V., Shirokov D., Kharlampieva D., Lazarev V., Varizhuk A., Vedekhina T., Pavlenko A., Penkin L., Arapidi G., Pavlov K., Pushkar D., Kolontarev K., Rumyantsev A., Rumyantsev S., Rychkova L., Govorun V. // Viruses. 2022. V. 14. P. 1141. https://doi.org/10.3390/v14061141Hong Y., Najafi S., Casey T., Shea J.E., Han S.I., Hwang D.S. // Nat. Commun. 2022. V. 13. P. 7326. https://doi.org/10.1038/s41467-022-35001-1Roden C.A, Dai Y., Giannetti C.A., Seim I., Lee M., Rachel Sealfon, McLaughlin G.A., Boerneke M.A., Iserman C., Wey S.A., Ekena J.L., Troyanskaya O.G., Weeks K.M., You L., Chilkoti A., Gladfelter A.S. // Nucleic Acids Res. 2022. V. 50. P. 8168–8192. https://doi.org/10.1093/nar/gkac596Kurreck J. // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. P. 1911– 1918. https://doi.org/10.1093/nar/30.9.1911Svetlova J., Knizhnik E., Manuvera V., Severov V., Shirokov D., Grafskaia E., Bobrovsky P., Matyugina E., Khandazhinskaya A., Kozlovskaya L., Miropolskaya N., Aralov A., Khodarovich Y., Tsvetkov V., Kochetkov S., Lazarev V., Varizhuk A. // Int. J. Mol. Sci. 2022. V. 23. P. 15281. https://doi.org/10.3390/ijms232315281Пелевин Е.Е., Балясный С.В. // Juvenis Scientia. 2017. № 1. P. 4–7. https://doi.org/10.15643/JSCIENTIA.2017.1.001Gallois B., Candelier R. // PLoS Comput. Biol. 2021. V. 17. P. e1008697. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1008697