Obstetrics and GynecologyObstetrics and GynecologyАкушерство и гинекология0300-90922412-5679Bionika Media24806310.18565/aig.2017.12.68-77ArticlesСтатьиResearch ArticleThe transcriptional profile of cumulus cells in women with diminished ovarian reserve in ovarian stimulation protocols in different phases of the menstrual cycle in in vitro fertilization programsТранскрипционный профиль в клетках кумулюса у женщин со сниженным овариальным резервом в протоколах стимуляции функции яичников в различные фазы менструального цикла в программах экстракорпорального оплодотворенияBogatyrevaKh. AБогатыреваХава Алиевна

postgraduate of 1st gynecology department

аспирант 1-го гинекологического отделения

bogatyreva-khava@bk.ruMishievaN. GМишиеваНона Годовна

PhD, MD, Senior researcher of 11st gynecology department

д.м.н., ведущий научный сотрудник 1-го гинекологического отделения

nondoc555@mail.ruBurmenskayaO. VБурменскаяОльга Владимировна

PhD., D.Sc., Senior Researsher of molecular-genetics Department

д.б.н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярно-генетических методов

o_bourmenskaya@oparina4.ruTrofimovD. Yu.ТрофимовДмитрий Юрьевич

PhD, D.Sc., professor, Head of molecular-genetics Department

д.б.н., профессор, руководитель отдела клинической и молекулярной генетики

d_trofimov@oparina4.ruMartazanovaB. AМартазановаБелла Арсамаковна

PhD, Junior Researcher of 1st gynecology department

к.м.н., младший научный сотрудник 1-го гинекологического отделения

bellamart88@mail.ruLapinaV. SЛапинаВера Сергеевна

postgraduate of 1st gynecology department

аспирант 1-го гинекологического отделения

tifaniwow@gmail.comKorolkovaA. IКорольковаАнна Игоревна

graduate student of 1-st gynecology department

аспирант I года обучения 1-го гинекологического отделения

zaikinaai@icloud.comMartynovaM. VМартыноваМария Валерьевна

PhD, doctor of 1-st gynecology department

врач 1-го гинекологического отделения

martinova_m@bk.ruAbubakirovA. NАбубакировАйдар Назимович

PhD, Head of 1st gynecology department

к.м.н., руководитель 1-го гинекологического отделения

nondoc555@yahoo.comResearch Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Ministry of Health of RussiaФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России1512201712NO12 (2017)№12 (2017)687718022023Copyright ©; 2017, Bionika MediaCopyright ©; 2017, ООО «Бионика Медиа»2017Bionika MediaООО «Бионика Медиа»https://journals.eco-vector.com/0300-9092/article/view/248063

Objective. To explore the possibility of using the transcriptional prof ile in the cumulus cells to predict embryo quality in women with diminished ovarian reserve in the superovulation protocols in the follicular and luteal phases of the menstrual cycle. Materials and methods. 160 cumulus cell samples from 40 patients with diminished ovarian reserve, who underwent an in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection (IVF/ICSI) program, were analyzed during this investigation. The retrieved oocyte-cumulus complexes were divided into 2groups according to the treatment protocol phase. Group 1 (17 women; 70 samples) included oocytes obtained by IVF/ICSI procedures in the follicular phase of the cycle; Group 2 (23 women; 90 samples) comprised oocytes retrieved via IVF/ICSI during the luteal phase of the cycle. To identify the relationship between the expression levels of mRNA genes and the indicators of embryo quality in women with reduced ovarian reserve in the IVF/ICSI programs, the obtained cumulus cells were divided into three classes based on the quality of embryos according to the morphology assessment criteria: 1) good-quality embryos (n = 42); 2) satisfactory-quality embryos (n = 43); 3) poor-quality embryos (n = 17). A real-time RT-PCR assay was used to estimate cumulus cell mRNA expression for 10 genes: HAS2, PTGS2, GREM1, VCAN, ITPKA, ALCAM(CD166), SDC4, CALM2, SPSB, and TP53I3. Results. Analysis of embryological indicators revealed no statistically significant differences. The mean number of oocytes retrieved on the day of transvaginal puncture was 3.6±1.9 and 4.2±2.0 in the follicular and luteal phase stimulation groups, respectively (p > 0.05). The number of blastocysts was 1.6±1.4 and 1.9±1.8, respectively (p > 0.05). The cumulus cells of good-quality embryos displayed an increase in the mRNA expression levels for the HAS2, VCAN, and PTGS2 genes by 1.8, 2.0, and 2.9 times, respectively; and a decrease in that for the ITPKA gene by 1.9 times (p < 0.05). The logistic regression model was proposed to predict embryo quality in women with diminished ovarian reserve, which took into account mRNA expression levels for the VCAN, HAS2, and PTGS2 genes (the sensitivity and specificity of the technique were 90.5 and 70.6%, respectively). The mRNA expression level for the VCAN gene is the most important marker of embryo quality according to the morphology assessment criteria in the IVF/ICSI program. There was a statistically significant increase in the cumulus cell mRNA expression levels for the VCAN, SDC4, and TP53I3 genes in Study Group 2 (p = 0.003, p = 0.005, and p < 0.001, respectively). Conclusion. The mRNA expression levels for the VCAN, HAS2, and PTGS2 genes may be used as predictors for the good quality of developing embryos in women with diminished ovarian reserve. Superovulation induction during the luteal phase of the menstrual cycle has no negative impact on the developmental potential of oocytes and the quality of obtained embryos.

Цель исследования. Изучить возможность использования транскрипционного профиля в клетках кумулюса для прогноза качества эмбрионов у женщин со сниженным овариальным резервом в протоколах стимуляции суперовуляции в фолликулярную и лютеиновую фазы менструального цикла. Материал и методы. Проанализированы 160 образцов кумулюсных клеток от 40 пациенток со сниженным овариальным резервом, проходивших программу экстракорпорального оплодотворения/ интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ЭКО/ИКСИ). Полученные ооцит-кумулюсные комплексы разделялись на 2 группы в зависимости от фазы проведенного протокола лечения I группа (17 женщин - 70 образцов) ооциты, полученные в фолликулярной фазе цикла, II группа (23 женщины - 90 образцов) - ооциты, полученные в лютеиновой фазе цикла. Полученные кумулюсные клетки были разделены на три класса в зависимости от качества эмбрионов согласно морфологическим критериям оценки: 1-й класс - эмбрионы хорошего качества (n=42), 2-й класс - эмбрионы удовлетворительного качества (n=43), 3-й класс - эмбрионы неудовлетворительного качества (n=17). Был исследован уровень экспрессии мРНК 10 генов в кумулюсных клетках методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени: HAS2, PTGS2, GREM1, VCAN, ITPKA, ALCAM (CD166), SDC4, CALM2, SPSB2 и TP53I3. Результаты. При анализе эмбриологических показателей статистически значимых различий выявлено не было. Среднее число полученных ооцитов составило 3,6±1,9 в группе стимуляции в фолликулярной фазе, 4,2±2,0 в группе стимуляции в лютеиновой фазе (р>0,05). Количество бластоцист составило 1,6±1,4 и 1,9±1,8 соответственно (р>0,05). В кумулюсных клетках эмбрионов хорошего качества выявлено повышение уровня экспрессии мРНК генов H AS2 в 1,8 раза, VCAN в 2 раза и PTGS2 в 2,9 раза, и снижение уровня мРНК гена ITPKA в 1,9 раза (р<0,05). Предложена логистическая регрессионная модель прогноза качества эмбрионов у женщин со сниженным овариальным резервом, учитывающая уровень экспрессии мРНК генов VCAN, HAS2 и PTGS2 (чувствительность и специфичность метода составили 90,5 и 70,6% соответственно). Уровень экспрессии мРНК гена VCAN является наиболее информативным маркером для оценки качества эмбрионов согласно морфологическим критериям оценки. Выявлено статистически значимое повышение уровня экспрессии мРНК генов VCAN, SDC4, и TP53I3 в клетках кумулюса во II группе исследования (р=0,003, p=0,005, p<0,001 соответственно). Заключение. Уровни экспрессии мРНК генов VCAN, HAS2 и PTGS2 могут быть использованы как предикторы хорошего качества развивающихся эмбрионов у женщин со сниженным овариальным резервом. Индукция суперовуляции в лютеиновой фазе менструального цикла не оказывает отрицательного влияния на потенциал развития ооцитов и качество получаемых эмбрионов.

infertilityovarian stimulationluteal phasecumulus cellsmRNA gene expressionin vitro fertilizationбесплодиестимуляция функции яичниковлютеиновая фазакумулюсные клеткиэкспрессия мРНК геновэкстракорпоральное оплодотворениеКраснопольская К.В., Калугина А.С. Феномен «бедного» ответа на стимуляторы суперовуляции в программах ЭКО. Проблемы репродукции. 2004; 1: 51-8. [Krasnopolskaya K.V., Kalugina A.S. The phenomenon of a “poor” response to stimulators of superovulation in IVF programs. Problemy reproduktsii. 2004; 1: 51-8. (in Russian)]Ubaldi F.M., Vaiarelli A., Alviggi C., Trabucco E., Zullo F., Capalbo A. et al. Double stimulation in a single menstrual cycle increases the number of oocytes retrieved in poor prognosis patients undergoing IVF treatment. Prospective study with historical control. Fertil. Steril. 2015; 104(3, Suppl.): e322. P-630.Triantafyllidou O., Sigalos G., Vlahos N. Dehydroepiandrosterone (DHEA) supplementation and IVF outcome in poor responders. Hum. Fertil. (Camb.). 2016; 7: 1-8.de Mello Bianchi P.H., Serafini P., Monteiro da Rocha A., Assad Hassun P., Alves da Motta E.L., Sampaio Baruselli P., Chada Baracat E. Review: follicular waves in the human ovary: a new physiological paradigm for novel ovarian stimulation protocols. Reprod. Sci. 2010; 17(12): 1067-76.Kuang Y., Chen Q., Hong Q., Lyu Q., Ai A., Fu Y., Shoham Z. Double stimulations during the follicular and luteal phases of poor responders in IVF/ ICSI programmes (Shanghai protocol). Reprod. Biomed. Online. 2014; 29(6): 684-91.Ebner T., Moser M., Sommergruber M., Tews G. Selection based on morphological assessment of oocytes and embryos at different stages of preimplantation development: a review. Hum. Reprod. Update. 2003; 9(3): 251-62.Alfarawati S., Fragouli E., Colls P., Stevens J., Gutiérrez-Mateo C., Schoolcraft W.B. et al. The relationship between blastocyst morphology, chromosomal abnormality, and embryo gender. Fertil. Steril. 2011; 95(2): 520-4.McKenzie L.J., Pangas S.A., Carson S.A., Kovanci E., Cisneros P., Buster J.E. et al. Human cumulus granulosa cell gene expression: a predictor of fertilization and embryo selection in women undergoing IVF. Hum. Reprod. 2004; 19(12): 2869-74.Assou S., Haouzi D., Mahmoud K., Aouacheria A., Guillemin Y., Pantesco V. et al. A non-invasive test for assessing embryo potential by gene expression profiles of human cumulus cells: a proof of concept study. Mol. Hum. Reprod. 2008; 14(12): 711-9.Hamel M., Dufort I., Robert C., Leveille M.C., Leader A., Sirard M.A. Genomic assessment of follicular marker genes as pregnancy predictors for human IVF. Mol. Hum. Reprod. 2010; 16: 87-96.Hamel M., Dufort I., Robert C., Gravel C., Leveille M.C., Leader A., Sirard M.A. Identification of differentially expressed markers in human follicular cells associated with competent oocytes. Hum. Reprod. 2008; 23(5): 1118-27.Moley K.H., Schreiber J.R. Ovarian follicular growth, ovulation and atresia. Endocrine, paracrine and autocrine regulation. Adv. Exp. Med. Biol. 1995; 377: 103-19.Gilchrist R.B., Lane M., Thompson J.G. Oocyte-secreted factors: regulators of cumulus cell function and oocyte quality. Hum. Reprod. Update. 2008; 14(2): 159-77.Tanghe S., Van Soom A., Nauwynck H., Coryn M., de Kruif A. Minireview: Functions of the cumulus oophorus during oocyte maturation, ovulation, and fertilization. Mol. Reprod. Dev. 2002; 61(3): 414-24.Albertini D.F., Combelles C.M., Benecchi E., Carabatsos M.J. Cellular basis for paracrine regulation of ovarian follicle development Reproduction. 2001; 121(5): 647-53.Блашкив Т.В., Шепель А.А., Вознесенская Т.Ю. Экспрессия генов клетками кумулюсного окружения ооцита в период овуляции и оплодотворения (обзор литературы). Проблемы репродукции. 2014; 1: 55-8. [Blashkov T.V., Shepel A.A., Voznesenskaya T.Yu. Expression of genes by cells of cumulus surrounding oocyte during ovulation and fertilization (literature review). Problemy reproduktsii. 2014; 1: 55-8. (in Russian)]Anderson R.A., Sciorio R., Kinnell H., Bayne R.A., Thong K.J., de Sousa P.A., Pickering S. Cumulus gene expression as a predictor of human oocyte fertilisation, embryo development and competence to establish a pregnancy. Reproduction. 2009;138(4): 629-37.Wathlet S., Adriaenssens T., Segers I., Verheyen G., Van de Velde H., Coucke W. et al. Cumulus cell gene expression predicts better cleavage-stage embryo or blastocyst development and pregnancy for ICSI patients. Hum. Reprod. 2011; 26(5): 1035-51.Gebhardt K.M., Feil D.K., Dunning K.R., Lane M., Russell D.L. Human cumulus cell gene expression as a biomarker of pregnancy outcome after single embryo transfer. Fertil. Steril. 2011; 96(1): 47-52.Wathlet S., Adriaenssens T., Segers I., Verheyen G., Janssens R., Coucke W. et al. New candidate genes to predict pregnancy outcome in single embryo transfer cycles when using cumulus cell gene expression. Fertil. Steril. 2012; 98(2): 432-9.Сафронова Н.А., Калинина Е.А., Донников А.Е., Бурменская О.В., Макарова Н.П., Зобова А.В., Алиева К.У., Горшинова В.К. Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т. Ассоциация экспрессии генов в кумулюсных клетках с эмбриологическими показателями в программах вспомогательных репродуктивных технологий. Акушерство и гинекология. 2016; 7: 60-6. http:// dx.doi.org/10.18565/aig.2016.7.60-66Gardner D.K., Schoolcraft W.B. In vitro culture of human blastocysts. In: Jansen R., Mortimer D., eds. Toward reproductive certainty: fertility and genetics beyond. Carnforth: Parthenon Publishing; 1999: 378-88.Sathyan S., Koshy L.V., Balan S., Easwer H.V., Premkumar S., Nair S. et al. Association of Versican (VCAN) gene polymorphisms rs251124 and rs2287926 (G428D), with intracranial aneurysm. Meta Gene. 2014; 2: 651-60.Theocharis A.D. Versican in health and disease. Connect. Tissue Res. 2008; 49(3): 230-4.LaPierre D.P., Lee D.Y., Li S.Z., Xie Y.Z., Zhong L., Sheng W. et al. The ability of versican to simultaneously cause apoptotic resistance and sensitivity. Cancer Res. 2007; 67(10): 4742-50.Bukong T.N., Maurice S.B., Chahal B., Schaeffer D.F., Winwood P.J. Versican: a novel modulator of hepatic fibrosis. Lab. Invest. 2016; 96(3): 361-74.Xie J., Wang J., Li R., Dai Q., Yong Y., Zong B. et al. Syndecan-4 over-expression preserves cardiac function in a rat model of myocardial infarction. J. Mol. Cell. Cardiol. 2012; 53(2): 250-8.Sutton A., Friand V., Brulé-Donneger S., Chaigneau T., Ziol M., Sainte-Catherine O. et al. Stromal cell-derived factor-1/chemokine (C-X-C motif) ligand 12 stimulates human hepatoma cell growth, migration, and invasion. Mol. Cancer Res. 2007; 5(1): 21-33.Sakata M., Kobayashi H., Sun G.W., Mochizuki O., Takagi A., Kojima T. Ryudocan expression by luteinized granulosa cells is associated with the process of follicle atresia. Fertil. Steril. 2000; 74(6): 1208-14.Porté S., Valencia E., Yakovtseva E.A., Borràs E., Shafqat N., Debreczeny J.E. et al. Three-dimensional structure and enzymatic function of proapoptotic human p53-inducible quinone oxidoreductase PIG3. J. Biol. Chem. 2009; 284(25): 17194-205.Lee J.H., Kang Y., Khare V., Jin Z.Y., Kang M.Y., Yoon Y. et al. The p53-inducible gene 3 (PIG3) contributes to early cellular response to DNA damage. Oncogene. 2010; 29(10): 1431-50.Herraiz C., Calvo F., Pandya P., Cantelli G., Rodriguez-Hernandez I., Orgaz J.L. et al. Reactivation of p53 by a cytoskeletal sensor to control the balance between DNA damage and tumor dissemination. J. Natl. Cancer Inst. 2015;108(1): pii: djv289.Fragouli E., Wells D., Iager A.E., Kayisli U.A., Patrizio P. Alteration of gene expression in human cumulus cells as a potential indicator of oocyte aneuploidy. Hum. Reprod. 2012; 27(8): 2559-68.Marei W.F.A., Salavati M., Fouladi-Nashta A.A. Critical role of hyaluronidase-2 during preimplantation embryo development. Mol. Hum. Reprod. 2013; 19(9): 590-9.Yokoo M., Sato E. Cumulus-oocyte complex interactions during oocyte maturation. Int. Rev. Cytol. 2004; 235: 251-91.Itano N., Kimata K. Mammalian hyaluronan synthases. IUBMB Life. 2002; 54(4): 195-9.Camenisch T.D., Spicer A.P., Brehm-Gibson T., Biesterfeldt J., Augustine M.L., Calabro A. Jr. et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. J. Clin. Invest. 2000; 106(3): 349-60.Hernandez-Gonzalez I., Gonzalez-Robayna I., Shimada M., Wayne C.M., Ochsner S.A., White L., Richards J.S. Gene expression profiles of cumulus cell oocyte complexes during ovulation reveal cumulus cells express neuronal and immune-related genes: does this expand their role in the ovulation process? Mol. Endocrinol. 2006; 20(6): 1300-21.Shimada M., Yanai Y., Okazaki T., Noma N., Kawashima I., Mori T., Richards J.S. Hyaluronan fragments generated by sperm-secreted hyaluronidase stimulate cytokine/chemokine production via the TLR2 and TLR4 pathway in cumulus cells of ovulated COCs, which may enhance fertilization. Development. 2008; 135(11): 2001-11.Alaniz L., Rizzo M., Garcia M.G., Piccioni F., Aquino J.B., Malvicini M. et al. Low molecular weight hyaluronan preconditioning of tumor-pulsed dendritic cells increases their migratory ability and induces immunity against murine colorectal carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 2011; 60(10): 1383-95.Ohno-Nakahara M., Honda K., Tanimoto K., Tanaka N., Doi T., Suzuki A. et al. Induction of CD44 and MMP expression by hyaluronidase treatment of articular chondrocytes. J. Biochem. 2004; 135(5): 567-75.Matsumoto K., Li Y., Jakuba C., Sugiyama Y., Sayo T., Okuno M. et al. Conditional inactivation of Has2 reveals a crucial role for hyaluronan in skeletal growth, patterning, chondrocyte maturation and joint formation in the developing limb. Development. 2009; 136: 2825-35.Arosh J.A., Banu S.K., Chapdelaine P., Fortier M.A. Temporal and tissue-specific expression of prostaglandin receptors EP2, EP3, EP4, FP, and cyclooxygenases 1 and 2 in uterus and fetal membranes during bovine pregnancy. Endocrinology. 2004; 145(1): 407-17.Davis B.J., Lennard D.E., Lee C.A., Tiano H.F., Morham S.G., Wetsel W.C., Langenbach R. Anovulation in cyclooxygenase-2-deficient mice is restored by prostaglandin E2 and interleukin-1beta. Endocrinology. 1999; 140(6): 2685-95.Lim H., Paria B.C., Das S.K., Dinchuk J.E., Langenbach R., Trzaskos J.M., Dey S.K. Multiple female reproductive failures in cyclooxygenase 2-deficient mice. Cell. 1997; 91(2): 197-208.Adriaenssens T., Segers I., Wathlet S., Smitz J. The cumulus cell gene expression profile of oocytes with different nuclear maturity and potential for blastocyst formation. J. Assist. Reprod. Genet. 2011; 28(1): 31-40.Cillo F., Brevini T.A., Antonini S., Paffoni A., Ragni G., Gandolfi F. Association between human oocyte developmental competence and expression levels of some cumulus genes. Reproduction. 2007; 134(5): 645-50.