Russian Journal of Bioorganic ChemistryRussian Journal of Bioorganic ChemistryБиоорганическая химия0132-34231998-2860The Russian Academy of Sciences68309810.31857/S0132342325010074LZMQKQArticlesСтатьиResearch ArticleLive-cell visualization of histone modification using bimolecular complementationПрименение бимолекулярной флуоресцентной комплементации для визуализации гистоновых модификаций в живых клеткахStepanovA. I.СтепановА. И.
Russian Federation
gurskayanadya@gmail.comPutlyaevaL. V.ПутляеваЛ. В.
Russian Federation
gurskayanadya@gmail.comShuvaevaA. A.ШуваеваА. А.
Russian Federation
gurskayanadya@gmail.comAndrushkinM. A.АндрушкинМ. А.
Russian Federation
gurskayanadya@gmail.comBaranovM. S.БарановМ. С.
Russian Federation
gurskayanadya@gmail.comGurskayaN. G.ГурскаяН. Г.
Russian Federation
gurskayanadya@gmail.comLukyanovK. A.ЛукьяновК. А.
Russian Federation
gurskayanadya@gmail.comSkolkovo Institute of Science and TechnologyСколковский институт науки и технологии, Центр молекулярной и клеточной биологииShemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic ChemistryИнститут биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАНMoscow Institute of Physics and TechnologyМосковский физико-технический институтPirogov Russian National Research Medical UniversityРоссийский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова15022025511728105062025Copyright ©; 2025, Russian Academy of SciencesCopyright ©; 2025, Российская академия наук2025Russian Academy of SciencesРоссийская академия наукhttps://journals.eco-vector.com/0132-3423/article/view/683098

Epigenetic modifications of histones in human, animal, and other eukaryotic cells play a crucial role in regulating gene expression. Histones can undergo a variety of post-translational modifications in different combinations, including methylation, acetylation, phosphorylation, and others at various amino acid residues, which determine the functional state of a given chromatin locus. Changes in epigenetic modifications accompany all normal and pathological cellular processes, including proliferation, differentiation, cancer transformation, and more. Currently, the development and application of new methods for analyzing the epigenome at the single-cell level, including in live cells, are particularly relevant. In this study, new sensor systems were developed for visualizing epigenetic modifications H3K9me3 (trimethylated Lys9), H3K9ac (acetylated Lys9), and the spatial colocalization of H3K9me3 with H3K9ac, based on fluorogenic dyes. The creation of these sensors involved the use of splitFAST system as well as the histone natural reader domains MPP8 and AF9. Adding the fluorogens HMBR and N871b to the cell medium allowed for the detection of clearly distinguishable fluorescence patterns in the green and red channels, respectively. We also performed the analysis of the obtained fluorescent images using the LiveMIEL (Live-cell Microscopic Imaging of Epigenetic Landscape) computational method. Clustering of the resulting data showed agreement with the expected class labels corresponding to the presence of H3K9me3, H3K9ac, and the spatial colocalization of H3K9me3 and H3K9ac in the nucleus. The developed sensors can be effectively used to study histone modifications in various cellular processes, as well as in investigating disease development mechanisms.

Эпигенетические модификации гистонов в составе хроматина в клетках человека, животных и других эукариотических организмов играют ключевую роль в регуляции экспрессии генов. Гистоны могут подвергаться разнообразным посттрансляционным модификациям в различных комбинациях (включая метилирование, ацетилирование, фосфорилирование и др.) по различным аминокислотным остаткам, что определяет функциональное состояние данного локуса хроматина. Изменение эпигенетических модификаций сопровождает все нормальные и патологические клеточные процессы, включая пролиферацию, дифференцировку, раковую трансформацию и др. На сегодняшний день особенно актуальны разработка и применение новых методов анализа эпигенома на уровне единичных клеток, в том числе живых клеток. В данной работе были получены новые сенсорные системы для визуализации эпигенетических модификаций H3K9me3 (триметилированный Lys9), H3K9ac (ацетилированный Lys9) и пространственного сближения H3K9me3 c H3K9ac, основанные на флуорогенных красителях. Для создания сенсоров были использованы последовательности белка splitFAST, а также природные ридерные белковые домены MPP8 и AF9. Добавление в клеточную среду флуорогенов HMBR и N871b позволило детектировать ясно различимые паттерны флуоресценции в зеленом и красном каналах соответственно. Нами также был проведен обсчет полученных флуоресцентных изображений с помощью компьютерного метода анализа LiveMIEL (Live-cell Microscopic Imaging of Epigenetic Landscape). Кластеризация полученных данных показала хорошее согласование с предполагаемыми метками классов, соответствующих представленности H3K9me3, H3K9ac и пространственному сближению H3K9me3 и H3K9ac в ядре. Разработанные сенсоры могут быть эффективно использованы для изучения гистоновых модификаций в различных клеточных процессах, а также в исследовании механизмов развития заболеваний.

genetically encoded sensorH3K9me3H3K9acepigenetic regulationsplitFAST, FASTгенетически кодируемый сенсорH3K9me3H3K9acэпигенетическая регуляцияsplitFASTFASTфлуороген-активирующие белкиРоссийский научный фондRussian Science Foundation22-14-00141Millán-Zambrano G., Burton A., Bannister A.J., Schneider R. // Nat. Rev. Genet. 2022. V. 23. P. 563– 580. https://doi.org/10.1038/s41576-022-00468-7Yun M., Wu J., Workman J.L., Li B. // Cell Res. 2011. V. 21. P. 564–578. https://doi.org/10.1038/cr.2011.42Kungulovski G., Kycia I., Tamas R., Jurkowska R.Z., Kudithipudi S., Henry C., Reinhardt R., Labhart P., Jeltsch A. // Genome Res. 2014. V. 24. P. 1842–1853. https://doi.org/10.1101/gr.170985.113Mauser R., Kungulovski G., Keup C., Reinhardt R., Jeltsch A. // Epigenetics Chromatin. 2017. V. 10. P. 45. https://doi.org/10.1186/s13072-017-0153-1Delachat A.M.-F., Guidotti N., Bachmann A.L., Meireles-Filho A.C.A., Pick H., Lechner C.C., Deluz C., Deplancke B., Suter D.M., Fierz B. // Cell Chem. Biol. 2018. V. 25. P. 51–56.e6. https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2017.10.008Villaseñor R., Pfaendler R., Ambrosi C., Butz S., Giuliani S., Bryan E., Sheahan T.W., Hélène D. // Nat. Biotechnol. 2020. V. 38. P. 728–736. https://doi.org/10.1038/s41587-020-0434-2Stepanov A.I., Shuvaeva A.A., Putlyaeva L.V., Lukyanov D.K., Galiakberova A.A., Gorbachev D.A., Maltsev D.I., Pronina V., Dylov D.V., Terskikh A.V., Lukyanov K.A., Gurskaya N.G. // Cell Mol. Life Sci. 2024. V. 81. P. 381. https://doi.org/10.1007/s00018-024-05359-0Müller I., Moroni A.S., Shlyueva D., Sahadevan S., Schoof E.M., Radzisheuskaya A., Højfeldt J.W., Pedersen D.S., Trifonov M., Mikkelsen J.G. // Nat. Commun. 2021. V. 12. P. 3034. https://doi.org/10.1038/s41467-021-23308-4Ng A.H.M., Khoshakhlagh P., Rojo Arias J.E., Pasquini G., Wang K., Swiersy A., Shipman S.L., Tian C., Miller D.M. // Nat. Biotechnol. 2021. V. 39. P. 510–519. https://doi.org/10.1038/s41587-020-0742-6Tebo A.G., Gautier A. // Nat. Commun. 2019. V. 10. P. 2822. https://doi.org/10.1038/s41467-019-10855-0Plamont M.-A., Billon-Denis E., Maurin S., Gauron C., Pimenta F.M., Specht C.G., Shi J., Lamberti A., Carlier A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2016. V. 113. P. 497–502. https://doi.org/10.1073/pnas.1513094113Povarova N.V., Zaitseva S.O., Baleeva N.S., Smirnov A.Y., Myasnyanko I.N., Zagudaylova M.B., Bozhanova N.G., Yegorov A.Y., Mikhaylov A.D. // Chemistry. 2019. V. 25. P. 9592–9596. https://doi.org/10.1002/chem.201901151Benaissa H., Ounoughi K., Aujard I., Fischer E., Goïame R., Nguyen J., Tebo A.G., Pimentel C., Nicolas C. // Nat. Commun. 2021. V. 12. P. 6989. https://doi.org/10.1038/s41467-021-27334-0Padeken J., Methot S.P., Gasser S.M. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2022. V. 23. P. 623–640. https://doi.org/10.1038/s41580-022-00483-wGates L.A., Shi J., Rohira A.D., Feng Q., Zhu B., Bedford M.T., Sagum C.A., Hewitt M.J., Cai Z. // J. Biol. Chem. 2017. V. 292. P. 14456–14472. https://doi.org/10.1074/jbc.m117.802074Kokura K., Sun L., Bedford M.T., Fang J. // EMBO J. 2010. V. 29. P. 3673–3687. https://doi.org/10.1038/emboj.2010.239Li Y., Wen H., Xi Y., Tanaka K., Wang H., Peng D., Ren Y., Li Z., Liu C. // Cell. 2014. V. 159. P. 558–571. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.09.049Stepanov A.I., Besedovskaia Z.V., Moshareva M.A., Lukyanov K.A., Putlyaeva L.V. // Int. J. Mol. Sci. 2022. V. 23. P. 8988. https://doi.org/10.3390/ijms23168988Stepanov A.I., Zhurlova P.A., Shuvaeva A.A., Sokolinskaya E.L., Gurskaya N.G., Lukyanov K.A., Putlyaeva L.V. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2023. V. 687. P. 149174. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2023.149174Pedregosa F., Varoquaux G., Gramfort A., Michel V., Thirion B., Grisel O., Blondel M., Linh H., Poggio T. // J. Machine Learning Res. 2012. V. 12. P. 2825–2830. https://doi.org/10.48550/arXiv.1201.0490