The positive and negative aspects of adhesive activity of human thrombocytes

Abstract

The article presents review of data concerning significance of adhesion of human thrombocytes in norm and pathology. The methods of investigation, regulation and application of adhesive activity of human thrombocytes in medicine, biology and bioengineering.

Full Text

Одной из отличительных черт биологически полноценных тромбоцитов человека является наличие у них адгезивной активности. Способность к адгезии характерна практически для всех типов эукариотических клеток, однако в случае тромбоцитов она играет ключевую роль в выполнении этими клетками их биологического предназначения. Показано, что процесс формирования тромба начинается с адгезии тромбоцитов в области повреждения сосуда, их активации и вовлечения в этот процесс других тромбоцитов, которые в результате приводят к формированию тромбоцитарного агрегата [1-3]. Адгезия тромбоцитов неразрывно связана с выбросом за пределы клеток содержимого секреторных везикул (гранул), содержащих, с одной стороны, факторы гемостаза (Са2+, АДФ, тромбоспондин, фактор Виллебранда и т.д.), с другой - вещества, способствующие дальнейшим процессам репарации и регенерации поврежденных тканей [1-4]. Нарушения адгезии тромбоцитов (ее отсутствие или, наоборот, гиперактивность) часто приводят к нарушениям гемостаза (кровоточивость, тромбоз), способствуют развитию других патологий, таких как атеросклеротические осложнения, трофические язвы, злокачественные новообразования и т.д. [2-4]. Поэтому изучение адгезивной активности тромбоцитов человека имеет большое значение в медицине, биологии и биотехнологии. Методы изучения адгезии тромбоцитов Для оценки адгезивной активности тромбоцитов существуют различные подходы. Наиболее простым является метод пропускания крови или плазмы через ко - лонку, заполненную стеклянными бусинами диаметром 1-2 мм, с дальнейшим подсчетом числа оставшихся клеток в пробе [5]. Однако такой метод адекватен лишь при очень узком диапазоне концентрации клеток в пробе, не отражает динамических изменений морфологии исследуемых тромбоцитов. Более эффективной является оценка содержания адгезировавших тромбоцитов в пробе с помощью методов спектроскопии, основанных на окрашивании тромбоцитов флюоресцентными [6, 7] или гистохимическими красителями [8], при этом часто используются наборы с адгезивными субстратами (коллаген, фибрин и др.). Вместе с тем спектроскопический анализ фиксированных тромбоцитов или их компонентов не позволяет достоверно оценить исходную структурную и функциональную полноценность исследуемых клеток. Поэтому наиболее адекватной представляется оценка адгезивности тромбоцитов на основе морфометрического и морфофункионального анализа. В настоящее время эта задача может быть решена с помощью флюоресцентной микроскопии (анализ клеток, окрашенных витальными и суправитальными флюорохромными красителями), интерференционной микроскопии (анализ светооптических параметров адгезирующих тромбоцитов) и атомно-силовой микроскопии (анализ микрорельефа и контуров тромбоцитов). Необходимо подчеркнуть, что морфологические изменения тромбоцитов, адгезиру- ющих на стекле, можно наблюдать и в фазово-контрастном световом микроскопе [9, 10] без использования сложных методик, однако при этом весьма затруднен анализ целостностности структур как на поверхности тромбоцита (рецепторы адгезии, маркеры активации), так и внутри цитоплазмы (гранулы, канальцевая сеть, элементы цитоскелета). В целом основным недостатком микроскопического исследования тромбоцитов в проходящем свете является отсутствие четких критериев, определяющих «морфологическую норму» тромбоцита [10, 11], а также невозможность исследования адгезии на оптически плотных субстратах. В связи с этим оценка адгезивной активности тромбоцитов методами флюоресцентной и атомно-силовой микроскопии имеет несомненное преимущество. Показано, что атомно-силовая микроскопия позволяет зарегистрировать процесс дегрануляции тромбоцитов без применения красителей [12], проще поддается автоматизации, однако не может дифференциально выявить те или иные внутренние структуры тромбоцита, а также отличить клетки, активированные в процессе адгезии на стекле, от клеток, изменивших форму еще до адгезии. Поэтому оценка адгезивной активности тромбоцитов должна обязательно включать параллельный анализ их внутренней морфологии. Морфофункциональный анализ тромбоцитов с помощью флюоресцентного микроскопа требует подбора соответствующих красителей, позволяющих дифференциально выявить те или иные структуры в тромбоците. Нужно сказать, что окрашивание тромбоцитов человека витальными (прижизненными, не требующими химической фиксации) красителями используется все еще недостаточно широко [13, 14]. Известны способы выявления активированных тромбоцитов с помощью флюоресцентных маркеров P-селектина [13, 15] и митохондрий [16], однако такое окрашивание не позволяет адекватно оценить сам процесс адгезии. Адгезирующие тромбоциты наглядно выявляются при использовании меченного флуорохромами фаллоидина - гептапептида, избирательно связывающего фибриллярный актин (F-актин). В покоящихся (неактивированных) тромбоцитах основная часть F-актина распределена в виде узкого кольца по периферии тромбоцита, и такие клетки имеют низкую интенсивность свечения при окрашивании фаллоидином. При адгезии на стекле цитоскелет тромбоцитов претерпевает заметные изменения - происходит значительная полимеризация мономеров актина с образованием множества актиновых фибрилл. Эти фибриллы связываются с фаллоидином и дают интенсивное свечение [17, 18]. При этом можно выявлять тромбоциты разных стадий активации - на ранней стадии выявляемый фаллои- дином F-актин распределен диффузно по периферии тромбоцита [17], на более поздних стадиях наблюдается формирование многочисленных актиновых пучков, позволяющих тромбоциту формировать многочисленные отростки, которые нередко образуют целую зону выпячивания цитоплазмы (ламеллоподию). Описанные процессы возможны лишь в нормальных тромбоцитах, биологически неполноценные или деградирующие клетки не способны к адгезии и, следовательно, не могут иметь интенсивного свечения при окрашивании фаллоидином. К сожалению, фаллоидин не может быть использован для оценки адгезии клеток в динамике, поскольку необратимо связывается с F-актином, блокируя дальнейшую перестройку актиновых фибрилл. Для динамического исследования адгезивной активности тромбоцитов очень удобен витальный краситель на основе трипаф- лавина и акридинового оранжевого, который не вызывает нарушений биологической полноцености тромбоцитов [19]. Окрашенные трипафлавином-акридино- вым оранжевым тромбоциты имеют зеленое свечение цитоплазмы и красно-оранжевое свечение гранул - это позволяет регистрировать изменение формы отдельных тромбоцитов, процесс их дегрануляции, локомоторную активность, а также оценивать содержание адгезивно активных клеток во всей популяции тромбоцитов исследуемой пробы. В настоящее время ведется работа по усовершенствованию данного метода исследования тромбоцитов с целью его автоматизации и достижения возможности оценки количества биологически полноценных тромбоцитов на адгезивной поверхности. Отсутствие адгезии тромбоцитов как проявление тромбоцитопатии Нарушение адгезивной активности тромбоцитов ведет к прямому сбою в работе клеточного звена гемостаза, развитию геморрагических осложнений, нарушению репарации сосудов и близлежащих тканей. Поэтому своевременная оценка адгезивной активности тромбоцитов играет важную роль как в клинической практике, так и при заготовке тромбоцитов доноров. В клеточной биологии отсутствие адгезии часто связывают с нарушениями структуры интегринов - трансмембранных белков, играющих ключевую роль в распознавании клетками друг друга, а также при их контакте с субстратом [20]. Для адгезии необходимо, чтобы интегриновые комплексы на плазматической мембране клетки переходили из неактивной конформации в активную, поскольку только в этом случае становится возможной активация системы внутриклеточного сигналинга, запускающей в свою очередь перестройку цитоскелета клетки и ее распластывание на субстрате [20-23]. Дефекты интегриновых молекул тромбоцитов характерны для ряда генетически обусловленных патологий, таких как синдром Бернара-Сулье (нарушение прямого связывания с коллагеном), болезнь Виллебранда, тромбастения Гланцмана (нарушение связывания с фибрином и фибриногеном) [24-27]. Стоит отметить, что отсутствие адгезии тромбоцитов на одном из субстратов может не препятствовать их адгезии на других адгезивных поверхностях. Так, при тромбастении Гланцмана тромбоциты не способны к образованию агрегатов и связыванию фибрина и фибриногена, однако при этом они сохраняют способность к адгезии на стекле и коллагене [27]. Вместе с тем резкое снижение адгезивной активности тромбоцитов (независимо от субстрата) наблюдается при многих гематологических заболеваниях [25-27], связанных с угнетением мегакариоцитопоэза и созреванием тромбоцитов (миелодиспластический синдром, миелоидный и миелобластный лейкозы, апластическая анемия и т.д.). Во всех этих случаях тромбоциты имеют выраженные нарушения внутренней структуры, такие как отсутствие и/или дефекты гранул, повреждение механизмов дегрануляции, дефекты цитоскелета и мембран [25, 26]. Помимо гематологических заболеваний, адгезивная активность тромбоцитов бывает нарушена при целом ряде патологий. Суммируя данные других исследователей и собственный опыт, можно заключить, что достоверное снижение адгезии тромбоцитов наблюдается при острых экзогенных отравлениях, гинекологических заболеваниях, сепсисе, ДВС-синдроме, массивной кро- вопотере [2, 4, 9, 14, 28]; кроме того, нарушение адгезивной активности тромбоцитов может быть обусловлено действием применяемых в процессе лечения физических факторов, таких как искусственное кровообращение [29], воздействие КВЧ-излучения [30], гемодиализ [31]. В лабораторных условиях адгезивная активность тромбоцитов пропадает при повреждении клеточных мембран (с помощью детергентов или спиртов), при искусственном ацидозе (pH < 6,7), в условиях гипотонии и гипертонии, а также в результате фиксации клеток. Установлено, что широко используемый в криобиологии диметилсульфоксид (ДМСО) при контакте с тромбоцитами повышает проницаемость мембран этих клеток, что может вызывать деформацию вакуолярных компонентов (гранул и системы канальцев), разрушение гранул или выброс их содержимого в отсутствие стимулов к активации клетки, а также нарушение нормальной ориентации цитоскелета тромбоцитов [32]. В результате наличие ДМСО в среде с тромбоцитами при комнатной температуре постепенно снижает их адгезивную активность. Наши исследования показали, что при 5-6% ДМСО (концентрация, используемая при криоконсервировании тромбоцитов) адгезивная активность у ДМСО-устойчивых клеток начинает снижаться через 1,5 ч экспозиции, а у ДМСО-неустойчивых - уже через 10-15 мин. Это указывает на необходимость минимизации сроков контакта ДМСО с тромбоцитами в ходе их подготовки к криоконсервированию. Таким образом, нарушение адгезии тромбоцитов может быть вызвано огромным количеством факторов, что делает тромбоциты весьма уязвимыми к внешним воздействиям. Тромбоциты человека представляют собой высокодифференцированные клетки, лишенные ядра, с очень низким уровнем развития систем репарации внутриклеточных дефектов [4, 28]. По всей вероятности, неспособность тромбоцитов к восстановлению собственных структур во многом определяет малый срок жизни этих клеток - не более 8 сут в циркулирующей крови. В производственной трансфузиологии тромбоциты доноров считаются пригодными лишь в том случае, если срок их хранения не превышает 5 сут [33]. Действительно, через 5 сут хранения при комнатной температуре концентраты тромбоцитов уже не содержат адгезивно активных клеток [34]. По нашим данным, резкое снижение биологической полноценности тромбоцитов (в том числе их адгезивной активности) наступает уже на 3-и сутки хранения, поэтому для исследований предпочтительны свежевыделенные тромбоциты. Подавление адгезии тромбоцитов: вынужденная необходимость В клинической практике найдется большое количество примеров, когда адгезивная активность тромбоцитов дает не положительный эффект, а отрицательный. Чаще всего «ненужная» адгезия тромбоцитов происходит при контакте клеток циркулирующей крови с атеросклеротическими бляшками (в артериях), с измененными венозными сосудами; в головном мозге - с бляшками Альцгеймера [35]. Показано, что во всех этих случаях отмечены повышенное сродство тромбоцитов к субстрату в зоне поражения (коллаген, фибрин, бета- амилоид) и массовая адгезия тромбоцитов на его поверхности с образованием новых тромбоцитарных агрегатов, которые приводят к еще большему перекрыванию просвета сосудов. Этот процесс нередко сопровождается повышением в крови количества тромбоцитов увеличенного диаметра, округлой или овальной формы [36]. В литературе такие тромбоциты называют сфероидными и рассматривают как клетки ранней стадии активации [9, 11]. Действительно, на ранних стадиях адгезии на стекле форма тромбоцита из дисковидной становится округлой и сильно уплощенной, при этом гранулы начинают перемещаться к периферии клетки, но все еще остаются в цитоплазме. Наши исследования показывают, что в крови пациентов с тромбозами увеличено не только общее содержание больших округлых тромбоцитов, но и количество гранул в их составе [28]; судя по всему, накопление таких тромбоцитов в циркулирующей крови является результатом передачи активирующих сигналов, исходящих из области тромботического поражения. В результате в сосудах с тромбами адгезия тромбоцитов является наиболее интенсивной. Так, у пациентов с тромбозами артерий скорость адгезии и дегрануляции тромбоцитов в артериальном русле повышается в 1,5 раза по сравнению с нормой (здоровые доноры), в капиллярах соответствует норме, а в венах, наоборот, снижается [37]. Однако сигнал запуска адгезии тромбоцитов может передаваться и в обход систем гемостаза. Установлена возможность тесного контакта тромбоцитов с клетками некоторых злокачественных неоплазий, например опухолей яичника [38, 39]. В результате происходит активная адгезия и дегрануляция тромбоцитов, стимулирующие процесс пролиферации клеток и ангиогенеза внутри опухолевой ткани. Также тромбоциты обладают способностью адгезировать на различных углеродных полимерах (поливинил, полиэстер, полипропилен, полиуретан и т.д.) [40-42], металлических конструкциях [43], что создает большую проблему при стентировании и замене клапанов сердца. Для снижения адгезивной активности тромбоцитов в клинической практике существуют два подхода: 1-й - подавление адгезии тромбоцитов с помощью лекарственных препаратов, 2-й (используется при изготовлении стентов) - разработка новых материалов и покрытий, не позволяющих тромбоцитам адгезировать. К настоящему времени существует широчайший набор препаратов-антиагреган- тов для подавления активности тромбоцитов; принцип их действия чаще всего основан на подавлении / необратимом связывании со структурами тромбоцитов, передающими сигнал об активации внутрь клетки [44-46]. К ним относят блокаторы рецепторов к АДФ (клопидо- грель, прасугрель, тикагрелор), блокаторы рецепторов к фибрину и фибриногену (эптифибатид, тирофибан), блокаторы синтеза тромбоксана (аспирин). При этом клиницисты вынуждены признать, что не всегда использование препаратов-антиагрегантов реально снижает активность тромбоцитов, в том числе адгезивную. Этот эффект связывают с наличием у тромбоцитов некоторых пациентов так называемой резистентности к анти- агрегантам [47, 48]. Доля людей, у которых тромбоциты обладают резистентностью к препарату клопидогрелю (золотой стандарт антиагреганта), по разным данным, варьирует от 4 до 40% [48]; во многом это связано с отсутствием стандартизированного подхода к оценке резистентности тромбоцитов, что не позволяет достоверно определить пороговое значение их активности (адгезивной или агрегационной), превышение которого означает резистентность этих клеток к антиагреганту. Наши исследования показывают, что под действием препарата клопидогреля через 1 сут после приема лекарственной дозы (время максимальной эффективности препарата) адгезивная активность тромбоцитов у пациентов с острым коронарным синдромом снижалась в среднем в 2,5 раза, варьируя при этом в интервале от 1,5 до 9 раз. Исследование антиагреганта прямого действия (тикагрелор) in vitro показало, что у 75-80% доноров крови и кардиохирургических пациентов адгезивная активность тромбоцитов в присутствии тикагрелора снижалась на 90-100% (высокая чувствительность), у 15-20% - на 10-50% (средняя/сниженная чувствительность), у 3- 5% - на 5-40% (низкая чувствительность) [49]. Таким образом, действие антиагрегантов нередко носит индивидуальный характер и не всегда может эффективно снизить адгезивную активность тромбоцитов. Кроме того, необходимо учитывать, что чрезмерное подавление адгезии тромбоцитов может вызвать развитие геморрагических осложнений. Поэтому весьма актуальной задачей является разработка стентов и других имплантатов с покрытием, препятствующим адгезии тромбоцитов. При этом возможны различные подходы. Так, в работах с имплантатами на основе органических полимеров показано, что наличие у них отрицательно заряженного поверхностного слоя предотвращает массовую адгезию тромбоцитов благодаря электростатическому отталкиванию. Для создания поверхностного заряда в составе биоорганических имплантатов используют полиэтилен- гликоль, перфтордекалин, гексаноил, сульфатированные полисахариды [50-52]. Эти компоненты рекомендуют использовать в комбинации с олигомерами декстрана, которые имитируют гликокаликс неповрежденных клеток, что создает дополнительное препятствие к адгезии тромбоцитов на биополимерах [15, 51]. Напротив, в имплантатах с неорганической структурой (на основе карбона или металлов) рекомендуется максимально повысить уровень гладкости покрытия, поскольку наличие микрорельфа является аттрактивным фактором для тромбоцитов и запуска их адгезии [53-55]. Следовательно, проявление адгезивной активности тромбоцитов на поверхности имплантатов сильно зависит от структурных характеристик данного изделия. Использование адгезивных свойств тромбоцитов в разработке биотрансплантатов Способность тромбоцитов к адгезии на различных биополимерах может быть использована при разработке трансплантатов, насыщенных факторами роста. На сегодняшний день описано применение в качестве ранозаживляющего средства богатой тромбоцитами плазмы и тромбоцитарного лизата (материал из разрушенных тромбоцитов) [56, 57], однако не всегда такой подход приводит к явному клиническому эффекту. Использование компонентов тромбоцитов, не закрепленных на субстрате, связано с риском потери, вымывания или разрушения выделенных тромбоцитами ростостимулирующих факторов и других биологически активных веществ. Поэтому выгоднее использовать компоненты тромбоцитов, закрепленные на носителе или в составе твердой фракции. Справедливо предположить, что для насыщения тромбоцитами пригодны матриксы на основе коллагена человека. Наши исследования показывают, что биологически полноценные тромбоциты (клетки с гранулами) активно адгезируют на коллагеновых пленках и повязках, дермальном матриксе (полученном путем удаления из кожи человека клеточных компонентов), коллагеновом геле, в меньшей степени - на трансплантатах на основе перикарда и практически не адгезируют на поверхности твердой мозговой оболочки и губчатой деминерализованной кости. Среди биополимерных конструкций, полученных искусственным путем, высокую адгезивную активность тромбоцитов стимулируют пленки на основе гиалуроновой кислоты и хитозана [58]. Напротив, соединения альгината, широко используемые в биологии, не вызывают адгезии тромбоцитов; нами установлено, что оседание тромбоцитов наблюдается лишь при наличии в составе альгинатных трансплантатов ионов Ca2+, вызывающего формирование тромбофибринового сгустка. В отсутствие Ca2+, а также в бесплазменной среде адгезивная активность тромбоцитов на поверхности альгинатных изделий полностью отсутствует, т.е. альгинатные трансплантаты нельзя обогатить компонентами тромбоцитов путем адгезии самих клеток. Среди неорганических материалов стоит особо выделить изделия из биоактивного стекла, которые в настоящее время рассматривают как один из аналогов костного матрикса в остеопластике [59]; такие трансплантаты имеют вид трехмерных пористых структур, на которых активно адгезируют тромбоциты. При этом независимо от типа адгезивного субстрата необходимо помнить, что адгезия тромбоцитов запускает процесс внутренней активации, который в конечном счете приводит к дегрануляции клеток. Следовательно, тактика дальнейшей обработки трансплантата с тромбоцитами может быть различной. Если насыщение тромбоцитами используется для стимуляции пролиферации культивируемых клеток в составе трансплантата, то подавления дегрануляции тромбоцитов не требуется; если же трансплантат предназначен для непосредственного использования в клинической практике, тогда обоснованным будет затормозить процесс выброса гранул тромбоцитов с целью более долгого сохранения их биологически активных веществ в составе трансплантата. Насыщение тромбоцитами коллагеновых и других матриксов может существенно повысить репаративный эффект этих изделий, значительно ускорить процесс ранозаживления. Кроме того, адгезивная активность тромбоцитов на органических полимерах может быть полезной при разработке новых биоинженерных конструкций вплоть до создания искусственных полноценных тканей и органов.