Russian Journal of Bioorganic ChemistryRussian Journal of Bioorganic ChemistryБиоорганическая химия0132-34231998-2860The Russian Academy of Sciences68309910.31857/S0132342325010086LZDVJLArticlesСтатьиResearch ArticleConstruct design, isolation and purification of the monomeric form of human GPCR GPR17 for structural and functional studiesДизайн генно-инженерных конструкций, выделение и очистка мономерной формы рецептора GPR17 класса GPCR для структурно-функциональных исследованийSafronovaN. A.СафроноваН. А.
Russian Federation
mishinalexej@gmail.comLugininaA. P.ЛугининаА. П.
Russian Federation
mishinalexej@gmail.comSadovaA. A.СадоваА. А.
Russian Federation
mishinalexej@gmail.comShevtsovM. B.ШевцовМ. Б.
Russian Federation
mishinalexej@gmail.comMoiseevaO. V.МоисееваО. В.
Russian Federation
mishinalexej@gmail.comBorshchevskiyV. I.БорщевскийВ. И.
Russian Federation
mishinalexej@gmail.comMishinA. V.МишинА. В.
Russian Federation
mishinalexej@gmail.comResearch Сenter for Molecular Mechanisms of Aging and Age-related Diseases, Moscow Institute of Physics and Technology (National Research University)Центр исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний, Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)15022025511829305062025Copyright ©; 2025, Russian Academy of SciencesCopyright ©; 2025, Российская академия наук2025Russian Academy of SciencesРоссийская академия наукhttps://journals.eco-vector.com/0132-3423/article/view/683099

G protein-coupled receptors (GPCRs) are a family of heptahelical transmembrane proteins consisting of more than 800 representatives in the human genome that regulate most processes in the human body and are targets for up to a third of all modern drugs. Many GPCRs, despite their importance for pharmacology, are still considered orphan, i.e., their endogenous ligand is unknown. Orphan receptor GPR17, belonging to class A GPCR, is expressed mainly in the central nervous system, plays an important role in the formation of the myelin sheath of neurons and is a potential target for the development of new drugs against multiple sclerosis, Alzheimer's disease and ischemia. The aim of this work was to prepare GPR17 for structure-functional studies, starting with the heterologous expression and ending with obtaining a stable protein sample. Screening of various genetically engineered constructs was performed, a number of point mutations were analyzed, and a significant number of potential ligands of this receptor were tested. As a result of the work, the conditions for expression, isolation, and purification of GPR17 were optimized, which together made it possible to obtain a fairly stable and monomeric protein preparation suitable for further structural studies.

Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR), – это семейство семиспиральных трансмембранных белков, состоящее более чем из 800 представителей в геноме человека, играющих ключевую роль в регуляции большинства процессов в организме и являющихся мишенями для трети всех современных лекарств. Многие GPCR, несмотря на значимость для фармакологии, до сих пор орфанные, т.е. эндогенный лиганд для них неизвестен. Орфанный рецептор GPR17, относящийся к классу А GPCR, экспрессируется преимущественно в центральной нервной системе, играет важную роль в регуляции образования миелиновой оболочки нейронов и представляет собой потенциальную мишень для разработки новых лекарственных препаратов против рассеянного склероза, болезни Альцгеймера и ишемии. Цель данной работы заключалась в подготовке GPR17 для структурно-функциональных исследований, начиная с модификации рецептора и заканчивая получением белкового препарата. Был проведен скрининг различных генно-инженерных конструкций, проанализирован ряд точечных мутаций, а также проверено значительное число потенциальных лигандов данного рецептора. В результате работы оптимизированы условия экспрессии, выделения и очистки GPR17, что в совокупности позволило получить достаточно стабильный и мономерный белковый препарат, подходящий для дальнейших структурных исследований.

GPCRGPR17protein stabilizationGPCRGPR17стабилизация белкаМинистерство науки и высшего образования Российской ФедерацииMinistry of Science and Higher Education of the Russian Federationдоговор 075-03-2024-117, проект № FSMG-2024-0012Российский научный фондRussian Science Foundation24-74-10020Kuneš J., Hojná S., Mráziková L., Montezano A., Touyz R., Maletínská L. // Physiol Res. 2023. V. 72. P. S73–S90. https://doi.org/10.33549/physiolres.935109Marucci G., Dal Ben D., Lambertucci C., Martí Navia A., Spinaci A., Volpini R., Buccioni M. // Exp. Opin. Ther. Pat. 2019. V. 29. P. 85–95. https://doi.org/10.1080/13543776.2019.1568990Dziedzic A., Miller E., Saluk-Bijak J., Bijak M. // Int. J. Mol. Sci. 2020. V. 21. P. 1852. https://doi.org/10.3390/ijms21051852Ou Z., Sun Y., Lin L., You N., Liu X., Li H., Ma Y., Cao L., Han Y., Liu M., Deng Y., Yao L., Lu Q.R., Chen Y. // J. Neurosci. 2016. V. 36. P. 10560–10573. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0898-16.2016Yan S., Conley J.M., Reilly A.M., Stull N.D., Abhyankar S.D., Ericsson A.C., Kono T., Molosh A.I., Kubal C.A., Evans-Molina C., Ren H. // Cell Rep. 2022. V. 38. P. 110179. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.110179Ren H., Cook J. R., Kon N., Accili D. // Diabetes. 2015. V. 64. P. 3670–3679. https://doi.org/10.2337/db15-0390Sriram K., Insel P.A. // Mol. Pharmacol. 2018. V. 93. P. 251–258. https://doi.org/10.1124/mol.117.111062Khorn P.A., Luginina A.P., Pospelov V.A., Dashevsky D.E., Khnykin A.N., Moiseeva O.V., Safronova N.A., Belousov A.S., Mishin A.V., Borshchevsky V.I. // Biochemistry (Moscow). 2024. V. 89. P. 747–764. https://doi.org/10.1134/S0006297924040138Ye F., Wong T., Chen G., Zhang Z., Zhang B., Gan S., Gao W., Li J., Wu Z., Pan X., Du Y. // MedComm (Beijing). 2022. V. 3. P. e159. https://doi.org/10.1002/mco2.159Van Montfort R.L.M., Workman P. // Essays Biochem. 2017. V. 61. P. 431–437. https://doi.org/10.1042/EBC20170052Chun E., Thompson A.A., Liu W., Roth C.B., Griffith M.T., Katritch V., Kunken J., Xu F., Cherezov V., Hanson M.A., Stevens R.C. // Structure. 2012. V. 20. P. 967–976. https://doi.org/10.1016/j.str.2012.04.010Гусач А.Ю. // Структурные исследования человеческого цистеинил-лейкотриенового рецептора второго типа для создания новых лекарственных препаратов. Дис. канд. физ.-мат. наук, МФТИ, Москва, 2020.Ballesteros J.A., Weinstein H. // Methods Neurosci. 1995. V. 25. P. 366–428. https://doi.org/10.1016/S1043-9471(05)80049-7Bläsius R., Weber R.G., Lichter P., Ogilvie A. // J. Neurochem. 1998. V. 70. P. 1357–1365. https://doi.org/10.1046/j.1471-4159.1998.70041357.xCherezov V., Abola E., Stevens R.C. // Methods Mol. Biol. 2010. P. 141–168. https://doi.org/10.1007/978-1-60761-762-4_8Popov P., Peng Y., Shen L., Stevens R.C., Cherezov V., Liu Z.J., Katritch V. // Elife. 2018. V. 7. P. e34729. https://doi.org/10.7554/eLife.34729Alexandrov A.I., Mileni M., Chien E.Y.T., Hanson M.A., Stevens R.C. // Structure. 2008. V. 16. P. 351–359. https://doi.org/10.1016/j.str.2008.02.004Luginina A., Gusach A., Marin E., Mishin A., Brouillette R., Popov P., Shiriaeva A., Besserer-Offroy É., Longpré J.M., Lyapina E., Ishchenko A., Patel N., Polovinkin V., Safronova N., Bogorodskiy A., Edelweiss E., Hu H., Weierstall U., Liu W., Batyuk A., Gordeliy V., Han G. W., Sarret P., Katritch V., Borshchevskiy V., Cherezov V. // Sci. Adv. 2019. V. 5. P. eaax2518. https://doi.org/10.1126/sciadv.aax2518Ciana P., Fumagalli M., Trincavelli M.L., Verderio C., Rosa P., Lecca D., Ferrario S., Parravicini C., Capra V., Gelosa P., Guerrini U., Belcredito S., Cimino M., Sironi L., Tremoli E., Rovati G.E., Martini C., Abbracchio M.P. // EMBO J. 2006. V. 25. P. 4615–4627. https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7601341Maekawa A., Balestrieri B., Austen K.F., Kanaoka Y. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. P. 11685– 11690. https://doi.org/10.1073/pnas.0905364106Benned-Jensen T., Rosenkilde M.M. // Br. J. Pharmacol. 2010. V. 159. P. 1092–1105. https://doi.org/10.1111/j.1476-5381.2009.00633.xQi A.D., Harden T.K., Nicholas R.A. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2013. V. 347. P. 38–46. https://doi.org/10.1124/jpet.113.207647Hennen S., Wang H., Peters L., Merten N., Simon K., Spinrath A., Blättermann S., Akkari R., Schrage R., Schröder R., Schulz D., Vermeiren C., Zimmermann K., Kehraus S., Drewke C., Pfeifer A., König G.M., Mohr K., Gillard M., Müller C.E., Lu Q.R., Gomeza J., Kostenis E. // Sci. Signal. 2013. V. 6. P. ra93. https://doi.org/10.1126/scisignal.2004350Merten N., Fischer J., Simon K., Zhang L., Schröder R., Peters L., Letombe A., Hennen S., Schrage R., Bödefeld T., Vermeiren C., Gillard M., Mohr K., Lu Q.R., Brüstle O., Gomeza J., Kostenis E. // Cell Chem. Biol. 2018. V. 25. P. 775–786.e5. https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2018.03.012Simon K., Merten N., Schröder R., Hennen S., Preis P., Schmitt N., Peters L., Schrage R., Vermeiren C., Gillard M., Mohr K., Gomeza J., Kostenis E. // Mol. Pharmacol. 2017. V. 91. P. 518–532. https://doi.org/10.1124/mol.116.107904Harrington A.W., Liu C., Phillips N., Nepomuceno D., Kuei C., Chang J., Chen W., Sutton S.W., O’Malley D., Pham L., Yao X., Sun S., Bonaventure P. // Br. J. Pharmacol. 2023. V. 180. P. 401–421. https://doi.org/10.1111/bph.15969