Membrane and Cell BiologyMembrane and Cell BiologyБиологические мембраны0233-47553034-5219The Russian Academy of Sciences66745910.31857/S0233475524020046xugahuArticlesСТАТЬИResearch ArticleThe Mechanism of Calcium-Activated Chloride ANO6 Channel Inhibition by CaCCinh-A01Механизм действия ингибитора CaCCinh-A01 на активность кальций-зависимых хлорных каналов ANO6KolesnikovD. O.КолесниковД. О.
Russian Federation
shalygin.alexey@gmail.comGrigorievaE. R.ГригорьеваЕ. Р.
Russian Federation
shalygin.alexey@gmail.comNomerovskayaM. A.НомеровскаяМ. А.
Russian Federation
shalygin.alexey@gmail.comReshetinD. S.РешетинД. С.
Russian Federation
shalygin.alexey@gmail.comShalyginA. V.ШалыгинА. В.
Russian Federation
shalygin.alexey@gmail.comKaznacheyevaE. V.КазначееваЕ. В.
Russian Federation
evkazn@incras.ruInstitute of Cytology, Russian Academy of SciencesИнститут цитологии РАН1406202441213313826022025Copyright ©; 2024, The Russian Academy of SciencesCopyright ©; 2024, Российская академия наук2024The Russian Academy of SciencesРоссийская академия наукhttps://journals.eco-vector.com/0233-4755/article/view/667459

Proteins of the anoctamine family (ANO) form calcium-activated chloride channels (CaCC) and phospholilpid scramblases. The ANO6 (TMEM16F) protein, which combines the functions of a calcium-dependent scramblase and those of an ion channel, is considered as a molecular target for the treatment of blood clotting disorders, COVID-19-associated pneumonia, neurodegenerative diseases, and other pathologies. CaCCinh-A01, which is a channel blocker of the ANO family, is studied as a potential pharmacological drug. Previously, the effect of this inhibitor was studied using methods representing the integral ion current through the membrane, which does not allow the properties of single channels to be distinguished. Therefore, it remains unknown which characteristics of single channels are sensitive to the blocker: channel open probability, the current amplitude, or the dwelling time of the channel open state. By registration of single ANO6 channels in HEK293 cells, we showed that the action of the inhibitor is due to a decrease in both the current amplitude and the open state dwelling time of single ANO6 channels, which, in turn, leads to a decrease in their open state probability. Thus, we have characterized the mechanism of current reduction through ANO6 channels by the inhibitor CaCCinh A01.

Белки семейства аноктаминов (ANO) формируют кальций-зависимые хлорные каналы (CaCC) и фосфолипидные скрамблазы. Белок ANO6 (TMEM16F), совмещающий в себе функции кальций-зависимой скрамблазы и ионного канала, рассматривается в качестве молекулярной мишени для лечения нарушений свертываемости крови, COVID-19-ассоциированной пневмонии, нейродегенеративных заболеваний и других патологий. В качестве потенциального фармакологического препарата рассматривается CaCCinh-A01, являющийся блокатором каналов семейства ANO. Ранее эффект данного блокатора был исследован с использованием методов оценки интегральных токов ионов через мембрану, что не позволяло оценивать активность отдельных каналов. Поэтому остается неизвестным, какие характеристики каналов подвержены изменению под действием блокатора: вероятность открытого состояния, амплитуда тока через открытый канал, время жизни открытого состояния канала. Регистрируя одиночные нативные каналы ANO6 в клетках HEK293, мы показали, что действие блокатора обусловлено уменьшением как амплитуды тока через одиночные каналы ANO6, так и их времени жизни, что, в свою очередь, ведет к снижению вероятности открытого состояния каналов. Полученные данные позволяют объяснить механизм снижения интегрального тока каналов ANO6 при действии блокатора CaCCinh-A01.

CaCCinh-A01calcium-activated chloride channels (CaCC)ANO6 (TMEM16F)patch-clampsingle-channel recordingHEK293 cellsCaCCinh-A01кальций-зависимые хлорные каналы (CaCC)ANO6 (TMEM16F)метод локальной фиксации потенциаларегистрация одиночных каналовклетки HEK293РНФRussian Science Foundation22-24-00761Kalienkova V., Clerico Mosina V., Paulino C. 2021.The groovy TMEM16 family: Molecular mechanisms of lipid scrambling and ion conduction. J. Mol. Biol. 433, 166941.Yang H., Kim A., David T., Palmer D., Jin T., Tien J., Huang F., Cheng T., Coughlin S.R., Jan Y.N., Jan L.Y. 2012. TMEM16F forms a Ca2+-activated cation channel required for lipid scrambling in platelets during blood coagulation. Cell. 151, 111–122.Kostritskii A.Y., Machtens J.P. 2021. Molecular mechanisms of ion conduction and ion selectivity in TMEM16 lipid scramblases. Nat. Commun. 12, 2826.Zhang Y., Le T., Grabau R., Mohseni Z., Kim H., Natale D.R., Feng L., Pan H., Yang H. 2020. TMEM16F phospholipid scramblase mediates trophoblast fusion and placental development. Sci. Adv. 6, 19.Ousingsawat J., Wanitchakool P., Kmit A., Romao A.M., Jantarajit W., Schreiber R., Kunzelmann K. 2015. Anoctamin 6 mediates effects essential for innate immunity downstream of P2X7 receptors in macrophages. Nat. Commun. 6, 6245.Ousingsawat J., Wanitchakool P., Schreiber R., Wuelling M., Vortkamp A., Kunzelmann K. 2015. Anoctamin-6 controls bone mineralization by activating the calcium transporter NCX1. J. Biol. Chem. 290, 6270–6280.Cabrita I., Benedetto R., Schreiber R., Kunzelmann K. 2019. Niclosamide repurposed for the treatment of inflammatory airway disease. JCI Insight. 4, e128414.Braga L., Ali H., Secco I., Chiavacci E., Neves G., Goldhill D., Penn R., Jimenez-Guardeño J.M., Ortega-Prieto A.M., Bussani R., Cannatà A., Rizzari G., Collesi C., Schneider E., Arosio D., Shah A.M., Barclay W.S., Malim M.H., Burrone J., Giacca M. 2021. Drugs that inhibit TMEM16 proteins block SARS-CoV-2 spike-induced syncytia. Nature. 594, 88–93.Zhang Y., Li H., Li X., Wu J., Xue T., Wu J., Shen H., Li X., Shen M., Chen G. 2020. TMEM16F aggravates neuronal loss by mediating microglial phagocytosis of neurons in a rat experimental cerebral ischemia and reperfusion model. Front. Immunol. 11, 1144.De La Fuente R., Namkung W., Mills A., Verkman A.S. 2008. Small-molecule screen identifies inhibitors of a human intestinal calcium-activated chloride channel. Mol. Pharmacol. 73, 758–768.Shi S., Guo S., Chen Y., Sun F., Pang C., Ma B., Qu C., An H. 2020. Molecular mechanism of CaCCinh-A01 inhibiting TMEM16A channel. Arch. Biochem. Biophys. 695, 108650.Taylor K.A., Mahaut-Smith M.P. 2019. A major interspecies difference in the ionic selectivity of megakaryocyte Ca2+-activated channels sensitive to the TMEM16F inhibitor CaCCinh-A01. Platelets. 30, 962–966.Martins J.R., Faria D., Kongsuphol P., Reisch B., Schreiber R., Kunzelmann K. 2011. Anoctamin 6 is an essential component of the outwardly rectifying chloride channel. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 18168–18172.Kolesnikov D., Perevoznikova A., Gusev K., Glushankova L., Kaznacheyeva E., Shalygin A. 2021. Electrophysiological properties of endogenous single Ca2+ activated Cl-channels induced by local Ca2+ entry in HEK293. Int. J. Mol. Sci. 22, 4767.Kolesnikov D.O., Nomerovskaya M.A., Grigorieva E.R., Reshetin D.S., Skobeleva K.V., Gusev K.O., Shalygin A.V., Kaznacheyeva E.V. 2024. Calcium chelation independent effects of BAPTA on endogenous ANO6 channels in HEK293T cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 693, 149378. doi 10.1016/j.bbrc.2023.149378.Tian X.Q., Ma K.T., Wang X.W., Wang Y., Guo Z.K., Si J.Q. 2018. Effects of the calcium-activated chloride channel inhibitors T16Ainh-A01 and CaCCinh-A01 on cardiac fibroblast function. Cell Physiol. Biochem. 49, 706–716.